抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用

第三節(jié)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用一、免疫沉淀與免疫凝集二、免疫標(biāo)記三、免疫定位分析四、抗原抗體反映的其他應(yīng)用1整理課件第三節(jié)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用一、免疫沉淀與免疫凝集1整理課件一、免疫沉淀與免疫凝集溶液中的環(huán)狀沉淀試驗(yàn)在體外可溶性抗原與相應(yīng)抗體形成肉眼看見(jiàn)的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于觀察。2整理課件一、免疫沉淀與免疫凝集溶液中的環(huán)狀沉淀試驗(yàn)2整理課件對(duì)照1:101:201:401:801:160抗血清稀釋度抗原沉淀線抗血清環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)示意圖3整理課件對(duì)照1:101:202.凝膠擴(kuò)散沉淀

抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)?？乖肿优c抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散，相遇形成沉淀。以瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)較為常用。單向免疫擴(kuò)散：抗體混于瓊脂中，小孔中加入抗原，抗原向周?chē)鶆驍U(kuò)散，與抗體形成沉淀環(huán)?？捎糜诙繙y(cè)定免疫球蛋白和補(bǔ)體的含量等。雙向免疫擴(kuò)散：抗原和抗體向周?chē)鷶U(kuò)散后可在兩孔之間形成白色沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測(cè)。缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低。4整理課件2.凝膠擴(kuò)散沉淀抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)單向免疫擴(kuò)散：常用于測(cè)定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。

抗體混于瓊脂凝膠中制板沉淀環(huán)環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)5整理課件單向免疫擴(kuò)散：常用于測(cè)定IgG、IgM、IgA、C3、C4等雙向免疫擴(kuò)散——沉淀線形狀的變化顯示抗原間是否存在共同的抗原決定簇。AbAg1，3AbAb6整理課件雙向免疫擴(kuò)散——沉淀線形狀的變化顯示抗原間是否存在共同的抗原3.電泳條件下的沉淀反應(yīng)血清免疫電泳：患者血清和正常人血清分別放在凝膠上近負(fù)極端的小孔中進(jìn)行電泳分離后，在兩種抗原之間沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清進(jìn)行雙擴(kuò)散?；鸺娪荆?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散與電泳結(jié)合的一種方法。在電場(chǎng)作用下抗原向正極擴(kuò)散，與抗體形成沉淀峰（火箭型沉淀線）。需時(shí)短，能檢測(cè)微量抗原。對(duì)流電泳(電滲析)：在電場(chǎng)作用下抗原與抗體相對(duì)擴(kuò)散，形成沉淀線。對(duì)流電泳較雙擴(kuò)快速和靈敏。7整理課件3.電泳條件下的沉淀反應(yīng)血清免疫電泳：患者血清和正常人血清分8整理課件8整理課件9整理課件9整理課件10整理課件10整理課件4.免疫共沉淀

在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，可以通過(guò)免疫共沉淀驚醒鑒定和分離。蛋白質(zhì)相互作用通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，用針對(duì)其中一種蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行的免疫沉淀，與該蛋白相互作用的其他蛋白也同時(shí)被沉淀下來(lái)。如果第一抗體結(jié)合后再加入第二抗體或A蛋白可使抗原抗體形成更大的復(fù)合物易于沉淀，也可通過(guò)加入聚乙二醇破壞水化膜加速沉淀形成。11整理課件4.免疫共沉淀在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，免疫共沉淀原理圖解12整理課件免疫共沉淀原理圖解12整理課件5.免疫凝集

大顆粒性抗原如細(xì)胞或細(xì)菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合后能使康媛顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼易見(jiàn)的凝集小塊，即為免疫凝集。

凝集反應(yīng)的發(fā)生分為兩個(gè)階段：1、抗原抗體的特異性結(jié)合階段；2、出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。

13整理課件5.免疫凝集大顆粒性抗原如細(xì)胞或細(xì)菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合

最常見(jiàn)的免疫凝集反應(yīng)是紅細(xì)胞凝集，即血凝反應(yīng)。血凝反應(yīng)的抗體識(shí)別的抗原可以是紅細(xì)胞表面的天然抗原，如血凝鑒定試驗(yàn)；也可以通過(guò)交聯(lián)將紅細(xì)胞連接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝試驗(yàn)。14整理課件最常見(jiàn)的免疫凝集反應(yīng)是紅細(xì)胞凝集，即血凝反應(yīng)。1細(xì)菌的血凝試驗(yàn)常用來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定與分型，如沙門(mén)菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集試驗(yàn)雖然簡(jiǎn)便，但是受反應(yīng)靈敏度的限制，在實(shí)際應(yīng)用越來(lái)越少。15整理課件細(xì)菌的血凝試驗(yàn)常用來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定與分型，如沙門(mén)菌鞭毛抗原二、免疫標(biāo)記免疫標(biāo)記技術(shù)：將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)（示蹤物），通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物反映有無(wú)抗原抗體反應(yīng)，從而間接測(cè)出微量的抗原或抗體。目前有四種方法：放射免疫分析法：以同位素為示蹤物，為最靈敏、可靠的免疫標(biāo)記技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）熒光與發(fā)光免疫分析親和標(biāo)記的免疫分析16整理課件二、免疫標(biāo)記免疫標(biāo)記技術(shù)：將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)17整理課件標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)1.放射免疫分析法標(biāo)記同位素：125I，131I、3H和35S檢測(cè)方法：液相體系用液體閃爍儀計(jì)數(shù)；固相體系用X射線膠片顯影。18整理課件1.放射免疫分析法標(biāo)記同位素：125I，131I、3H和35直接法與競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檢測(cè)19整理課件直接法與競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檢測(cè)19整理課件競(jìng)爭(zhēng)法基本原理

采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。20整理課件競(jìng)爭(zhēng)法基本原理20整理課件21整理課件21整理課件放射性同位素標(biāo)記分析法示意圖22整理課件放射性同位素標(biāo)記分析法示意圖22整理課件23整理課件23整理課件2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

(enzymelinkedimmunosorbentassay)(1)定義：抗原與抗體吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原與抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標(biāo)記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物。(2)測(cè)試方法：可目測(cè)或用分光光度計(jì)比色進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。24整理課件2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

(enzymeli(3)測(cè)試過(guò)程使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）

在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）25整理課件(3)測(cè)試過(guò)程使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）26整理課件用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，酶來(lái)源底物檢測(cè)波長(zhǎng)/nm堿性磷酸酶牛小腸黏膜對(duì)硝基酚磷酸鹽405過(guò)氧化物酶辣根鄰苯二胺/過(guò)氧化氫492β-半乳糖酶大腸桿菌對(duì)硝基酚β-半乳糖405常用標(biāo)記的酶及其底物27整理課件酶來(lái)源底物檢測(cè)波長(zhǎng)/nm堿性磷酸酶牛小腸黏膜對(duì)硝基酚磷酸鹽4(4)ELISA技術(shù)類型

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。28整理課件(4)ELISA技術(shù)類型ELISA可用于測(cè)定抗①雙抗體夾心法(直接夾心法）29整理課件①雙抗體夾心法(直接夾心法）29整理課件特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇30整理課件特點(diǎn)：30整理課件②間接法31整理課件②間接法31整理課件32整理課件32整理課件③捕獲法（反向間接法）主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。33整理課件③捕獲法（反向間接法）主要用于血清中某種抗體亞型成分（如Ig④直接法用酶標(biāo)記的抗原或抗體直接檢測(cè)包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原，其量與產(chǎn)物顏色成正比。34整理課件④直接法34整理課件3、均相酶免疫吸附測(cè)定

基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測(cè).35整理課件3、均相酶免疫吸附測(cè)定基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)酶放大免疫測(cè)定技術(shù):

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。36整理課件酶放大免疫測(cè)定技術(shù):

（enzyme-multiplied⑤斑點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)

(dot-ELISA)37整理課件⑤斑點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)(dot-ELISA)37整理課件3.熒光與發(fā)光免疫分析概念：以熒光素作為示蹤物，通過(guò)熒光顯微鏡觀察進(jìn)行定位檢測(cè)。熒光化合物：異硫氰熒光素、羅丹明熒光素。38整理課件3.熒光與發(fā)光免疫分析概念：以熒光素作為示蹤物，通過(guò)熒光顯基本原理

利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有無(wú)待檢抗原或抗體。39整理課件基本原理39整理課件40整理課件40整理課件熒光免疫測(cè)定技術(shù)——

時(shí)間分辨熒光免疫分析法原理：稀土銪離子Eu3+螯合物標(biāo)記抗體后，抗體與固相抗原結(jié)合，抗體上的Eu3+在紫外光（340nm）激發(fā)下，與增強(qiáng)液中的β-二酮體重新形成一種微膠體螯合物，發(fā)出長(zhǎng)壽命的高強(qiáng)度熒光（613nm），比未激發(fā)時(shí)增強(qiáng)了100萬(wàn)倍，可用時(shí)間分辯熒光計(jì)記錄。41整理課件熒光免疫測(cè)定技術(shù)——

時(shí)間分辨熒光免疫分析法原理：稀土銪離子EuEuEuEuEu發(fā)射高強(qiáng)度熒光時(shí)間分辯熒光計(jì)記錄加入增強(qiáng)液紫外光激發(fā)（340nm）時(shí)間分辨熒光免疫分析原理直接法間接法夾心法間接夾心法42整理課件EuEuEuEuEu發(fā)射高強(qiáng)度熒光時(shí)間分辯熒光計(jì)記錄加入增強(qiáng)4.親和標(biāo)記的免疫分析親和標(biāo)記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生物素（維生素）、地高辛（小分子藥物）原理：金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgG的Fc有高度親和力。用酶、同位素和熒光素等標(biāo)記A蛋白，與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。43整理課件4.親和標(biāo)記的免疫分析親和標(biāo)記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生A蛋白

親和標(biāo)記的免疫分析44整理課件A蛋白

親和標(biāo)記的免疫分析44整理課件三、免疫定位分析1.免疫熒光定位分析2.酶標(biāo)記免疫定位3.免疫電子顯微鏡技術(shù)45整理課件三、免疫定位分析1.免疫熒光定位分析45整理課件1.免疫熒光定位分析用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標(biāo)記抗體用于免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)。（熒光化合物+抗體）生物大分子（抗原）在細(xì)胞或組織中的表達(dá)和定位熒光素：異硫氰熒光素、異硫氰四甲基羅丹明熒光顯微鏡觀測(cè)熒光激活細(xì)胞分揀器（流式細(xì)胞儀）應(yīng)用：CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)原理：流式細(xì)胞儀產(chǎn)生分析的電信號(hào)生要是光散射信號(hào)和熒光信號(hào)，流式細(xì)胞儀依據(jù)細(xì)胞流經(jīng)光照射區(qū)時(shí)電壓訊號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)分析和分選細(xì)胞。46整理課件1.免疫熒光定位分析用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標(biāo)記抗體用于免47整理課件47整理課件48整理課件48整理課件2.酶標(biāo)記免疫定位抗原（組織或細(xì)胞內(nèi)）+第一抗體+第二抗體酶+底物——不溶于水的有色產(chǎn)物（1）酶標(biāo)免疫組織化學(xué)固相抗原為組織切片或細(xì)胞樣品。49整理課件2.酶標(biāo)記免疫定位抗原（組織或細(xì)胞內(nèi)）+第一抗體+第二抗體酶（2）免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳后，形成不同的條帶，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行顯色反應(yīng)，可確定目的蛋白的有無(wú)，或分子量大小。分三個(gè)階段進(jìn)行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）轉(zhuǎn)移——硝酸纖維素膜酶免疫定位

50整理課件（2）免疫印跡法（immunoblottingtest，IB免疫印跡法原理示意圖

51整理課件免疫印跡法原理示意圖51整理課件3.免疫電子顯微鏡（IEM）技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：提高了電鏡觀察的特異性。如形態(tài)相同，但結(jié)構(gòu)和組成不同的生物粒子，細(xì)胞器或病毒粒子。種類：一類是先用抗體捕捉抗原，然后用磷鎢酸負(fù)染色觀察。另一類是用金標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位。膠體金與抗體Fc段結(jié)合。52整理課件3.免疫電子顯微鏡（IEM）