《I基因文庫(kù)與篩選》課件

南京林業(yè)大學(xué)1整理ppt南京林業(yè)大學(xué)1整理ppt對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。2整理ppt對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫(kù)，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。3整理ppt為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功目的基因：已知基因：未知基因：構(gòu)建基因文庫(kù)特定探針的制備文庫(kù)的篩選（篩庫(kù)）含目的基因的克隆4整理ppt目的基因：4整理ppt南京林業(yè)大學(xué)5整理ppt南京林業(yè)大學(xué)5整理ppt南京林業(yè)大學(xué)6整理ppt南京林業(yè)大學(xué)6整理ppt南京林業(yè)大學(xué)7整理ppt南京林業(yè)大學(xué)7整理ppt南京林業(yè)大學(xué)8整理ppt南京林業(yè)大學(xué)8整理ppt基因文庫(kù)的好壞要看該文庫(kù)是否覆蓋起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作喪失其中的基因或某些序列。構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，一個(gè)最重要的指標(biāo)就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆蓋所有原初序列(代表性文庫(kù))?如果某些序列如缺少限制性酶切位點(diǎn)的重復(fù)序列未被克隆，這樣的文庫(kù)就不具代表。同樣如果文庫(kù)中未能含有足量的克隆，則極有可能會(huì)丟失某些基因。富含某種序列的cDNA文庫(kù)顯然會(huì)缺少其他一些基因，但若正確制備并擴(kuò)增，也可以成為富含mRNA起始材料的具代表性的文庫(kù)。具有代表性的基因組文庫(kù)9整理ppt基因文庫(kù)的好壞要看該文庫(kù)是否覆蓋起始材料的全部基因或序列而未南京林業(yè)大學(xué)只有當(dāng)此文庫(kù)中重組子總數(shù)達(dá)到某一值時(shí)，才能包含基因組中所有基因，才可稱之為完整基因組文庫(kù)。所需重組子數(shù)目主要取決于基因組的大小和目的基因片段的大小。1975年，Clarke和Carbon提出了一個(gè)計(jì)算這一重組子數(shù)目的公式。10整理ppt南京林業(yè)大學(xué)只有當(dāng)此文庫(kù)中重組子總數(shù)達(dá)到某一值時(shí)，才能包含基N=ln(1-P)/ln(1-f)N為所需的重組子的數(shù)目；f為單個(gè)重組體中插入片段平均大小與基因組DNA總量之比；P為選出某一基因的概率(通常期望為99%)。11整理pptN=ln(1-P)/ln(1-f)N為所需的重組子的數(shù)目；南京林業(yè)大學(xué)12整理ppt南京林業(yè)大學(xué)12整理ppt13整理ppt13整理ppt14整理ppt14整理ppt15整理ppt15整理ppt南京林業(yè)大學(xué)16整理ppt南京林業(yè)大學(xué)16整理pptI1-4載體

對(duì)于某一特定的基因組，構(gòu)成其DNA文庫(kù)所需的重組子的數(shù)目，在很大程度上與構(gòu)建文庫(kù)所用的載體的容量緊密相關(guān)。質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、BAC或酵母人工染色體等載體都可被用來構(gòu)建基因組文庫(kù)，選用哪種載體取決于基因組的大小。這些載體所能插入的片段大小的上限分別依次為10kb、23kb、45kb、350kb和1000kb用T4DNA連接酶將基因組DNA片段與制備好的載體分子相連接。17整理pptI1-4載體對(duì)于某一特定的基因組，構(gòu)成其DNA文庫(kù)附：原核生物基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建（一）原核生物基因組DNA的提取染色體DNA

質(zhì)粒DNA

要求：制備的DNA的長(zhǎng)度為100-200kb，防止在制備過程中的機(jī)械斷裂18整理ppt附：原核生物基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建（一）原核生物基因組DNA（二）基因組DNA的不完全酶切1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶

a)四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256b)六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/10242、分離目的酶切片段大小的確定

a)克隆單個(gè)基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb3、DNA不完全酶切條件的確定

a)確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間

b)固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量19整理ppt（二）基因組DNA的不完全酶切1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制（三）酶切片段與克隆載體連接１、酶切片段的分離與純化１）低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段２）試劑盒回收目的片段20整理ppt（三）酶切片段與克隆載體連接１、酶切片段的分離與純化20整理2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇a）質(zhì)粒載體可承載15kbDNA左右片段(有效的范圍為<10kb)b）載體可承載25kbDNA左右片段(有效的范圍為15kb)c）Cosmid載體可承載45kbDNA左右片段(有效的范圍為<40kb)21整理ppt2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇a）質(zhì)粒載體可（四）重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞１、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：DH5

:

用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)

互補(bǔ)。HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長(zhǎng)的宿主菌JM109:支持帶有琥珀突變載體生長(zhǎng)的重組缺陷的抑制型菌MZ-1:溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體ＰＬ啟動(dòng)子質(zhì)粒載體的宿主菌22整理ppt（四）重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞１、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的２、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformation)

2）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)3）轉(zhuǎn)染法(transfection)23整理ppt２、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformati（五）基因組DNA文庫(kù)克隆子的保存與篩選1、基因組DNA文庫(kù)的保存

1)影印膜濾保存法24整理ppt（五）基因組DNA文庫(kù)克隆子的保存與篩選1、基因組DN2）文庫(kù)在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70

oC儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫(kù)菌落生長(zhǎng)的不均勻性而導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過多或過少。25整理ppt2）文庫(kù)在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出3)保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后，加入終濃度為25%

的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大26整理ppt3)保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑南京林業(yè)大學(xué)27整理ppt南京林業(yè)大學(xué)27整理ppt通常不用原核mRNA來構(gòu)建cDNA文庫(kù)，因?yàn)樵薽RNA通常不穩(wěn)定；相比之下則較易制備基因組文庫(kù)，且可包含所有基因組序列。從真核mRNA構(gòu)建cDNA是非常有用的，因?yàn)閏DNA不含內(nèi)含子序列，可被用來在大腸桿菌中表達(dá)編碼蛋白。

真核生物基因組DNA十分龐大，其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個(gè)主要困難。高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時(shí)間階段的單個(gè)細(xì)胞或個(gè)體中，都只有15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子。由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡(jiǎn)單得多。cDNA文庫(kù)28整理ppt通常不用原核mRNA來構(gòu)建cDNA文庫(kù)，因?yàn)樵薽RNA通常cDNA基因文庫(kù)構(gòu)建的步驟細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離第一條cDNA合成第二條cDNA合成雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖29整理pptcDNA基因文庫(kù)構(gòu)建的步驟細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA30整理pptcDNA文庫(kù)的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA30整理31整理ppt31整理ppt32整理ppt32整理ppt南京林業(yè)大學(xué)33整理ppt南京林業(yè)大學(xué)33整理ppt南京林業(yè)大學(xué)mRNA完整性的檢測(cè)

1)mRNA分子的大小：哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間.2)總mRNA指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長(zhǎng)分子的能力34整理ppt南京林業(yè)大學(xué)mRNA完整性的檢測(cè)34整理pptmRNA在細(xì)胞中的豐度1)高豐度mRNA

目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的50-90%,該類mRNA在合成和克隆cDNA之前不需進(jìn)一步純化特定mRNA。2)低豐度mRNA

目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下。mRNANARNA35整理pptmRNA在細(xì)胞中的豐度1)高豐度mRNAmRNANARNA南京林業(yè)大學(xué)36整理ppt南京林業(yè)大學(xué)36整理ppt南京林業(yè)大學(xué)37整理ppt南京林業(yè)大學(xué)37整理ppt第一鏈cDNA的合成

oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。

38整理ppt第一鏈cDNA的合成oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列第二鏈cDNA的合成末端轉(zhuǎn)移酶DNA聚合酶I缺失5‘至3’外切酶活性的截短部分39整理ppt引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列第二鏈南京林業(yè)大學(xué)雙鏈cDNA末端的形成及其接頭添加40整理ppt南京林業(yè)大學(xué)雙鏈cDNA末端的形成及其接頭添加40整理ppt基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)附：基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較41整理ppt基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)附：基因組DNA文庫(kù)與cDNA文1基因組DNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于cDNA文庫(kù)，基因組文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)：cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列，

cDNA文庫(kù)中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)，即：高豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較低，分離基因困難；從cDNA克隆中，不能克隆到基因組DNA中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。42整理ppt1基因組DNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于cDNA文庫(kù)，基因組文庫(kù)的2cDNA文庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn)①cDNA文庫(kù)以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。②cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。③每一個(gè)cDNA文庫(kù)都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會(huì)比較低，因此陽性雜交信號(hào)一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會(huì)含有目的基因。④cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。⑤cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。43整理ppt2cDNA文庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn)①cDNA文庫(kù)以mRNA為材料，特3

cDNA克隆的主要的缺點(diǎn)cDNA文庫(kù)所包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫(kù)，并且受細(xì)胞來源或發(fā)育時(shí)期的影響。cDNA文庫(kù)雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。在cDNA文庫(kù)中，相應(yīng)于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而相應(yīng)于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。

44整理ppt3cDNA克隆的主要的缺點(diǎn)cDNA文庫(kù)所包含的遺傳信息要45整理ppt45整理ppt南京林業(yè)大學(xué)46整理ppt南京林業(yè)大學(xué)46整理ppt47整理ppt47整理ppt克隆DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；膜上的DNA在堿性條件下變性，解聚形成單鏈；再通過烤膜或紫外線照射，單鏈將與膜緊密結(jié)合；再將膜置于含有放射性標(biāo)記的核酸探針的溶液中保溫，使探針與其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交；雜交后充分洗去未雜交的探針，然后可由放射性自顯影鑒定。48整理ppt克隆DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上；膜上的DNA在堿性條件下變性，解聚南京林業(yè)大學(xué)49整理ppt南京林業(yè)大學(xué)49整理ppt南京林業(yè)大學(xué)50整理ppt南京林業(yè)大學(xué)50整理ppt南京林業(yè)大學(xué)51整理ppt南京林業(yè)大學(xué)51整理ppt南京林業(yè)大學(xué)52整理ppt南京林業(yè)大學(xué)52整理ppt南京林業(yè)大學(xué)53整理ppt南京林業(yè)大學(xué)53整理ppt放射性抗體檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+54整理ppt放射性抗體檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+54整理ppt扣除文庫(kù)(subtractivelibrary)扣除雜交又叫扣除cDNA克隆(subtractivecDNAcloning)，它是通過構(gòu)建扣除文庫(kù)(subtractivelibrary)得以實(shí)現(xiàn)的。差別雜交對(duì)于因特殊處理而被誘發(fā)產(chǎn)生的mRNA之cDNA克隆的分離，或是在細(xì)胞中具高表達(dá)效率的mRNA之cDNA克隆的分離，無疑是一種有效的方法，但對(duì)于低豐度的mRNA之cDNA克隆的分離則有相當(dāng)?shù)睦щy。為了進(jìn)一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實(shí)可行的辦法是構(gòu)建富含目的基因序列的cDNA文庫(kù)。應(yīng)用扣除雜交篩選法便可達(dá)到此種目的。

55整理ppt扣除文庫(kù)(subtractivelibrary)扣除雜交又扣除雜交（SubtractiveHybridization）

56整理ppt扣除雜交（SubtractiveHybridizationHybridarrest(雜交扣留)Hybridarrestedtranslation:cDNA

hybridizedmRNA

proteinsHybridization:

IndividualcDNAclonesorpools(群)ofclonescanbehybridizedtomRNApreparations.ThehybridizedmRNAcannotbetranslatedtoproteins,andthedetectionofproteinscanbeusedtofindwhichcDNAcanarrestwhichprotein.Subdivision(細(xì)分):ofthepoolsofcDNAintosmallernumbersandrepeatingtheexperimentshouldallowtheidentificationofasinglecDNAthatarrests(扣留)thetranslationofoneprotein.mRNAcDNA應(yīng)用細(xì)胞外翻譯系統(tǒng)57整理pptSectionI:Genelibrariesandscre