菌種的退化與保藏

關(guān)于菌種的退化與保藏第一節(jié)菌種退化及防治第二節(jié)菌種保藏第三節(jié)菌種保藏機(jī)構(gòu)第2頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

菌種是各個(gè)國(guó)家的重要自然資源，尤其是優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌種是有野生型菌種經(jīng)過誘變育種、雜交育種、代謝工程等育種方法篩選得到的，其獲得非常不容易，往往要花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間和大量的人力、物力。但微生物菌種在傳代繁殖和保藏過程中會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象。所以，在科研和生產(chǎn)中應(yīng)該設(shè)法減少菌種的退化和死亡。菌種保藏是一項(xiàng)重要的工業(yè)微生物學(xué)基礎(chǔ)工作，其目的是保證菌種經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間保藏后仍然保持較強(qiáng)的生活力，不被其他雜菌污染，且形態(tài)特征和生理性狀盡可能不發(fā)生變異，以便今后長(zhǎng)期使用。第3頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)菌種的退化及防治一、菌種退化所謂菌種退化是指生產(chǎn)菌種和優(yōu)良菌種由于傳代或保藏之后，群體中的某些生理特征或形態(tài)特征逐漸減退或消失，如生產(chǎn)菌株生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失、典型性狀變得不典型等。菌種退化是一個(gè)有量變到質(zhì)變的逐漸的演化過程。開始時(shí)，在微生物群體中僅出現(xiàn)個(gè)別負(fù)變細(xì)胞，隨著連續(xù)傳代，負(fù)變細(xì)胞開始增加，最后在群體中占了優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致產(chǎn)量下降和優(yōu)良性狀喪失。二、菌種退化的原因1.基因突變是引起菌種退化的主要原因微生物在移種傳代過程中會(huì)發(fā)生自發(fā)突變，這些突變包括高產(chǎn)菌株的回復(fù)突變和新的負(fù)變菌株，它們都是低產(chǎn)菌株。開始時(shí)，這些突變菌株在群體所占的比例很小，但由于這些低產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)速率往往大于高產(chǎn)菌株，所以經(jīng)過傳代后，它們?cè)谌后w中的數(shù)量逐漸增多，直至占優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為退化現(xiàn)象。第4頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在育種過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)初篩時(shí)產(chǎn)量很高，而復(fù)篩時(shí)產(chǎn)量又下降了的情況。這其實(shí)也是一種退化現(xiàn)象，氣主要原因是由表型延遲造成的。一般突變都發(fā)生在DNA的單股鏈上的某個(gè)位點(diǎn)，經(jīng)過DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，一個(gè)細(xì)胞為突變細(xì)胞，另一個(gè)細(xì)胞為正常細(xì)胞。經(jīng)過傳代繁殖，正常細(xì)胞由于成長(zhǎng)速率比高產(chǎn)菌株快，因此，在數(shù)量上占了優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致了產(chǎn)量的下降。某些絲狀菌的生活史中只有菌絲體不產(chǎn)生孢子，其菌絲為多核細(xì)胞，如果這些菌絲體在誘變過程中僅有一個(gè)核發(fā)生高產(chǎn)基因突變，那么，經(jīng)過幾代繁殖后將會(huì)出現(xiàn)分離現(xiàn)象，導(dǎo)致性狀退化。如果突變后產(chǎn)生的后代是非整倍體或部分二倍體，在繁殖過程中也會(huì)發(fā)生性狀分離，出現(xiàn)低產(chǎn)細(xì)胞，導(dǎo)致退化。除了核基因突變外，某些控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或核DNA與質(zhì)粒DNA復(fù)制不一致（如質(zhì)粒DNA的復(fù)制速度比核DNA低）也會(huì)導(dǎo)致菌種退化。第5頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.連續(xù)傳代是加速菌種退化的直接原因微生物自發(fā)突變都是通過繁殖傳代發(fā)生的，移種代數(shù)越多，發(fā)生突變的概率就越高。另外，基因突變?cè)陂_始僅發(fā)生在個(gè)別細(xì)胞，如果不傳代，個(gè)別低產(chǎn)細(xì)胞不會(huì)影響群體的表型。只有通過傳代繁殖后，低產(chǎn)細(xì)胞才能在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，使群體表型發(fā)生變化，即導(dǎo)致菌種退化。3.培養(yǎng)條件和保藏條件可以從多個(gè)方面影響菌種的性狀1）不同的環(huán)境條件可以誘發(fā)不同功能的基因顯性生物體的顯性和隱性是相對(duì)的，它們可以隨著環(huán)境條件的改變而變化。一個(gè)優(yōu)良菌株在不良的培養(yǎng)條件或保藏條件下，其高產(chǎn)性狀也會(huì)變成隱性性狀，即高產(chǎn)特征不會(huì)表現(xiàn)出來(lái)。第6頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基會(huì)影響不同類型細(xì)胞和細(xì)胞核的數(shù)量。這是由于不同培養(yǎng)基會(huì)影響群體細(xì)胞中高產(chǎn)突變細(xì)胞和低產(chǎn)野生型細(xì)胞是生長(zhǎng)速度，從而使高產(chǎn)成本細(xì)胞和低產(chǎn)細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生變化。對(duì)絲狀微生物來(lái)說，不同的培養(yǎng)基也會(huì)使不同的類型的細(xì)胞核的數(shù)量發(fā)生變化。培養(yǎng)基也會(huì)影響菌種的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征。同一菌種在不同培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)不同的菌落形態(tài)，例如含高氨培養(yǎng)基不利于放線菌產(chǎn)生菌絲和孢子的形成。3）培養(yǎng)條件的影響除了培養(yǎng)基外，培養(yǎng)條件如溫度、濕度、PH值、O2等也會(huì)影響菌種的退化，尤其是高溫對(duì)菌種非常不利，這可能與高溫容易使某些酶失活和容易引起質(zhì)粒脫落有關(guān)。4）保藏條件不良的保藏條件也會(huì)引起菌種退化。保藏條件要求絕氧、干燥、低溫。第7頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、菌種退化的防治遺傳是相對(duì)的，變異是絕對(duì)的，所以菌種退化是不可避免的。因此，要求積極采取措施防止菌種退化。為了防止菌種退化，需要采取以下措施1.盡量減少傳代連續(xù)傳代是加速菌種退化的直接原因。因此要防止菌種退化，首先要減少傳代次數(shù)。要盡量避免不必要的傳代，并將必要的傳代降低到最低限度。2.用單核細(xì)胞和單菌落移種傳代放線菌和霉菌的菌絲細(xì)胞是多核的，其中也可能異核體或部分二倍體，所以，用菌絲接種、傳代易產(chǎn)生分離現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致菌種退化。因此，要用單核的孢子進(jìn)行移種，最好選用單菌落的孢子進(jìn)行傳代，因?yàn)閱尉涫怯蓡蝹€(gè)孢子發(fā)育而形成的，其遺傳特征一致，不會(huì)發(fā)生分離現(xiàn)象第8頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.經(jīng)常進(jìn)行菌種純化所謂菌種純化就是對(duì)菌種進(jìn)行自然分離。首先將菌種制成單細(xì)胞或單孢子懸浮液，經(jīng)稀釋后將其涂布與瓊脂平板上培養(yǎng)，待平板上單菌落培養(yǎng)成熟后挑取單菌落移種斜面，再經(jīng)搖瓶試驗(yàn)后測(cè)定其生產(chǎn)能力，從中選出高水平的菌種。4.采用良好的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以從多方面影響菌種的性狀，因此，為了防止菌種退化，要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。5.采用科學(xué)的保藏方法在菌種保藏過程中也會(huì)發(fā)生菌種退化現(xiàn)象，尤其是不良的保藏條件更易引起菌種退化。因此，要采取科學(xué)和有效的菌種保藏方法以防止菌種優(yōu)良性狀的退化。第9頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、菌種復(fù)壯菌種退化是不可避免的，如果生產(chǎn)菌種已經(jīng)退化，那么我們要及時(shí)對(duì)已退化的菌種進(jìn)行復(fù)壯，使優(yōu)良性狀得以恢復(fù)。從菌種退化的演化過程看，開始時(shí)所謂純的菌株其實(shí)已包含了很少的衰退的細(xì)胞，到菌種退化時(shí)，雖然群體中大部分是衰退細(xì)胞，但仍有少數(shù)尚未衰退的細(xì)胞存在。因此，可以通過自然分離的方法將那些尚未衰退的細(xì)胞從群體中分離出來(lái)，使菌種的優(yōu)良性狀得以恢復(fù)。這就是所謂的菌種復(fù)壯。這種在菌種已退化的情況下通過自然分離的方法將少數(shù)尚未衰退的個(gè)體從退化的群體中分離出來(lái)以回復(fù)菌種原有優(yōu)良性狀的復(fù)壯，是一種消極的措施。積極的措施應(yīng)該是在菌種的生產(chǎn)能力尚未退化前，經(jīng)常進(jìn)行自然分離，以保持菌種的生產(chǎn)性能穩(wěn)定，同時(shí)也有可能使菌種的生產(chǎn)性能得到進(jìn)一步的改進(jìn)或提高。第10頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)菌種保藏

菌種是一個(gè)企業(yè)乃至一個(gè)國(guó)家的重要生物資源，尤其是優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌種更是一個(gè)國(guó)家的重要財(cái)富，而科學(xué)的、有效的菌種保藏方法是防止菌種退化的必要措施，因此，研究和選擇良好的菌種保藏方法具有重要意義。菌種保藏要求不受雜菌污染，是退化和死亡降低到最低限度。從而保持純種和優(yōu)良性能。菌種保藏的基本原理是抑制雜菌的代謝活動(dòng)，使菌種處于休眠狀態(tài)、停止繁殖，以減少菌種的變異。為此，一個(gè)良好的保藏方法就要為菌種創(chuàng)造一個(gè)適合其長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件，如干燥、低溫、缺氧。缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑等。常用的菌種保藏方法有斜面保藏法。液體石蠟保藏法、砂土保藏法、麩皮保藏法、冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、液氮超低溫保藏法等。第11頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、斜面保藏法斜面保藏法是將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后置于4℃冰箱保藏。斜面保藏法是一種短期的菌種保藏方法，廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌和絲狀真菌。影響斜面保藏法的因素很多，歸納起來(lái)，主要有保藏培養(yǎng)基和保藏條件兩個(gè)方面。保藏培養(yǎng)基一般要求營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)貧乏些，氮資源略高而碳資源較低，以減少PH值下降。放線菌和霉菌以適當(dāng)控制菌體生長(zhǎng)而有利于孢子的形成為原則；采用貧乏和豐富培養(yǎng)基交替培養(yǎng)進(jìn)行菌種保藏，有利于延緩菌種衰退。保藏條件要求溫度控制在4℃左右；每1～3月移接一次；傳代次數(shù)不超過3～4次。第12頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

斜面保藏的缺點(diǎn)是斜面在保藏期間菌種的生長(zhǎng)繁殖沒有完全停止，存在自發(fā)突變的可能；在斜面轉(zhuǎn)接過程中，易發(fā)生退化、污染；斜面在保藏期間，培養(yǎng)基中的水分易蒸發(fā)，導(dǎo)致滲透壓增大，引起菌種衰退、死亡。用斜面保藏發(fā)保藏菌種時(shí)，在斜面培養(yǎng)結(jié)束后，用無(wú)菌的橡皮塞代替棉塞，可以避免水分散發(fā)并且能隔氧，能適當(dāng)延長(zhǎng)菌種的保藏期。二、液體石蠟保藏法液體石蠟保藏法是直接將液體石蠟加入到生長(zhǎng)好的菌種斜面上，然后將其放入4℃冰箱保藏，如圖11-1所示。液體石蠟保藏法其實(shí)也是一種斜面保藏法，其優(yōu)點(diǎn)是在斜面上加入了石蠟油，在保藏期間可以防止水分蒸發(fā)，并隔絕氧氣，所以，能延長(zhǎng)保藏的時(shí)間。液體石蠟保藏法的缺點(diǎn)是必須直立放在冰箱內(nèi)，占據(jù)較大的空間。第13頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天液體石蠟保藏法的應(yīng)用較廣，特別適用于固體培養(yǎng)基上不能形成孢子的絲狀擔(dān)子菌，但不適合以石蠟為碳源或?qū)κ灻舾械木N三、干燥保藏法不少微生物能產(chǎn)生孢子或芽孢，孢子或芽孢處于休眠狀態(tài)。在干燥環(huán)境中抵抗力強(qiáng)不會(huì)死亡。依據(jù)這一原理，可以把孢子或芽孢接種到適宜的載體上，人為地創(chuàng)造一個(gè)干燥的環(huán)境來(lái)保藏菌種?？梢宰鳛榫N干燥保藏的載體有砂土、濾紙、硅膠、麩皮等。干燥保藏法是將接有孢子或芽孢的載體經(jīng)真空干燥置于低溫下保藏。1.砂土管保藏法此法使微生物吸附在砂土上進(jìn)行保藏，砂土保藏法包括制備砂土和埋砂土兩個(gè)步驟第14頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）砂土制備取黃沙，加入10%鹽酸浸泡24h，傾去溶液，用自來(lái)水沖洗至中性，烘干，60目過篩，再用磁鐵除去黃沙中的鐵質(zhì)。另取未被污染的瘠薄的地表以下的土，用自來(lái)水浸泡沖洗至中性,烘干,碾細(xì),過120目篩.將以上經(jīng)過處理的砂和土以1:1或3:2的比例混合均勻,分裝入小試管內(nèi),加上棉塞并包扎牛皮紙,與121℃間歇滅菌三次，每次滅菌時(shí)間為1h。第15頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）埋砂土埋砂土的方法可以分為濕埋法、干埋法。濕埋法是取培養(yǎng)好的新鮮斜面，加入適量無(wú)菌水，輕輕刮下孢子，制成孢子懸浮液，再向每支砂土管中加入0.2mL孢子懸浮液，攪拌均勻，然后抽真空干燥4h左右，最后把制備好的砂土管放入干燥器內(nèi)，置于冰箱低溫保存。干埋法是直接從培養(yǎng)好的新鮮斜面上刮下孢子，加入到每支砂土管中，混勻，然后抽真空干燥42h左右，把制備好的砂土管放入干燥器內(nèi)，置于冰箱低溫保存。砂土管保藏法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，使用方便，可反復(fù)多次使用，其缺點(diǎn)是微生物的新陳代謝沒有完全停止，易引起菌種退化變異。砂土管保藏法適合于產(chǎn)分生孢子的霉菌、放線菌以及產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，但不適于擔(dān)子菌類、只靠菌絲繁殖的真菌、無(wú)芽孢的細(xì)菌、酵母等。第16頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.麩皮保藏法將麩皮與水或其他培養(yǎng)基成分以一定的比例拌勻，水或培養(yǎng)液與麩皮的比例為1：（0.8～1.5），具體按照不同菌種對(duì)水分的要求不同而定。再將拌勻的麩皮分裝在試管或安瓿管等容器中，并進(jìn)行高溫滅菌，裝入的麩皮應(yīng)保持疏松。然后將菌種的孢子液接入，混勻，并在適宜的溫度下培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌絲。最后將培養(yǎng)好的試管或安瓿管放在干燥器中干燥，干燥結(jié)束后置于冰箱冷藏室保藏。麩皮保藏法操作簡(jiǎn)單，菌種保藏時(shí)間長(zhǎng)，不易退化，適合于產(chǎn)孢子的霉菌或放線菌。第17頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法是將菌液在凍結(jié)狀態(tài)下升華其水分，最后獲得干燥的菌體樣品。該法同時(shí)具備干燥、低溫和缺氧的三個(gè)菌種保藏條件，具有變異少、保存時(shí)間長(zhǎng)、輸送和儲(chǔ)存方便等優(yōu)點(diǎn)，是目前菌種保藏的較好方法之一，該法應(yīng)用范圍廣，適合于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母菌等，但不適合于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。冷凍干燥保藏法的操作流程見圖11-2。將安瓿管洗凈，再用2%的鹽酸浸泡10h左右，用自來(lái)水沖洗干凈，烘干，塞上棉塞，滅菌后備用。取培養(yǎng)成熟的新鮮斜面，加入適量已滅菌的脫脂牛奶，輕輕刮下菌體或孢子制成菌懸液，盡可能不帶培養(yǎng)基。用滅菌過的長(zhǎng)形滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)，塞上棉塞，置于低溫冰箱中預(yù)凍2h左右。第18頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天將安瓿管放入冷凍干燥機(jī)中抽真空4h左右。整個(gè)干燥過程，先是升華干燥，然后蒸發(fā)除去水分。干燥結(jié)束后，在真空下進(jìn)行熔封（圖11-3）。安瓿管密封后以高頻電火花檢查安瓿管的真空情況，管內(nèi)呈灰藍(lán)色逛表示已達(dá)真空。檢查是電火花應(yīng)射向安瓿的上半部，切勿直射樣品。制成的安瓿管置于4℃冰箱或室溫下保藏。第19頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天安瓿管菌種配制保護(hù)劑

酸洗、水洗培養(yǎng)分裝

烘干制備菌懸液滅菌

滅菌分裝安瓿管

預(yù)凍

真空干燥

裝在歧管上抽真空

火焰上熔封安瓿管口

檢測(cè)真空

保藏圖11-2冷凍干燥保藏法的操作流程第20頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天由于在冷凍干燥過程中和保藏期間細(xì)胞容易損傷和死亡，所以需要加入保護(hù)劑。通常用脫脂牛奶做保護(hù)劑，其制備方法如下：取新鮮牛奶，離心去除脂肪，再裝入已滅菌過的試管或三角瓶中，進(jìn)行高壓滅菌（常采用115℃滅菌15min）。脫脂牛奶也可用脫脂奶粉來(lái)制備，用蒸餾水制成10%或20%濃度后，分裝滅菌。在冷凍干燥的過程中微生物細(xì)胞損傷的主要原因在于冰晶形成、鹽濃度變化、細(xì)胞膜通透性變化和代謝作用損傷，冷凍干燥還可造成細(xì)胞內(nèi)核酸的損傷而誘導(dǎo)突變體的產(chǎn)生。保護(hù)劑的作用是使細(xì)胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少保藏過程中的死亡；作為支持物，和受體在復(fù)水過程中為干物質(zhì)提供一定的股價(jià)結(jié)構(gòu)，防止復(fù)水時(shí)引起的死亡，并使菌體容易從休眠狀態(tài)恢復(fù)為生長(zhǎng)狀態(tài)。第21頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天在冷凍干燥過程中預(yù)凍的目的是使水分在真空干燥是直接由冰晶升華為水蒸氣。預(yù)凍一定要徹底，否則，干燥過程中有一部分冰會(huì)融化而產(chǎn)生泡沫或氧化等副作用，或使干燥后不能形成易溶的多孔狀菌塊，而變成不易溶解的干膜狀菌體。預(yù)凍的溫度和時(shí)間很重要，預(yù)凍溫度一般應(yīng)在-30℃以下，在0～-10℃范圍內(nèi)凍結(jié)，所形成的冰晶顆粒較大，易造成細(xì)胞損傷；在-30℃下凍結(jié)，冰晶顆粒細(xì)小，對(duì)細(xì)胞損傷小。冷凍干燥法保藏的菌種，使用時(shí)可在無(wú)菌環(huán)境下開啟安瓿管進(jìn)行復(fù)水培養(yǎng)。可用銼刀在安瓿上部挫一道痕跡，再用燒熱的玻棒置痕跡處，安瓿壁即出現(xiàn)裂紋。也可將安瓿上部置酒精燈上燒熱，用冷的無(wú)菌水或培養(yǎng)基滴在痕跡處使其崩裂而打開安瓿管。將無(wú)菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，溶解干燥的樣品酥丸，搖勻，用無(wú)菌吸管取出懸液并移入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第22頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天冷凍干燥法保藏菌種的存活率受到多方面的影響：不同的生物承受冷凍干燥處理過程的能力不同，所以少數(shù)菌種不適合用冷凍干燥法保藏；菌種的培養(yǎng)條件和菌齡也是影響因素，適宜條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期的細(xì)胞和成熟的孢子具有較強(qiáng)的耐受冷凍干燥的能力；保護(hù)劑對(duì)存活率的影響很大，保護(hù)效果與保護(hù)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系，有效的保護(hù)劑應(yīng)對(duì)細(xì)胞和水有很強(qiáng)的親和力，脫脂牛奶作為保護(hù)劑對(duì)多種微生物均有滿意的結(jié)果；凍結(jié)速度慢會(huì)損壞細(xì)胞，而凍結(jié)速度過快（幾秒鐘內(nèi)完成凍結(jié)）也會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，損害細(xì)胞膜，影響存活率；干燥樣品中殘留少量水分（0.9%～2.5%）對(duì)生物的生存有利；凍干管應(yīng)避光保藏，尤其要避免直射光；適宜的恢復(fù)培養(yǎng)條件可以提高存活率。

第23頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、低溫保藏法死亡保藏法是將孢子或菌絲懸于保護(hù)劑（甘油或牛奶）后，直接置于低溫冰箱（-25℃以下）中保存。此法簡(jiǎn)便有效，對(duì)微生物損傷較小，適用于各種類型的微生物。其缺點(diǎn)是由于斷電或機(jī)械故障可使菌種融化而死亡。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，常將待保藏菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)液直接加到已滅過菌的甘油中，并使甘油的終濃度在10%～20%，再分裝于小試管中，置低溫冷凍保藏?；蚬こ叹渤２捎迷摲ū２?。第24頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法是以甘油或二甲亞砜為保護(hù)劑，將菌種直接放入液氮瓶中超低溫（-196℃）保藏。此法是防止菌種退化的最好辦法，適合于各種微生物的菌種保藏。由于微生物在-130℃以下新陳代謝處于停止，在此溫度下，微生物處于休眠狀態(tài)，可減少死亡或變異。因此，液氮超低溫保藏法的保存時(shí)間長(zhǎng)，死亡率低，變異少，活性穩(wěn)定，甚至菌種不需再次分離，即可直接用于生產(chǎn)。液氮超低溫保藏過程是將菌種懸浮液封存于圓底安瓿管或塑料的液氮保藏管（材料應(yīng)能耐受較大溫差驟然變化）內(nèi)，放到-150～-196℃的液氮罐或液氮冰箱內(nèi)保藏。在操作過程中的以大原則是“慢凍快溶”。第25頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞冷凍損傷注意是細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰和細(xì)胞脫水造成的物理傷害。當(dāng)細(xì)胞冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外均會(huì)形成冰晶，其凍結(jié)的情況因冷凍的速度而異。冷凍速度緩慢時(shí)，只有細(xì)胞外形成冰晶，細(xì)胞內(nèi)不結(jié)冰，此現(xiàn)象稱為細(xì)胞外凍結(jié)。當(dāng)冷凍速度較快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外均形成冰晶，稱為細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)。細(xì)胞緩慢冷凍時(shí)，主要發(fā)生細(xì)胞脫水現(xiàn)象。細(xì)胞大量脫水后電解質(zhì)濃度升高，以致滲透壓發(fā)生變化而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)壁分離。輕度的質(zhì)壁分離損傷是可逆的，當(dāng)脫水嚴(yán)重是，細(xì)胞內(nèi)有的蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞成分的結(jié)冰水也被排出，發(fā)生永久性損傷，導(dǎo)致死亡。細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，特別是大的冰晶，會(huì)造成細(xì)胞膜損傷而使細(xì)胞死亡。第26頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

對(duì)于抗凍性強(qiáng)的微生物，細(xì)胞外凍結(jié)幾乎不會(huì)使細(xì)胞受損傷，而對(duì)于多數(shù)細(xì)胞來(lái)說，不論細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)均易受到損傷。為了減輕冷凍損傷程度，需要加入保護(hù)劑。液氮保藏一般選用滲透性強(qiáng)的保護(hù)劑。如甘油和二甲亞砜。它們能迅速透過細(xì)胞膜，吸住水分子，保護(hù)細(xì)胞不致大量失水，延遲或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞膜成分的變性并使冰點(diǎn)下降。通常將菌種懸浮在10%的甘油或10%二甲亞砜的保護(hù)劑中，孢子或菌體懸液的濃度應(yīng)大于108個(gè)／mL。細(xì)胞的凍傷隨細(xì)胞的表面積大小、細(xì)胞壁厚薄和細(xì)胞濃度而異，因而要根據(jù)所保藏的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)降溫曲線。一般采用程序降溫的方法，即由室溫開始以每分鐘下降1～7℃的速度降至-40℃，然后，再快速降至-150℃或-196℃。程序降溫法可減輕細(xì)胞的凍傷程度。對(duì)一些細(xì)胞壁薄的微生物，特別是無(wú)細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，降溫的速度影響很大。第27頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物細(xì)胞的濃度對(duì)冷凍損傷程度也有影響。如去甲萬(wàn)古霉素生產(chǎn)用菌用液氮保藏時(shí)，孢子濃度大于107個(gè)／mL的存活率比105個(gè)／mL孢子濃度時(shí)高15倍以上。菌體的生長(zhǎng)階段對(duì)液氮保藏的效果也有影響。不同生理狀態(tài)的微生物對(duì)冷凍損傷的抗性不同。一般來(lái)說，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體對(duì)冷凍損傷的抗性低于穩(wěn)定期的菌體。細(xì)胞解凍的速度對(duì)冷凍損傷的影響也很大。因?yàn)?，緩慢解凍?huì)使細(xì)胞內(nèi)再生冰晶或冰晶的形態(tài)發(fā)生變化而損傷細(xì)胞，所以，一般采取快速解凍。在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，將保藏管從液氮中取出后，立即放到37℃左右的水浴中解凍。液氮超低溫保藏管應(yīng)嚴(yán)格密封。若有液氮滲入管內(nèi)，在從液氮容器中取出時(shí)，管中液氮的體積將膨脹680倍，具很強(qiáng)的爆炸力，必須特別小心。因?yàn)橐旱菀诐B透逃逸，所以，需要經(jīng)常補(bǔ)充液氮。第28頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)菌種保藏機(jī)構(gòu)

菌種是一個(gè)國(guó)家的重要生物資源，國(guó)際上許多國(guó)家都設(shè)立了專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)。菌種保藏機(jī)構(gòu)的認(rèn)為是廣泛收集各種微生物菌種，并把它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂和便于交換使用的目的。國(guó)際上很多國(guó)家都設(shè)立菌種保藏機(jī)構(gòu)。例如：中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(CCCCM)，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(ATCC)，美國(guó)的北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NRRL)，英國(guó)的國(guó)家典型菌種保藏所(NCTC)，日本的大阪發(fā)酵研究所(IFO)，東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IAM)，荷蘭的真菌中心收藏所(CBS)，法國(guó)的里昂巴斯德研究所(IPL)，及德國(guó)的科赫研究所(RKI)等。第29頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)成立于1979年，其認(rèn)為是促進(jìn)我國(guó)微生物菌種保藏的合作、協(xié)調(diào)與發(fā)展,以便更好地利用微生物資源,為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)建設(shè)、科學(xué)研究和教育事業(yè)服務(wù)。該委員會(huì)下設(shè)六個(gè)菌種保藏管理中心,其負(fù)責(zé)單位、代號(hào)和菌種保藏的性質(zhì)如下。①普通微生物菌種