微生物細胞破碎-課件

第四章微生物細胞的破碎

知識點：細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，微生物細胞的破碎技術(shù)，破碎率的測定。重點：工業(yè)生產(chǎn)中常用的幾種細胞破碎方法的原理，操作過程及常用設(shè)備，并能就實際生產(chǎn)情況予以合理的選擇。難點：常用破碎方法的合理選用。1第四章微生物細胞的破碎知識點：細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)22精品資料3精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學(xué)方法需要改進？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學(xué)問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”4455為了研究細胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)（表1）：微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質(zhì)一、細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)6為了研究細胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細胞壁77889910101111細菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細菌的堅固；酵母細胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細菌和酵母菌的細胞壁有所提高。不同種類的細胞結(jié)構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同，由難到易的大致排列順序為：植物細胞＞真菌（如霉菌、酵母菌）＞革蘭氏陽性細菌＞革蘭氏陰性細菌＞動物細胞。12細菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破1313二、常用破碎方法分類作用機理適應(yīng)性機械法珠磨法固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和含有包含體的基因工程菌超聲破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活14二、常用破碎方法分類作用機理適應(yīng)細胞破碎機理圖15細胞破碎機理圖15進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：16進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨高速珠磨機17高速珠磨機17實驗室規(guī)模的細胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機（瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造）。18實驗室規(guī)模的細胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機、Br膠體磨德國進口珠磨機19膠體磨德國進口珠磨機192020破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應(yīng)速度過程，符合下列公式：

ln[1/(1-R)]=Kt

其中R—破碎率；

K一一級反應(yīng)速度常數(shù)；

t一時間。一級反應(yīng)速度常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如如攪拌轉(zhuǎn)速、細胞懸浮液的濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠的裝量和珠體的直徑，以及溫度等。21破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應(yīng)速度過程，符合下列操作條件的選擇：珠體大小——根據(jù)細胞大小、濃度以及連續(xù)操作時不使珠體帶出來選擇。珠體裝量——裝量少時，細胞不易破碎；裝量大時，能量消耗大，研磨室熱擴散性能降低，引起溫度升高。溫度——溫度高時細胞較易破碎，但要考慮目的產(chǎn)物不受破壞。一般溫度控制在5～40℃內(nèi)時影響較小。攪拌轉(zhuǎn)速——過高將使能量消耗大增，而破碎率上升不明顯。

能耗

R n22操作條件的選擇：珠體大小——根據(jù)細胞大小、濃攪拌轉(zhuǎn)速——過高2323242425252626珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗減少大分子目的產(chǎn)物的失活減少由于高破碎率產(chǎn)生的細胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。27珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：27采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國APV公司和美國Microfluidics公司均有產(chǎn)品出售）。2.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）——大規(guī)模細胞破碎的常用方法利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。原理：28采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國APV公司和美國高壓勻漿器29高壓勻漿器293030大、中、小型高壓勻漿器31大、中、小型高壓勻漿器31破碎的動力學(xué)方程為：ln[1／（l－R）]＝KNPα

其中R——破碎率；

K——與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；

P一操作壓力；

N一懸浮液通過勻漿器閥的次數(shù)。

α——與微生物種類有關(guān)的常數(shù)；破碎酵母菌,α值可取2.2?？梢姡绊懫扑榈闹饕蛩厥菈毫?、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。32破碎的動力學(xué)方程為：ln[1／（l－R）]＝KNPα3233333434在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。一般說來，酵母菌較細菌難破碎，處于靜止狀態(tài)的細胞較處于快速生長狀態(tài)的細胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細胞比在簡單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細胞較難破碎。

易造成堵塞的團狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）不宜采用高壓勻漿法的細胞類型：35在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細胞，常思考問題：比較高壓勻漿法與珠磨法的異同點？36思考問題：3637373.噴霧撞擊破碎細胞彈性體剛性體噴霧撞擊破碎器結(jié)構(gòu)簡圖383.噴霧撞擊破碎細胞彈性體剛性體噴霧撞擊破碎器結(jié)構(gòu)

細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（每分鐘數(shù)千攝氏度），形成粒徑小于5微米的微粒子。高速載氣，氮氣流速300m/s，將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速沖向撞擊板，得以破碎。3.噴霧撞擊破碎39細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（每分鐘數(shù)千攝氏度），形成噴霧撞擊特點：（1）細胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬，細胞破碎度均勻，可避免細胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎現(xiàn)象。（2）細胞破碎程度可通過無極調(diào)節(jié)載氣壓力（流速）控制，避免胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細胞器（葉綠體、線粒體）的回收。噴霧撞擊破碎特點40噴霧撞擊特點：噴霧撞擊破碎特點40噴霧撞擊適用于微生物細胞和植物細胞的破碎，通常處理懸浮液質(zhì)量控制濃度為100-200g/L。實驗室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力為50-500mL/h，而工業(yè)規(guī)模的處理能力為10L/h。與其他機械法一樣，此種破碎方法也會造成操作系統(tǒng)的溫度上升，破壞生物產(chǎn)品的生物活性，單程操作使溫度大約上升10攝氏度。因此，操作系統(tǒng)中必須設(shè)有冷卻系統(tǒng)，以保證生物產(chǎn)品的活性。41噴霧撞擊適用于微生物細胞和植物細胞的破碎利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。一般認為超聲波破碎的機理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差，該法在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用（聲能傳遞和散熱）。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。42利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。3.超聲4343超聲波破碎法44超聲波破碎法443.超聲破碎法（Ultrasonication）其破碎率的相關(guān)因素:

聲頻、聲能；處理時間細胞濃度菌種類型

453.超聲破碎法（Ultrasonication）其破碎率的相4646與破碎效率直接相關(guān)的參數(shù)振幅，與聲能有關(guān)，直接影響蛋白釋放的比速率黏度，影響能耗，抑制空穴現(xiàn)象表面張力，添加表面活性劑或者從細胞中釋放出蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，會顯著影響超聲破碎效率。起泡在氣-液界面上會使蛋白質(zhì)變性或清除空穴現(xiàn)象。被處理懸浮液的體積。大體積需要高的聲能引起強烈的渦流和大氣泡的形成。47與破碎效率直接相關(guān)的參數(shù)振幅，與聲能有關(guān)，直接影響蛋白釋放的珠粒的體積和直徑，對于剛性細胞的粉碎常添加細小的珠粒以產(chǎn)生輔助研磨效應(yīng)。探頭的形狀和材質(zhì)，一般是鈦金屬材料。細胞懸浮液的流速。由于其局限性，在工業(yè)上一般不采用，主要是用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。與破碎效率直接相關(guān)的參數(shù)48珠粒的體積和直徑，對于剛性細胞的粉碎常添加細小的珠粒以產(chǎn)生輔影響超聲對生物產(chǎn)品的回收有很多因素（1）溫度

避免方法

預(yù)冷

冷凝循環(huán)水（2）游離基的生成等化學(xué)效應(yīng).

應(yīng)對方式

添加游離基的清除劑{胱氨酸，谷胱甘肽或者利用氫氣頂吹細胞懸浮液來緩和}49影響超聲對生物產(chǎn)品的回收有很多因素49微波破碎基于微波加熱的瞬時性、選擇性、和高效性，控制適宜的微波條件而實現(xiàn)。植物細胞不同部位的物質(zhì)，對微波的吸收能力存在顯著差異。50微波破碎基于微波加熱的瞬時性、選擇性、和高效性，控制適宜的微機械破碎作用機制不同，有各自的適用范圍和處理規(guī)模。適用范圍：菌體細胞，目標產(chǎn)物。破碎大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA，珠磨法完整質(zhì)粒收得率在90%,其他方法50%以下。因此針對目標產(chǎn)物性質(zhì)（分子量、分子形態(tài)、穩(wěn)定性等）選擇細胞破碎法，并確定合適的操作條件非常重要。51機械破碎作用機制不同，有各自的適用范圍和處理規(guī)模。51機械破碎的缺點需高能，并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品失活。破碎的有機體或者產(chǎn)物，非專一，產(chǎn)生碎片微粒尺寸的大范圍細分布，大量的細微顆粒給后續(xù)分離造成困難。52機械破碎的缺點需高能，并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定4.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法

常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等溶菌酶主要用于細菌類細胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物534.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法如：對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時必須根據(jù)細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。如在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。54如：對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、激活劑和細胞代謝途徑等。常用加熱法和干燥法。缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。

（2）自溶法（Autolysis）55誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。5.化學(xué)滲透法（Chemicalpermeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。56某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉等也可使細胞破碎。（1）表面活性劑可促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞的破碎。57如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)處理G-細菌，對細胞外層膜有破壞作用。G-細菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。（2）EDTA螯合劑58處理G-細菌，對細胞外層膜有破壞作用。G-細菌的外層膜結(jié)構(gòu)通能分解細胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。（3）有機溶劑（4）變性劑鹽酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。59能分解細胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放不同細胞可采用的化學(xué)滲透處理方式細胞類型變性劑清潔劑有機溶劑酶抗生素生物試劑螯合劑革蘭氏陰性細菌******革蘭氏陽性細菌***酵母菌******植物細胞****巨噬細胞****表示適用60不同細胞可采用的化學(xué)滲透處理方式細胞類型變性劑清潔劑有機溶劑?各種試劑的不同作用機理，將幾種試劑合 理地搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋 放率。例：單獨用0.1mol/L鹽酸胍處理E.coli僅釋放約1%的蛋白質(zhì)0.5%TritonX-100處理蛋白質(zhì)釋放率為4%二者合用，蛋白質(zhì)釋放率可達53%左右61?各種試劑的不同作用機理，將幾種試劑合例：單獨用0.1mol通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。62通用性差；化學(xué)滲透法優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點，但不適應(yīng)于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。

6.其他方法1.X-press法63將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPaX-press法64X-press法64將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。

2.滲透壓法（Osmoticpressure）65將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達滲透壓法66滲透壓法66細胞膜疏水鍵破裂胞內(nèi)結(jié)冰細胞膨脹而破裂適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。

3.反復(fù)凍結(jié)-融化法67細胞膜疏水鍵破裂3.反復(fù)凍結(jié)-融化法67使細胞結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌。冷凍