專題2-微生物培養(yǎng)與應(yīng)用(用)

專題2

微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物的概念與分類概念：個體多數(shù)十分微小，結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到的低等生物。特點?。▊€體微?。┖啠ńY(jié)構(gòu)簡單）低（進化地位低）微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌、霉菌單細胞的動植物如草履蟲、單細胞藻類等微生物包含了除植物界和動物界以外的所有生物無細胞結(jié)構(gòu)真核細胞細菌、藍藻等原核細胞課題1微生物的實驗室培養(yǎng)

防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應(yīng)用微生物的前提。一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保其他微生物無法混入。一、基礎(chǔ)知識：（一）培養(yǎng)基

（二）無菌技術(shù)（一）培養(yǎng)基

人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。按物理狀態(tài)分2.類型1.概念：液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基（加入凝固劑瓊脂）固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基一般用于增菌（擴大培養(yǎng)）、工業(yè)生產(chǎn)一般用于分離純化、鑒定、計數(shù)菌落由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體按功能狀態(tài)分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類用途例選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基從眾多微生物中分離所需的微生物鑒別不同種類的微生物加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌伊紅—美籃培養(yǎng)基使大腸桿菌的菌落呈深紫色，可以鑒別大腸桿菌幾種選擇培養(yǎng)基：加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物3.營養(yǎng)成分：不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。討論：為什么大多數(shù)培養(yǎng)基都含有這四類物質(zhì)？？（1）基本成分：碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等1000mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基組分提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5.0g碳源、氮源、磷酸鹽和維生素蛋白胨10.0g氮源和維生素NaCl5.0g無機鹽H2O

定容至1000ml氫元素、氧元素（2）特殊營養(yǎng)：細菌生長必需，而往往自身不能合成的化合物，如維生素、某些氨基酸、堿基等（3）pH、氧氣等要求1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。（1）對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。（4）實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。定義方法2.消毒與滅菌較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線消毒滅菌灼燒滅菌干熱滅菌高壓蒸汽滅菌芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌。放線菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體。孢子煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或

80℃下煮15min化學(xué)藥劑消毒法:用70%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源紫外線消毒消毒的方法：干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.灼燒滅菌滅菌的方法：1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。旁欄思考2、請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手滅菌

高壓蒸氣滅菌滅菌高壓蒸氣滅菌/干熱滅菌消毒旁欄思考微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存二、實驗操作準(zhǔn)備工作（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）1．計算2．稱量3．溶化4．調(diào)pH5．滅菌6．倒平板配制步驟：倒平板技術(shù)倒平板技術(shù)1.將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。1234倒平板技術(shù)2.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。1234倒平板技術(shù)12343.用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10~

20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。倒平板技術(shù)12344.等待平板冷卻凝固，大約需5~10min。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。

1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。（二）純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法稀釋涂布平板法平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。微生物的接種技術(shù)1、平板劃線法一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。平板劃線的操作方法問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時,仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：第一步灼燒是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？問題討論答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？問題討論答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。2、稀釋涂布平板法將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。稀釋涂布平板法梯度稀釋菌液分別（依次）涂布平板

1.將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按101~106的順序編號。梯度稀釋菌液注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時，試管口和移液管離火焰1~2cm處.涂布平板涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。問題討論微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)菌種的保存1.臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2.長期保存：甘油冷凍管藏法四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小