玉米 高粱主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范 第7部分：玉米青霉穗腐病

1DB21/T2219.7—XXXX玉米高粱主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范第7部分：玉米青霉穗腐病本文件規(guī)定了玉米青霉（Penicilliumsp.）穗腐病抗病性鑒定技術(shù)的準(zhǔn)備、接種和評(píng)價(jià)等要求。本文件適用于栽培玉米（ZeamaysL.）種質(zhì)資源和雜交種對(duì)玉米青霉穗腐病抗性的人工接種鑒定及評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1248.8玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范第8部分：鐮孢穗腐病3術(shù)語和定義NY/T1248.8界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1籽粒傷口接種kernelinoculation利用可定量的連續(xù)注射器于果穗中部進(jìn)行創(chuàng)傷注射的接種技術(shù)。4準(zhǔn)備4.1接種物準(zhǔn)備4.1.1接種物的分離、鑒定以常規(guī)組織分離法和單孢分離法（見附錄A）從田間采集的具有典型玉米青霉穗腐病癥狀的果穗分離獲得純培養(yǎng)物，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為青霉屬真菌，4℃保存?zhèn)溆谩?.1.2接種物的制備挑取4.1.1保存的青霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PotatoDextroseAgar，簡稱PDA）培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)5d后，用無菌打孔器打取菌落邊緣直徑5mm的菌餅，將其接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PotatoDextrose，簡稱PD）中120r/min培養(yǎng)5d。培養(yǎng)物經(jīng)滅菌的雙層紗布過濾，獲得分生孢子懸浮液，用無菌水將孢子濃度調(diào)至2×106個(gè)/mL，即可用于接種。PDA和PD培養(yǎng)基配方見附錄B。4.2鑒定圃準(zhǔn)備4.2.1鑒定圃設(shè)置鑒定圃應(yīng)具備良好的自然發(fā)病環(huán)境。2DB21/T2219.7—XXXX4.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)鑒定材料隨機(jī)排列或順序排列。在進(jìn)行選育品種抗病性鑒定時(shí)，每30行鑒定材料設(shè)1組已知抗病和感病對(duì)照材料（見附錄C）。在進(jìn)行種質(zhì)資源抗病性鑒定時(shí)，每50行鑒定材料設(shè)1組已知抗病和感病對(duì)照材料，鑒定圃周邊應(yīng)設(shè)置保護(hù)行。鑒定圃應(yīng)具備良好的自然發(fā)病環(huán)境和排灌設(shè)施。4.2.3種植要求鑒定材料播種時(shí)間與生產(chǎn)播種時(shí)間相同。鑒定小區(qū)行長5m，行距0.6m，條播或穴播，每行保苗21株，低于13株時(shí)視為該品種/材料鑒定無效。鑒定種質(zhì)資源時(shí)，每份鑒定材料種植1行；鑒定選育品種時(shí)，每份材料種植2行。土壤肥力水平和耕作管理與大田生產(chǎn)相同。5接種5.1接種時(shí)期接種時(shí)期為果穗吐絲后14d～21d，接種可全天進(jìn)行。5.2接種方法宜采用籽粒傷口接種法。用側(cè)孔空心金屬針連接有注射接種液的器具在雌穗中上部苞葉外進(jìn)行穿刺，當(dāng)金屬針刺入籽粒時(shí)，注射2mL接種液，每株僅接種第1個(gè)雌穗。5.3接種前后的田間管理接種后對(duì)鑒定圃進(jìn)行常規(guī)田間管理。6調(diào)查6.1調(diào)查時(shí)間在玉米生理成熟后進(jìn)行調(diào)查，同批次接種材料應(yīng)在同一天完成。6.2調(diào)查方法采收接種的雌穗，去除苞葉后逐穗調(diào)查并對(duì)雌穗籽粒被病菌侵染的面積進(jìn)行分級(jí)記載，見表1。表1玉米青霉穗腐病田間調(diào)查結(jié)果表12346.3病情分級(jí)依據(jù)表2中的描述，逐個(gè)記載調(diào)查雌穗的發(fā)病級(jí)別。3DB21/T2219.7—XXXX表2玉米對(duì)穗腐病抗性鑒定的病情級(jí)別劃分13579注：發(fā)病面積占雌穗總面積比例以A表示。7評(píng)價(jià)7.1鑒定有效性判別當(dāng)設(shè)置的感病對(duì)照材料平均病情級(jí)別≥5.6時(shí)，該批次鑒定視為有效。7.2抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算每份鑒定材料雌穗的平均病情級(jí)別，并依據(jù)平均級(jí)別確定該鑒定材料對(duì)穗腐病的抗性，抗性的劃分標(biāo)準(zhǔn)見表3。表3玉米對(duì)青霉穗腐病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)注：平均病情級(jí)別以D表示。7.3重復(fù)鑒定若鑒定材料初次鑒定時(shí)表現(xiàn)為高抗、抗、中抗，應(yīng)在次年進(jìn)行重復(fù)鑒定。7.4抗性評(píng)價(jià)對(duì)初次鑒定結(jié)果和重復(fù)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，以記載的最高病情級(jí)別為最終鑒定結(jié)果，并依此結(jié)果對(duì)鑒定材料進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。8鑒定結(jié)果匯總玉米抗青霉穗腐病鑒定結(jié)果整理后填入鑒定結(jié)果表格，見圖1。4DB21/T2219.7—XXXX圖1玉米抗青霉穗腐病鑒定結(jié)果匯總表樣式圖5DB21/T2219.7—XXXX（資料性）玉米青霉穗腐病病原菌A.1青霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定引起玉米青霉穗腐病的主要致病菌為青霉屬真菌。無性態(tài)學(xué)名：青霉屬(Pennicilliumsp.)青霉屬真菌無性態(tài)特征：病菌菌落灰綠色，圓形，平坦，質(zhì)地絨狀，分生孢子易脫落。分生孢子梗直立，頂端一次至多次分支，形成掃帚狀，長約400μm，分生孢子橢圓形或長圓形，無色，單孢，直徑3.5μm～5.0μm。A.2青霉菌的分子鑒定對(duì)青霉菌脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid，DNA）中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTranscribedSpacer，ITS）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測序和比對(duì)，確定種的分類地位。PCR反應(yīng)體系：擴(kuò)增的引物為真菌的通用引物：PCR反應(yīng)體系（25μL）：上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA（100ng/μL）1μL，2×TaqPCRmix12.5μL，ddH2O9.5μL。PCR擴(kuò)增引物見表A.1。表A.1PCR擴(kuò)增引物6DB21/T2219.7—XXXX（資料性）青霉菌培養(yǎng)基配方B.1PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g～20g，蒸餾水1000mL。分裝在三角瓶中后121℃高壓滅菌20min后備用。PDA培養(yǎng)基用于青霉菌生長培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃。B.2PD培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。分裝在三角瓶中（500mL三角瓶中分裝150mL），121℃高壓滅菌20min后備用。PD培養(yǎng)基用于青霉菌的菌絲培養(yǎng)（用于病菌DNA提?。┖?/p>