2019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)

第六章電泳技術(shù)和常用電泳儀第六章電泳技術(shù)和常用電泳儀1第六章電泳技術(shù)和常用電泳儀

一、概述generalization)電泳（electrophoresis）是指帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。利用電泳現(xiàn)象將多組分物質(zhì)分離、分析的技術(shù)叫做電泳技術(shù)（electrophoresistechnique）?？梢詫?shí)現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器稱之為電泳儀（electrophoresister）。

第六章電泳技術(shù)和常用電泳儀一、概述ge2第六章電泳技術(shù)和常用電泳儀

目前，電泳技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、無(wú)機(jī)離子等成份的分離和鑒定，甚至還用于細(xì)胞與病毒的研究。臨床常用的電泳分析方法主要有醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和毛細(xì)管電泳等。

第六章電泳技術(shù)和常用電泳儀目前，電泳32019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)42019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)5第一節(jié)電泳原理若將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所受到的電荷引力為：F引=EQ（6-1）在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻F阻=6πrηV（6-2）當(dāng)F引=F阻時(shí)EQ=6πrηVV=EQ/6πrη（6-3）由上式可以看出,粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。第一節(jié)電泳原理若將帶凈電荷Q的粒子放6第一節(jié)電泳原理

二、影響電泳的外界因素（一）電場(chǎng)強(qiáng)度

（二）溶液的pH值（三）溶液的離子強(qiáng)度（四）電滲作用（五）粒子的遷移率（六）吸附作用第一節(jié)電泳原理7影響電泳的環(huán)境因素在電場(chǎng)中被分離物質(zhì)的泳動(dòng)速度除受本身性質(zhì)如所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、分子本身的大小和形狀、分子的水化程度、解離趨勢(shì)、兩性行為等影響外，還與其它外界環(huán)境因素有關(guān)。1電場(chǎng)強(qiáng)度的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度是指電場(chǎng)中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳的速度起著重要作用，電場(chǎng)強(qiáng)度高，帶電顆粒泳動(dòng)速度快，電場(chǎng)強(qiáng)度低，帶電顆粒泳動(dòng)速度慢。影響電泳的環(huán)境因素82溶液pH值的影響：大部分生物大分子都具有陽(yáng)離子和陰離子基團(tuán)，這些基團(tuán)的解離常數(shù)不同，溶液的pH值決定被分離物質(zhì)帶電基團(tuán)的解離程度，所以生物大分子的凈電荷取決于環(huán)境的pH值。pH影響著生物大分子的電泳遷移率，溶液的pH值距離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)帶電性越強(qiáng)，泳動(dòng)速度越快；pH值距離蛋白質(zhì)的pI越近，蛋白質(zhì)帶電性越弱，泳動(dòng)速度越慢。電泳時(shí)為保持pH恒定，必須采用緩沖液作為電極緩沖液。在分離蛋白質(zhì)時(shí)，要選擇合適pH的緩沖液，使待分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大差異，有利于彼此分開(kāi)。2溶液pH值的影響：大部分生物大分子都具有陽(yáng)離子和陰離子基93溶液離子強(qiáng)度的影響：溶液中的離子強(qiáng)度直接影響被分離物質(zhì)的電動(dòng)電勢(shì)(

)。帶電顆粒的遷移率與離子強(qiáng)度的平方根成反比。如果溶液的離子強(qiáng)度越大，電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢；如果溶液的離子強(qiáng)度越小，電動(dòng)電勢(shì)越大，泳動(dòng)速度越快。高離子強(qiáng)度時(shí)電泳條帶較細(xì)窄。一般最適合的離子強(qiáng)度在0.02—0.2之間。溶液離子強(qiáng)度的計(jì)算公式如下：I=1/2∑scz2式中，I為離子強(qiáng)度，s表示溶液中有s種離子，c為離子的摩爾濃度(mol/L)，z為離子價(jià)數(shù)。溶液中離子種類多，濃度大，離子價(jià)數(shù)高，則離子強(qiáng)度大。3溶液離子強(qiáng)度的影響：溶液中的離子強(qiáng)度直接影響被分離物質(zhì)的10

4電滲的影響：固體支持物表面的電荷使支持物附近溶液分子形成偶電層，溶液在電場(chǎng)中向一定方向移動(dòng)，即電滲現(xiàn)象，溶液移動(dòng)的同時(shí)攜帶顆粒一起移動(dòng)。

AB

AB115溫度的影響：在凝膠電泳過(guò)程中要產(chǎn)生焦?fàn)枱幔鵁釋?duì)電泳的分離效果影響很大。溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)加劇，使自由擴(kuò)散的速度變快，遷移率增加。6介質(zhì)的影響：介質(zhì)的交聯(lián)度直接影響分離效果，介質(zhì)的純度影響聚膠效果，介質(zhì)的非特異性吸附會(huì)增大電滲。5溫度的影響：在凝膠電泳過(guò)程中要產(chǎn)生焦?fàn)枱?，而熱?duì)電泳的分12第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法一、電泳技術(shù)的分類（一）根據(jù)工作原理的不同：可分為移界電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳、免疫電泳等。

第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法一、電泳技術(shù)的分類13按分離原理分類(1)區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis，ZEP)：是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后在介質(zhì)上加電場(chǎng)，帶電顆粒在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)內(nèi)遷移，在電泳過(guò)程中，不同的離子成分在均一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨(dú)立的區(qū)帶(圖3-2a)，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。按分離原理分類14(2)移界電泳(movingboundaryelectrophoresis，MBEP)：是把電場(chǎng)加在生物大分子溶液和緩沖溶液之間的界面上，帶電顆粒的移動(dòng)速度通過(guò)光學(xué)方法觀察界面的移動(dòng)來(lái)測(cè)定(圖3-2b)。(3)穩(wěn)態(tài)電泳(steadystateelectrophoresis)：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下電遷移一定時(shí)間后達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，此后，電泳條帶的寬度不隨時(shí)間的變化而變化，如等速電泳(isotachophoresis，ITP)、等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)(圖2c、2d)。(2)移界電泳(movingboundaryelectr15abcd圖3-2各種電泳分離原理示意圖a區(qū)帶電泳b移界電泳c等速電泳d等電聚焦a16第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（二）根據(jù)有無(wú)固體支持物可分為：自由電泳和支持物電泳（三）根據(jù)支持載體的位置或形狀可分成：水平電泳、垂直電泳、板狀電泳、柱狀電泳、U型管電泳、倒V字形電泳、毛細(xì)管電泳等。（四）根據(jù)支持物的特點(diǎn)又可分為：①無(wú)阻滯支持物電泳。②高密度的凝膠電泳。（五）根據(jù)電源控制的不同，一般可分為以下3類：1.恒壓電泳;2.恒流電泳;3.恒功率電泳。第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（二）根據(jù)有無(wú)固體支持物可分為17第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（六）根據(jù)自動(dòng)化程度的不同，可分為半自動(dòng)和全自動(dòng)型。（七）根據(jù)其功能的不同，可分為制備型、分析型、轉(zhuǎn)移型、濃縮型等。（八）根據(jù)用法的類型可分為：雙向電泳、交叉電泳、連續(xù)紙電泳、電泳－層析相結(jié)合技術(shù)等。（九）根據(jù)不同的使用目的可分為：核酸電泳、血清蛋白電泳、制備電泳、DNA測(cè)序電泳等。第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（六）根據(jù)自動(dòng)化程度的不同18第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法二、電泳方法簡(jiǎn)介

（一）紙電泳指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。

06-02平臥式電泳槽裝置示意圖將濾紙條水平地架設(shè)在兩個(gè)裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點(diǎn)于濾紙中央。當(dāng)濾紙條被緩沖液潤(rùn)濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V～1000V）進(jìn)行電泳。

第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法二、電泳方法簡(jiǎn)介19第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（二）醋酸纖維素薄膜電泳電泳時(shí)經(jīng)過(guò)膜的預(yù)處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點(diǎn)是分離速度快、電泳時(shí)間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè)。

06-03血清蛋白的電泳圖譜

第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（二）醋酸纖維素薄膜電泳020第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（三）凝膠電泳

由區(qū)帶電泳中派生出一種用凝膠物質(zhì)作支持物進(jìn)行電泳的方式，被稱為凝膠電泳。普通的凝膠電泳在板上進(jìn)行，以凝膠作為介質(zhì)。電泳中常用的凝膠為葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖。它具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無(wú)電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量小

(1～100μg）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。

06-04凝膠電泳圖第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（三）凝膠電泳021Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：22第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（四）等電聚焦電泳1．等電聚焦電泳過(guò)程

一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH值梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH值位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電點(diǎn)聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。

06-05凈電荷與PH的關(guān)系曲線

第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（四）等電聚焦電泳將等23第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法2．等電聚焦電泳的特點(diǎn)①使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快;④分辨率高;⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測(cè)定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點(diǎn);⑦適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法2．等電聚焦電泳的特24第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（五）等速電泳采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個(gè)毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分離。06-06

等速電泳示意圖

第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（五）等速電泳采用兩種不同25第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）第一向采用等電聚焦根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的PI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法（六）雙向凝膠電泳（二維電泳）26第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法膠性PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液

PH3加上電場(chǎng)后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場(chǎng)染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開(kāi)第一向等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上

第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI逐漸降低

06-07雙向凝膠電泳示意圖第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法膠性PH9加上電場(chǎng)27第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法(七）免疫電泳

免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開(kāi)，然后加入抗體做雙相免疫擴(kuò)散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇，在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤?，形成肉眼可?jiàn)的沉淀弧。第二節(jié)常用電泳技術(shù)和電泳方法(七）免疫電泳28第三節(jié)常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)一、常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)（一）電泳電源（二）電泳槽（三）附加裝置06-08平臥式電泳槽裝置示意圖第三節(jié)常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)一、常用電泳設(shè)備29從第一臺(tái)商品自由移界電泳系統(tǒng)的問(wèn)世以后，近50年來(lái)電泳儀器的發(fā)展迅猛，尤其是隨著凝膠電泳技術(shù)的成熟及廣泛應(yīng)用，各種類型的凝膠電泳裝置層出不窮，使電泳技術(shù)得以迅速發(fā)展。凝膠電泳儀作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)小型儀器，種類很多。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，電泳儀器的分析對(duì)象也越來(lái)越專門(mén)化，分辨率越來(lái)越高，操作越來(lái)越簡(jiǎn)單，性能越來(lái)越穩(wěn)定。凝膠電泳系統(tǒng)主要包括電泳儀、電泳槽及附屬設(shè)備三大類。從第一臺(tái)商品自由移界電泳系統(tǒng)的問(wèn)世以后，近50年來(lái)電泳儀器的30電泳儀：根據(jù)電泳儀的電壓設(shè)計(jì)范圍可將其分為三類：(1)常壓電泳儀(600V)：用于凈電荷和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；(2)高壓電泳儀(3000V)：用于載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳和DNA測(cè)序；(3)超高壓電泳儀(30000-50000V)：用于毛細(xì)管電泳。電泳儀：312019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)32

電泳槽：根據(jù)電泳種類不同，對(duì)電泳槽的設(shè)計(jì)也不一樣。電泳槽主要有自由界面電泳槽、管狀電泳槽、板式電泳槽。(1)自由界面電泳槽Tiselius設(shè)計(jì)的自由界面電泳槽（圖3-3）是一個(gè)U形玻璃管，在U形管下部放待分離的蛋白溶液，管臂聯(lián)接到電極上，在電場(chǎng)的作用下，緩沖系統(tǒng)中蛋白質(zhì)界面的移動(dòng)可用光學(xué)系統(tǒng)“紋影法(schlieren)”照相，得到電泳圖譜。這種電泳槽目前已不使用。90年代初發(fā)展起來(lái)的高效毛細(xì)管電泳就是根據(jù)自由界面電泳槽的原理而設(shè)計(jì)的。電泳槽：33電極電極U形管3Tiselius自由界面電泳裝置示意圖電極電極U形管34(2)管狀電泳槽50年代末商品圓盤(pán)電泳槽問(wèn)世。圓盤(pán)電泳槽有上下兩個(gè)電泳槽和帶有鉑金電極的蓋，上電泳槽具有若干個(gè)孔，可插電泳管。將丙烯酰胺凝膠貯液裝在玻璃管內(nèi)，凝膠在電泳管中聚合成柱狀膠條，樣品經(jīng)電泳分離，蛋白區(qū)帶染色后呈圓盤(pán)狀，因而稱圓盤(pán)電泳(discelectrophoresis)。(2)管狀電泳槽35圓盤(pán)電泳槽

36(3)板狀電泳槽板狀電泳槽是目前使用最多的電泳槽，是將凝膠灌裝在兩塊平行的玻璃板中間，因而稱板狀電泳(slabelectrophoresis)。板狀電泳的最大優(yōu)點(diǎn)是包括標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白在內(nèi)的多個(gè)樣品可在同一塊凝膠上在相同的條件下進(jìn)行電泳，便于利用各種鑒定方法，直接比較各樣品的區(qū)帶，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠；還可進(jìn)行雙向電泳。另外，板膠電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量容易消散，凝膠電泳結(jié)果便于照相和制成干膠。板狀電泳槽有垂直板電泳槽和水平板電泳槽。(3)板狀電泳槽37垂板電泳槽垂板電泳槽38轉(zhuǎn)移電泳槽轉(zhuǎn)移電泳槽39平板電泳槽平板電泳槽40雙向電泳槽雙向電泳槽414.3附屬設(shè)備隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，電泳技術(shù)的種類逐漸增加，凝膠電泳在制膠、電泳系統(tǒng)的冷卻、凝膠染色及結(jié)果分析等方面手段日趨完善，科學(xué)家們研制出各種電泳附屬設(shè)備，如梯度混合儀、外循環(huán)恒溫系統(tǒng)、脫色儀、凝膠干燥系統(tǒng)、凝膠掃描儀、凝膠成像儀等。4.3附屬設(shè)備422019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)432019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)44第三節(jié)常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)二、電泳儀的主要技術(shù)指標(biāo)1．輸出電壓8．連續(xù)工作時(shí)間2．輸出電流9．保護(hù)措施3．輸出功率10．顯示方式4．電壓穩(wěn)定度11．定時(shí)方式5．電流穩(wěn)定度12．電源電壓6．功率穩(wěn)定度13．電源頻率7．輸出組數(shù)14．功耗

第三節(jié)常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)二、電泳儀的主要45瓊脂糖凝膠電泳步驟：

1.緩沖液的制備：

常用TAE或TBE，PH值在6—9之間。無(wú)論哪種都含EDTA，可去除二價(jià)金屬離子。瓊脂糖凝膠電泳步驟：

1.緩沖液的制備：462.瓊脂糖膠板的制備1）取一定量的瓊脂糖放入三角瓶中，加入電泳緩沖液配制成一定濃度的瓊脂糖溶液（如基因組DNA：0.8%；PCR產(chǎn)物1.2%）。2）選擇凝膠盤(pán)放入制膠架中，選好梳子插在制膠架上。3）加熱煮沸使溶液澄清，冷卻至60℃加入10mg/mlEB，搖勻后到入制膠架中。4）室溫放置30—40分鐘待凝膠聚合后，輕輕拔掉梳子（注意：先拔一側(cè)，否則垂直拔除產(chǎn)生真空導(dǎo)致部分凝膠帶出）。2.瓊脂糖膠板的制備473.在兩邊槽中加入電泳緩沖液，使凝膠全部被浸沒(méi)，液面應(yīng)高出膠面1mm。4.在梳井內(nèi)加樣，注意避免引入氣泡。5.蓋好上蓋，接通電泳儀。6.根據(jù)實(shí)際情況選擇適宜的電壓即可電泳。長(zhǎng)膠需較高電壓，但是采用高電壓所需電泳時(shí)間較短，發(fā)熱高，分辨率低，適合篩選陽(yáng)品或檢查樣品純度。反之，低電壓，發(fā)熱少，分辨率高，但費(fèi)時(shí)。7.電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，先關(guān)閉電泳儀；隨之拔除電源線，然后打開(kāi)電泳槽上蓋，取出凝膠托盤(pán)。3.在兩邊槽中加入電泳緩沖液，使凝膠全部被浸沒(méi)，液面應(yīng)高出膠48毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳。

毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和4920世紀(jì)30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動(dòng)界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù)獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實(shí)驗(yàn)上和理論上為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。上一世紀(jì)后二十多年分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最迅速的分離分析方法。

20世紀(jì)30－40年代501毛細(xì)管電泳的原理2分離模式3進(jìn)樣與檢測(cè)4毛細(xì)管電泳的應(yīng)用1毛細(xì)管電泳的原理51第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式06-09毛細(xì)管電泳儀裝置示意圖

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式06-052第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式三、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.高靈敏度2.高速度3.高分辨率4.樣品少5.自動(dòng)化程度高6.應(yīng)用范圍廣

06-10

英特雷勃——全自動(dòng)電泳儀第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式三、毛細(xì)管電泳的特53第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式一、毛細(xì)管電泳的相關(guān)概念1.電場(chǎng)強(qiáng)度（ElectricFieldStrength）2.電泳淌度(ElectrophoreticMobility)3.遷移時(shí)間（MigrationTime）4.電泳速度(ElectrophoreticVelocity)5.電滲流（ElectroosmoticFlow，EOF）6.焦耳熱（JouleHeating）

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式一、毛細(xì)管電泳的相54第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式二、毛細(xì)管電泳的基本工作原理溶液中的帶電粒子以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式二、毛細(xì)55第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電泳是指在電場(chǎng)作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。第22章毛細(xì)管電泳56第22章

毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電泳行為與特性使用淌度描述

即單位場(chǎng)強(qiáng)(E)下離子的平均電泳速度υ

μep=υ/E實(shí)驗(yàn)中，只發(fā)生電泳時(shí)有效淌度μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛細(xì)管有效長(zhǎng)度遷移時(shí)間毛細(xì)管總長(zhǎng)度電壓第22章毛細(xì)管電泳57第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系在毛細(xì)管壁雙電層的擴(kuò)散層中的陽(yáng)離子，相對(duì)于毛細(xì)管壁的負(fù)電荷表面，形成一個(gè)圓筒形的陽(yáng)離子鞘，在電場(chǎng)作用下，溶劑化了的陽(yáng)離子，沿滑動(dòng)面與緊密層作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流（electroosmoticflow,EOF）。第22章毛細(xì)管電泳58固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ

固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ59第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的流型特點(diǎn)電滲流HPLC塞流層流

第22章毛細(xì)管電泳60第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細(xì)管有效長(zhǎng)度

電滲流流出時(shí)間

電場(chǎng)強(qiáng)度第22章毛細(xì)管電泳61第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的意義電泳過(guò)程中，伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快5－7倍利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時(shí)完成正、負(fù)離子的分離分析電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)控制電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。

分情況而論第22章毛細(xì)管電泳62第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

改變電滲流的方法改變外加徑向電場(chǎng)改變緩沖液成分和濃度Zeta電勢(shì)改變緩沖液pH加入添加劑改變溫度

粘度

鹽-離子強(qiáng)度表面活性劑μeo正比于Zeta電勢(shì)和介質(zhì)的介電常數(shù)反比于介質(zhì)的黏度Zeta電勢(shì)正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度反比于介質(zhì)的介電常數(shù)第22章毛細(xì)管電泳63第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱流型電泳擴(kuò)散毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

第22章毛細(xì)管電泳64焦耳熱

細(xì)內(nèi)徑（<100μm），粗外徑的毛細(xì)管柱

溫度輪廓黏度輪廓速度輪廓第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

焦耳熱溫度輪廓黏度輪廓速度輪廓65進(jìn)樣

試樣導(dǎo)入毛細(xì)管柱時(shí)，總有一定的試樣區(qū)帶長(zhǎng)度。細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管柱時(shí)，進(jìn)樣操作的要求更為嚴(yán)格。

一般進(jìn)樣區(qū)帶控制在柱長(zhǎng)的1%電泳擴(kuò)散

試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細(xì)管其它地方的濃度或電阻率不相等時(shí)，因兩個(gè)區(qū)域電場(chǎng)強(qiáng)度的差異，而引起區(qū)帶電分散。D值低的物質(zhì)展寬程度小。

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

進(jìn)樣第22章毛細(xì)管電泳66毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附第22章毛細(xì)管電泳67第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式四、毛細(xì)管電泳的分離模式（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳

它是通過(guò)在充滿電解質(zhì)溶液的毛細(xì)管中，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場(chǎng)的作用下，依遷移速度的不同而進(jìn)行分離的。根據(jù)組分的遷移時(shí)間進(jìn)行定性，根據(jù)電泳峰的峰面積或峰高進(jìn)行定量分析。

06-11毛細(xì)血管區(qū)帶電泳原理圖

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式四、毛細(xì)管電泳的分682019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)69第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（二）毛細(xì)管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，能根據(jù)待測(cè)組分的質(zhì)荷比和分子體積的不同而進(jìn)行分離。適用于分離、測(cè)定肽類、蛋白質(zhì)、DNA類物質(zhì)的分離。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（二）毛細(xì)管凝膠電702019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)71毛細(xì)管凝膠電泳綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn):電泳峰尖銳，柱效極高短柱上實(shí)現(xiàn)極好的分離試樣容量為10－12g主要缺點(diǎn):制備柱較困難，壽命較短已成為分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、DNA等強(qiáng)有力的工具。例應(yīng)用CGE分離與激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)相結(jié)合，用于DNA序列快速分析。第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

3毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn):第22章72第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（三）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)使MECC系統(tǒng)中存在兩個(gè)相：流動(dòng)的水相和起到固定相作用的膠束相。在含有膠束的流動(dòng)相中，溶質(zhì)在“水相”和“膠束相”(準(zhǔn)固定相)之間進(jìn)行分配，即使是中性溶質(zhì)，因其本身疏水性不同，在二者之間的分配也會(huì)有差異，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)在“膠束相”中停留時(shí)間長(zhǎng)，遷移速度就慢。反之，親水性強(qiáng)的溶質(zhì)遷移速度就快，最終中性溶質(zhì)將依其疏水性不同而得以分離。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（三）毛細(xì)管膠束電73第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式06-12毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理圖第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式06-12毛細(xì)管膠742019高中化學(xué)-第二章-化學(xué)反應(yīng)與能量-第三節(jié)-化學(xué)反應(yīng)75膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):使毛細(xì)管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.

HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMEKC可達(dá)到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時(shí)間通常小于30min，但達(dá)到相仿效率的毛細(xì)管LC，需要更長(zhǎng)的時(shí)間。

膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):76第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（四）毛細(xì)管等電聚焦電泳不同等電點(diǎn)的分子分別聚集在不同的位置上，不作遷移而彼此分離，這就是等電聚焦分離過(guò)程。毛細(xì)管的等電聚焦是在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的等電聚焦過(guò)程，具有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點(diǎn)差異小于0.01pH單位的兩種蛋白質(zhì)，例如肽類、蛋白質(zhì)的分離。第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（四）毛細(xì)管等電聚77方法:

進(jìn)樣－等電聚焦－檢測(cè)先將脫鹽的試樣（蛋白質(zhì)）以≥1％的濃度與兩性電解質(zhì)溶液混合，用壓力進(jìn)樣充入毛細(xì)管柱(陽(yáng)極端)，置于陽(yáng)極電解質(zhì)溶液如H3PO4中，檢測(cè)端為陰極端，置于陰極電解質(zhì)如NaOH中。施加電壓，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。兩性電解質(zhì)離子形成pH的位置梯度，而蛋白質(zhì)在遷移時(shí)會(huì)在其等電點(diǎn)的pH區(qū)域內(nèi)停止移動(dòng)。這樣pI不同的蛋白質(zhì)各組分會(huì)在毛細(xì)管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.在陽(yáng)、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質(zhì)重新帶電，在電場(chǎng)力作用下發(fā)生遷移、檢測(cè)，使不同組分的蛋白質(zhì)得到分離。第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

5毛細(xì)管等電聚焦方法:進(jìn)樣－等電聚焦－檢測(cè)第22章毛細(xì)管電78特點(diǎn):等電聚焦實(shí)際上也是一個(gè)試樣濃縮過(guò)程，這一過(guò)程可用于濃縮試樣組分。具有極高的分辯率，可以分離等電點(diǎn)相差0.01pH的兩種蛋白質(zhì).注意:電滲流的存在會(huì)破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定

第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

5毛細(xì)管等電聚焦特點(diǎn):第22章毛細(xì)管電泳79第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（五）毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管內(nèi)首先導(dǎo)入具有比被分離各組分高電泳淌度的前導(dǎo)電解質(zhì)，然后進(jìn)樣，隨后再導(dǎo)入比各分離組份低電泳淌度的尾隨電解質(zhì)，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中發(fā)生分離。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（五）毛細(xì)管等速電80第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（六）毛細(xì)管電色譜它包含了電泳和色譜兩種機(jī)制，是在毛細(xì)管中填充或在毛細(xì)管壁上鍵合（或涂壁）固定相，從而構(gòu)成毛細(xì)管色譜柱，依靠電滲流推動(dòng)流動(dòng)相，攜帶樣品遷移，根據(jù)樣品分子的質(zhì)荷比、分子尺寸及分配系數(shù)的差別而分離。

06-13

CEC-加壓毛細(xì)管電色譜儀第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（六）毛細(xì)管電81第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式五、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，主要有高壓源、毛細(xì)管柱、檢測(cè)器，以及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液槽。

（一）毛細(xì)管柱（二）檢測(cè)器（三）毛細(xì)管電泳法的進(jìn)樣技術(shù)

06-14毛細(xì)管電泳儀第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式五、毛細(xì)管電泳儀的82第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式

六、常用各種電泳儀簡(jiǎn)介（一）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀是中壓電泳儀。其輸出電壓的調(diào)節(jié)范圍為0V～600V、輸出電流為0mA～100mA。該機(jī)工作穩(wěn)定性好、調(diào)節(jié)范圍寬，并設(shè)有完善的短路保護(hù)電路和過(guò)流保護(hù)電路，是目前國(guó)內(nèi)中、低壓電泳實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的電泳儀之一。

06-15穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式六、常用各種電83第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（二）全自動(dòng)醋纖膜電泳儀全自動(dòng)醋纖膜電泳儀為全自動(dòng)電泳儀，有可見(jiàn)光單系統(tǒng)，使用醋酸纖維薄膜電泳片，優(yōu)點(diǎn)為自動(dòng)化程度高。只需將樣品、試劑、電泳片放好，人員可離機(jī)完成實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（二）全自動(dòng)醋纖膜84第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（三）全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀為全自動(dòng)電泳儀，具有熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)，在使用熒光試劑項(xiàng)目如CK、LD同工酶時(shí)為全自動(dòng)。只需將樣品、試劑、瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后，操作人員可離機(jī)完成實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（三）全自動(dòng)熒光/85第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（四）全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀全自動(dòng)電泳儀，有可見(jiàn)光單系統(tǒng)，使用瓊脂糖凝膠電泳膠片，優(yōu)點(diǎn)為靈敏度高，可適用于低濃度蛋白檢驗(yàn)。該儀器自動(dòng)化程度較差，當(dāng)電泳結(jié)束和染色脫色完成后，工作人員必須將電泳片由機(jī)器中取出。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（四）全自動(dòng)瓊脂糖86第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（五）雙向電泳及雙向電泳-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用雙向電泳是將樣品進(jìn)行電泳后，在它的直角方向再進(jìn)行一次電泳。雙向電泳第一向?yàn)榈入娋劢?，第二向?yàn)樘荻萐DS電泳。樣品經(jīng)過(guò)電荷與質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后可得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息。這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高，信息量最多的技術(shù)，已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具。

第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（五）雙向電泳及雙87第四節(jié)毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式（六）高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用高效毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為推動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。高效毛細(xì)管電泳是一種