細(xì)菌內(nèi)毒素經(jīng)典簡介及檢測方法

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素經(jīng)典簡介及檢測方法內(nèi)容基本概念實(shí)驗(yàn)方法操作注意事項(xiàng)第2頁,共34頁，2024年2月25日，星期天一、概念及相關(guān)知識熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何可以導(dǎo)致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。機(jī)理：外源性熱原質(zhì)通過內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細(xì)胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)節(jié)中心發(fā)熱新蛋白合成新mRNA翻譯第3頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1942年，美國藥典首次收載熱原檢查法，中國藥典自第一版（1953年版）起收載。所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過熱原檢查。熱原檢查法的局限性：

1、重現(xiàn)性差。

2、對藥物引起的增加、抑制作用無法控制。

3、不同細(xì)菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)的致熱域有差別。

4、非定量反應(yīng)。雖然不排除有其他熱原物質(zhì)存在，但細(xì)菌內(nèi)毒素是最主要的熱原物質(zhì)。第4頁,共34頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：肽聚糖脂蛋白革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌外膜細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當(dāng)細(xì)胞磷壁酸脂多糖細(xì)菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性壁外膜結(jié)構(gòu)完整時不具備生物活性，只有當(dāng)細(xì)菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原＋核心多糖＋類脂A致熱活性部分第5頁,共34頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)毒素的量值：1、內(nèi)毒素單位（EU）

1982年FDA將當(dāng)時美國代號為EC－2的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國際單位（IU）

WHO先后兩次組織協(xié)作標(biāo)定，建立內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品，其中第二批內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU＝1EU。第6頁,共34頁，2024年2月25日，星期天鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。第7頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共34頁，2024年2月25日，星期天鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理內(nèi)毒素C因子活化的C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)－酶聯(lián)反應(yīng)第9頁,共34頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

凝膠法濁度法光度法顯色基質(zhì)法重現(xiàn)性好能定量能控制藥物的增強(qiáng)/抑制干擾操作簡便。節(jié)省時間方法分類方法特點(diǎn)第10頁,共34頁，2024年2月25日，星期天二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測之凝膠法實(shí)驗(yàn)程序1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復(fù)核4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法）5、供試品內(nèi)毒素限量檢查第11頁,共34頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)材料及用具1、儀器名稱要求天平感量0.1mg以下電熱干燥箱～300℃恒溫水浴箱37±1℃水銀或酒精溫度計～100℃±1℃漩渦混合器/計時器60min±1min2、器具器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑10×75mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆第12頁,共34頁，2024年2月25日，星期天試劑1、鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號2、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品3、內(nèi)毒素檢查用水4、三效熱原滅火劑5、75％乙醇常用英文縮寫B(tài)ET：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查BET水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水MVD：供試品最大有效稀釋倍數(shù)NC：陰性對照MVC：供試品最低有效濃度PC：陽性對照λ：鱟試劑靈敏度L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值第13頁,共34頁，2024年2月25日，星期天靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：每批鱟試劑用于檢測前都必須進(jìn)行靈敏度復(fù)核。試驗(yàn)舉例：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為100EU/支；待測鱟試劑靈敏度λ＝0.25EU/ml。1、制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75％酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進(jìn)行稀釋，步驟如下(箭頭下方為加入BET水量)：100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.8ml0.2ml1.8ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml第14頁,共34頁，2024年2月25日，星期天0.2ml0.2ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml水水溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品水水水水100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）第15頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標(biāo)示量加入BET水溶解，再取0.1ml分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管（10mm×75mm），將試管按如下形狀排列。3、加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。12λ2λ30.5λ40.25λBET水2λ2λ2λ2λλλλλ0.5λ0.5λ0.5λ0.5λ0.25λ0.25λ0.25λ0.25λ第16頁,共34頁，2024年2月25日，星期天反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動混勻，置37℃水浴中保溫60±2min，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180°，凝膠不變形為“＋”，凝膠不能保持完整為“－”。當(dāng)2.0λ四支管都為陽性，0.25λ四支管都為陰性時，試驗(yàn)成立，按下面底公式計算復(fù)核的靈敏度λc

：

λc＝lg-1(∑X/4)（X:反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值。）

當(dāng)0.5λ≤λc≤2.0λ時，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測時仍以標(biāo)示靈敏度λ為準(zhǔn)。第17頁,共34頁，2024年2月25日，星期天舉例：設(shè)待復(fù)核的鱟試劑標(biāo)示靈敏度λ為0.125EU/ml:平行管數(shù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（EU/ml）NC反應(yīng)終點(diǎn)濃度CX(lgC)0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--/0.125-0.9034++--/0.125-0.903λc＝lg-1(∑X/4)

＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（-1.22

）＋（-1.22

）］/4｝＝0.104（EU/ml）

λc在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定。第18頁,共34頁，2024年2月25日，星期天樣品內(nèi)毒素檢查1、供試品最大有效稀釋倍數(shù)的計算：

C·LMVD＝

λλ：測試用鱟試劑靈敏度標(biāo)示值(EU/ml)。L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值。C：供試品濃度或供試品復(fù)溶后所得樣品濃度。當(dāng)L單位為EU/ml（溶液）時，C的單位為1ml/ml；當(dāng)L單位為EU/mg或者EU/u時（抗生素原料），C的單位為mg/ml或者u/ml。第19頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2、供試品溶液稀釋：將供試品稀釋，稀釋倍數(shù)為MVD。含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品溶液（PPC）的制備：3、加樣：取鱟試劑8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支為樣品管，加入樣品液0.1ml；2支加入陰性對照管，加入BET水0.1ml；2支為陽性對照管，加入22λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液。

37±1℃水浴中保溫60±1min。稀釋0.5MVD倍的供試品1.0ml4λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0ml＋混合含2λ內(nèi)毒素的供試品溶液第20頁,共34頁，2024年2月25日，星期天示意圖：結(jié)果判斷：

陽性對照為陽性陰性對照為陰性試驗(yàn)結(jié)果成立樣品陽性對照為陽性

2支樣品管均為陰性時，樣品符合規(guī)定；

2支樣品管均為陽性時，樣品不符合規(guī)定；樣品管1支為陽性1支為陰性時，需復(fù)試。復(fù)試時做4支樣品管，有1支為陽性則樣品不符合規(guī)定。樣品陽性陰性樣品陽性第21頁,共34頁，2024年2月25日，星期天例：硫酸慶大霉素注射液規(guī)格：4000U/ml內(nèi)毒素限值L：參考獸藥典“每1000慶大霉素單位含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU”，即

L＝0.5EU/1000U=0.0005EU/U鱟試劑標(biāo)示靈敏度λ：0.125EU/U供試品最大稀釋倍數(shù)

C·L4000U/ml×0.0005EU/UMVD＝＝＝160（倍）

λ0.125EU/U第22頁,共34頁，2024年2月25日，星期天供試品溶液制備：含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品溶液的制備：取500U/ml的樣品溶液1.0ml＋0.5EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合。供試品4000U/ml1000U/ml500U/ml250U/ml0.4ml3.6ml1.0ml3.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml稀釋10倍稀釋40倍稀釋80倍稀釋160倍用量多第23頁,共34頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷：結(jié)果判斷樣品管陰性對照陽性對照樣品陽性對照符合規(guī)定－－－－＋＋＋＋不符合規(guī)定＋＋－－＋＋＋＋需復(fù)試＋－－－＋＋＋＋符合規(guī)定－－－－－－＋＋＋＋不符合規(guī)定＋－－－－－＋＋＋＋第24頁,共34頁，2024年2月25日，星期天三、操作注意事項(xiàng)試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1、玻璃器具應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計量準(zhǔn)確、清洗操作方便。洗凈去污去內(nèi)毒素去洗滌劑精洗除外源性熱原：250

℃干烤至少1小時。2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250

℃干烤至少1小時。3、用于內(nèi)毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內(nèi)毒素。第25頁,共34頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。實(shí)驗(yàn)過程：1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保存；工作標(biāo)準(zhǔn)品開封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保存。2、溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進(jìn)一步稀釋時每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。