芳香中藥揮發(fā)性單體配方的制劑工藝及體外抗流感病毒藥效研究

目錄TOC\o"1-4"\h\u6771摘要 摘要流行性感冒是流感病毒引發(fā)的一種呼吸道疾病，每年因?yàn)楦腥玖鞲胁《径鸬纳虾粑兰膊』颊呷藬?shù)眾多，其癥狀可以從輕微的上呼吸道炎癥到誘發(fā)急性肺炎甚至死亡。近年來，中醫(yī)藥在防治流感方面發(fā)揮出了獨(dú)特的優(yōu)勢，被認(rèn)為是抗流感病毒的優(yōu)良策略。中藥在抑制病毒復(fù)制、增強(qiáng)機(jī)體免疫、減少藥物耐藥性等方面效果良好，豐富了治療手段。目前，用于抗流感病毒的一線藥物存在副作用、病毒耐藥性、限制使用人群等問題，因此，尋找新的治療策略或研發(fā)優(yōu)良的抗病毒藥物來解決病毒耐藥性等問題是臨床需要解決的重要問題。芳香類中藥中的揮發(fā)性成分是其發(fā)揮藥效的是中藥成分，課題組經(jīng)前期研究，從28個(gè)抗疫經(jīng)典名方中篩選出40味芳香中藥，并從中挑選出60種單體成分進(jìn)行篩選，最終篩選出桉油精、百秋里醇、香荊芥酚和對傘花烴四種揮發(fā)性單體成分，并通過中醫(yī)藥理論指導(dǎo)，為單體成分賦予中藥藥性，進(jìn)行了中藥配伍研究，形成了具有理論支持的單體配方。本課題以四種揮發(fā)性單體成分為研究對象，進(jìn)行抗流感病毒的體外實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選單體給藥濃度，以最優(yōu)濃度進(jìn)行配伍探討其增效作用，并對單體配伍創(chuàng)新藥的初步制劑工藝進(jìn)行研究。（1）研究芳香中藥揮發(fā)性單體成分及配方抗流感病毒株A/PR/8/34（H1N1）的體外藥效。（2）探究芳香中藥單體配伍創(chuàng)新藥（軟膠囊）的初步制劑工藝。以流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染MDCK細(xì)胞構(gòu)建體外細(xì)胞病毒感染模型，采用Reed-Muench法和CPE法計(jì)算流感病毒組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）；采用CCK8法分別測定藥物的細(xì)胞毒性和對病毒復(fù)制的抑制情況，并計(jì)算藥物的治療指數(shù)（TI），流動(dòng)性、混合均勻度、沉降體積比為指標(biāo)，優(yōu)選軟膠囊內(nèi)容物的處方工藝，并制備揮發(fā)性單體成分軟膠囊。A/PR/8/34(H1N1)，桉油精、百秋里醇、對傘花烴、香荊芥酚、配伍含對傘花烴與不含對傘花烴的IC50分別為：24.09μM、29.22μM、182.8μM、36.7μM、150.3μM、57.16μM；TI分別為：9.63、4.77、1.35、9.64、1.29、25.75。揮發(fā)性單體成分與配方均具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用且都能夠凝集雞紅細(xì)胞。桉油精、百秋里醇和香荊芥酚具有明顯的抗流感病毒活性；配伍后，桉油精、百秋里醇和香荊芥酚三種單體的配方抗流感病毒活性明顯且具有降低藥物毒性作用，三種單體的配方具有降低藥物毒性作用，但其抗流感病毒活性較低。（2）確定軟膠囊分散介質(zhì)為大豆油，分散介質(zhì)與藥物用量比為1：1時(shí)軟膠囊內(nèi)容物均勻性、流動(dòng)性與沉降體積比良好。甲型H1N1流感病毒ABSTRACT1BackgroundInfluenza,causedbyinfluenzavirus,isarespiratorydiseaseandishighlycontagious.Eachyear,influenzavirusescausealargenumberofpatientswithupperrespiratorytractinfections,whosesymptomscanrangefrommildupperrespiratorytractinflammationtoacutepneumoniaandevendeath.Inrecentyears,traditionalChinesemedicinehasplayedacrucialroleinpreventingandtreatingofinfluenzavirus.TraditionalChinesemedicinehasbeeneffectiveininhibitingvirusreplication,enhancingimmunityandreducingdrugresistance,andhasenrichedthetreatmentmeans,whichisregardedasanexcellentstrategyagainstinfluenzavirus.Atpresent,thefirst-linedrugsusedforanti-influenzavirushavesomeproblemssuchasviralresistance,sideeffectsandlimiteduseofthepopulation.Therefore,findingnewtreatmentstrategiesordevelopingexcellentantiviraldrugstosolvetheproblemsofviralresistanceisanimportantclinicalproblemtobesolved.AromaticvolatileingredientsoftraditionalChinesemedicineistheefficacyoftraditionalChinesemedicineingredients,groupthroughpreliminaryresearch,from28classicdiseaseresistanceprescriptionselected40aromaticChinesemedicine,andpickout60kindsofmonomercomponentscreening,finallyselectedeucalyptusoilessence,theautumnalcohol,mustardandumbrellaHfourvolatilemonomercomponents,andthroughthetheoryoftraditionalChinesemedicine,monomercomponentgivesChinesemedicine,traditionalChinesemedicinecompatibilityresearch,formedthemonomerformula.Thispapertakesfourvolatilemonomercomponentsastheresearchobject,conductsinvitroexperimentsonanti-influenzavirus,selectsthemonomerdeliveryconcentration,discussestheefficiencyeffectwiththeoptimalconcentration,andstudiesthepreliminarypreparationprocessofmonomercompatibilityandinnovativedrugs.2ObjectiveTostudythetherapeuticefficacyofaromaticChinesemedicinevolatileoilmonomeranditscombinationagainstinfluenzavirusstrainA/PR/8/34（H1N1）.Theformulationwasoptimizedforthecompatibilityofmonomercomponents,andthepreliminarypreparationprocessoftheinnovativedrug(softcapsule)forthecompatibilityofaromatictraditionalChinesemedicinemonomeragainstinfluenzaviruswascarriedout.3Methods(1)EffectsofvolatilemonomersofaromaticChinesemedicineandtheirformulationsagainstinfluenzavirusinvitro.MDCKcellsinfectedwithinfluenzavirusA/PR/8/34(H1N1)wereusedtoconstructaninvitrocytoviralinfectionmodel,andthehalfinfectionvolumeofinfluenzavirustissuecells(TCID50)wascalculatedbyReed-MuenchandCPEmethods.ThecytotoxicityandinhibitionofviralreplicationofthedrugweredeterminedbyCCK8method,andthetherapeuticindex(TI)ofthedrugwascalculated.TheinhibitoryeffectofthedrugontheviruswasdeterminedbyerythrocyteagglutinationinhibitionassayandneuraminidaseNAlevel.(2)Studyonthepreparationtechnologyofsoftcapsuleswithvolatilemonomercomponents.Themixinguniformity,volumesettlementratio,redispersibilityandfluidityofsoftcapsulewereusedasindexestooptimizetheformulationprocessofsoftcapsulecontents.4ContentsStudyontheefficacyofvolatileoilcomponentsagainstinfluenzavirusinvitro.Studyonthepreliminarypreparationtechnologyofmonomerformulationinnovativedrugs.5Results(1)EffectsofvolatilemonomersofaromaticChinesemedicineandtheirformulationsagainstinfluenzavirusinvitro.ThevolatilemonomercompositionandformulacaninhibitinfluenzaA/PR/8/34(H1N1)virus,andtheIC50ofcineole,thymol,p-cymene,echinocanol,andblendswithandwithoutp-cymeneare:24.09μM、29.22μM、182.8μM、36.7μM、150.3μM、57.16μM;TIwas9.63、4.77、1.35、9.64、1.29、25.75respectively.Eucalyptol,becurieolandNepetalolshowedobviousactivityagainstinfluenzavirus.Afterthecombination,thethreemonomersofeucalyptol,becurieolandNepetadiolshowedobviousactivityagainstinfluenzavirusBothvolatilemonomercomponentsandformulationshaveneuraminidaseinhibitionandcanagglutinatechickenredbloodcells.(2)Studyonthepreparationtechnologyofsoftcapsuleswithvolatilemonomercomponents.Thedispersingmediumofsoftcapsulewasdeterminedtobesoybeanoil.Whenthedispersingmediumanddrugdosageratiowas1:1,theuniformity,fluidityandsedimentationvolumeratioofsoftcapsulecontentsweregood.Keywords:Monomformula;AromaticChinesemedicine;Volatilemonomer;AH1N1influenzavirus;Softcapsulepreparation

文獻(xiàn)綜述流行性感冒（簡稱流感）是一類傳染性疾病，其發(fā)病率高且有極強(qiáng)的傳染性，已成為全球的公共衛(wèi)生問題[1]。根據(jù)報(bào)道，全球每年約有7.6~5.2億人感染流感病毒，成人約有5%~10%的發(fā)病率，其中重癥病例的患病率為3%~5%[2-3]。在我國，春季、冬季為流感高發(fā)期，近年來，在新冠疫情的背景下，防護(hù)意識(shí)與疫苗接種意識(shí)的提高等因素使流感的患病率降低[4]，但防控仍需加強(qiáng)。1流行性感冒的研究現(xiàn)狀流行性感冒持續(xù)存在的原因有二，一是流感病毒表面糖蛋白中的抗原持續(xù)漂移，二是偶發(fā)性的抗原轉(zhuǎn)移[5]，而新毒株與已有的毒株相比，其抗原性不同，人體對其缺乏相應(yīng)的免疫力，因而導(dǎo)致高感染率和致死率[6]。流感病毒病原學(xué)流感病毒是一種由8個(gè)片段基因組構(gòu)成的單股負(fù)鏈RNA病毒[7]。流感病毒的結(jié)構(gòu)從里到外可以分成三部分，第一部分是核衣殼，也就是核糖核蛋白體（RNP），它是由單股負(fù)鏈的RNA和核蛋白構(gòu)成的；第二部分是內(nèi)膜，它的主要組成成分是M1，M1是流感病毒的基本骨架，可以保護(hù)核衣殼，維持病毒的空間結(jié)構(gòu)，也可以維持病毒核糖核蛋白體在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的正常傳遞，對病毒的成熟起到調(diào)控作用[8]；第三部分是外膜，它是由宿主的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化而成，它是一層由磷脂雙分子層組成的類脂質(zhì)囊膜，在囊膜上鑲嵌著三種蛋白，即血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）和基質(zhì)蛋白（M2）[8]。HA能夠與宿主唾液酸受體特異性結(jié)合[9]，而NA能夠抑制唾液酸對病毒的侵染[10]。流感病毒中甲型（A型）病毒是最常見的類型A型病毒因?yàn)镠A和NA抗原性不穩(wěn)定，變異性高，又分為不同的亞型，其中包括H1N1、H2N2、H3N2等[11]。流感的疾病發(fā)展規(guī)律流感病毒進(jìn)入人體后會(huì)在上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)散。流感病毒的表面的兩種蛋白質(zhì)HA和NA。其中，HA可以結(jié)合上皮細(xì)胞表面的糖分子，并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；新生的病毒粒子從細(xì)胞表面釋放出來的過程有NA協(xié)助完成。病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它會(huì)利用細(xì)胞的機(jī)制，通過一系列復(fù)制步驟產(chǎn)生新的病毒基因組。這個(gè)過程需要一些特殊的酶和蛋白質(zhì)，通常被稱為病毒剪接酶和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）。一旦新的病毒基因組形成，它們將與其他病毒蛋白質(zhì)結(jié)合形成完整的病毒粒子。在這個(gè)過程中，病毒會(huì)不斷地攻擊和殺死上皮細(xì)胞，并釋放大量的病毒粒子。這些粒子能夠通過呼吸道和眼睛進(jìn)入其他人的體內(nèi)，從而引發(fā)流感疾病的傳播。除了攻擊上皮細(xì)胞外，流感病毒還可以激活免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)。這些反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致體溫升高、咳嗽、鼻塞等癥狀，為病毒傳播提供了更多機(jī)會(huì)。1.3抗流感病毒藥物的研究進(jìn)展預(yù)防流感有兩種方法，一種是接種疫苗，另一種是服用抗流感藥物[8]。然而，目前的疫苗并不能有效地解決所有的病毒，而且流感病毒的亞型很多、變化率很高，這就要求相應(yīng)的疫苗要不斷地更新[12]。1.3.1化藥抗流感病毒藥物的研究進(jìn)展流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制經(jīng)歷了黏附、內(nèi)吞、脫殼、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、包裝、出芽、釋放等過程[13]，目前，用于抗流感病毒的化藥主要以病毒復(fù)制過程中的必需蛋白為靶點(diǎn)來抗流感病毒，故可分為以下四類：（1）靶向HA的抗流行性感冒藥HA是由流感病毒RNA的第4個(gè)片段編碼的一種蛋白質(zhì)。HA有兩個(gè)亞基，分別是HA1和HA2，它們在寄主的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被病毒的遺傳物質(zhì)引導(dǎo)下合成為前體，然后被蛋白酶催化形成成熟體[14]。此種藥有兩類：阻斷HA1識(shí)別并吸附宿主細(xì)胞的抑制劑，以唾液酸和呱嗪二酮吲哚生物堿為代表；阻斷HA2參與的病毒核心釋放過程的抑制劑，以阿比多爾為代表[15-16]。（2）以NA為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物代表藥物為奧司他韋和扎那米偉，奧司他韋是基于扎那米韋而發(fā)展起來的新一代藥物，它的口服生物利用度比扎那米韋高。但是，由于NA的氨基酸位點(diǎn)突變率很高，針對NA的藥物很容易發(fā)生耐藥性，WHO的調(diào)查顯示，目前大多數(shù)流感病毒都對奧司他韋有了耐藥性[17]。（3）以M2為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物M2離子通道蛋白能夠協(xié)助病毒釋放基因組RNA，從而引起宿主細(xì)胞的感染[18]。M2蛋白的功能是調(diào)節(jié)病毒顆粒內(nèi)部和外部之間的質(zhì)子平衡，以促進(jìn)病毒復(fù)制。M2蛋白形成了一個(gè)離子通道，可以調(diào)節(jié)病毒顆粒內(nèi)外的質(zhì)子濃度差異。當(dāng)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，M2蛋白會(huì)在低pH值環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致離子通道開放，從而使得質(zhì)子可以從外部進(jìn)入病毒顆粒內(nèi)部。這個(gè)過程對于病毒的復(fù)制非常關(guān)鍵，因?yàn)橘|(zhì)子梯度可以催化病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。代表藥物為金剛烷胺和金剛乙胺以RNA聚合酶為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物這種藥物主要是通過對病毒內(nèi)的聚合酶活性進(jìn)行抑制，進(jìn)而對病毒RNA的合成以及病毒復(fù)制產(chǎn)生影響[19]。在臨床上，聚合酶抑制劑對不同種類的流感病毒有不同的抑制作用，其中，聚合酶抑制劑對A型流感病毒的抑制作用比較好，而對B型流感病毒的抑制作用比較弱[20]。代表藥物有巴韋林等。1.3.2中藥抗流感病毒藥物的研究進(jìn)展中藥通過直接和間接兩種方式發(fā)揮抗流感病毒作用[21]。間接抑制流感病毒：例如，柴胡等[22]中藥可以促進(jìn)體內(nèi)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，并將其激活，利用巨噬細(xì)胞吞噬外源病毒，從而達(dá)到殺傷病毒的效果。通過強(qiáng)化網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能，提高身體的體液免疫能力，發(fā)揮自身免疫系統(tǒng)的作用，從而達(dá)到殺傷病毒的目的。直接抑制流感病毒：中藥是以病毒的吸附寄主細(xì)胞或病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制為切入點(diǎn)，通過中藥中的有效成分來抑制流感病毒的復(fù)制，從而達(dá)到預(yù)防和治療流感的效果。當(dāng)前，中藥抗病毒的研究采用了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究方法，在中藥中尋找到了可以發(fā)揮抗病毒作用的有效成分，其重點(diǎn)集中在中藥復(fù)方、中成藥、單味藥、中藥提取物等方面[23]。單味藥可直接抗病毒如下：板藍(lán)根板藍(lán)根系十字花科植物菘藍(lán)的根，能夠清熱解毒、涼血。張大志等人[24]用離體雞胚培養(yǎng)方法，研究了不同濃度提取物抗流感病毒活性，結(jié)果顯示板藍(lán)根提取物A科有效抑制流感病毒。野菊花為臨床上常見的一種抑菌、抗病毒藥，具有很好的抗流感病毒作用。細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，野菊花水提取液1:1024和揮發(fā)油1:8190對10TCID流感病毒誘導(dǎo)的CPE有明顯的抑制作用[25]。廣藿香為唇形科植物廣蓄香（Pogostemoncablin）的干燥地上部，具有較高的藥用價(jià)值。通過構(gòu)建流行性感冒動(dòng)物模型，將肺指數(shù)和死亡保護(hù)率作為指標(biāo)，對三種提取部位的體內(nèi)抗流感病毒FM1的作用進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)其二氧化碳超臨界提取部位具有顯著的體內(nèi)抗流感病毒效果[26]。魚腥草為三白草科植物蕺菜Houuuyniacordate的干燥全草。王健等[27]人實(shí)驗(yàn)證實(shí)魚腥草不同部位揮發(fā)油對流感病毒均有抑制作用。楊慧等[28]實(shí)驗(yàn)證明魚腥草能阻斷甲1型流感病毒誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡。此外，黃芩、金銀花等單味中藥也具有直接抗病毒作用[29-30]。2芳香中藥及其揮發(fā)性成分的抗流感病毒研究現(xiàn)狀2.1芳香中藥防治疫病歷史溯源及應(yīng)用芳香中藥是指氣味芳香，以味辛性溫為主，多以揮發(fā)性成分為有效成分的中藥。具有辟穢防疫、解表散邪、化濕去濁、健脾和胃等作用，主歸脾、肺、胃經(jīng)[31]。先秦時(shí)期，已有用蒼術(shù)、丁香、艾葉、白芷、降香、木香、硫磺、石菖蒲煙熏來“避穢驅(qū)邪”的目的?！渡胶＝?jīng)》中有“熏香……佩之可以已癘”；《中藏經(jīng)》中說“丁香花、檀香、麝香等”被用來制作成香囊來預(yù)防疾病[32]。香薰和佩戴的方法一直沿用到現(xiàn)在。芳香中藥防疫抗病毒的中醫(yī)理論基礎(chǔ)流感屬于西醫(yī)病名，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中無流感的病名，通常以“瘟疫”，“疫病”，“時(shí)行”等名稱出現(xiàn)?！端貑枴肥紫忍岢隽送飧袩岵∮杀砣肜铩⒂扇柸肴幍牧?jīng)傳遍規(guī)律及各階段不同的癥狀體征?！秱摗吩诖嘶A(chǔ)上，結(jié)合臟腑陰陽氣血等理論，創(chuàng)立了六經(jīng)辨證體系[33]。流感臨床表現(xiàn)多與六經(jīng)辨證中的三陽病一致。具體而言，單純型流感初期多表現(xiàn)為發(fā)熱畏寒、無汗，與太陽表寒證類似；若邪入半表半里，邪正交爭，往來寒熱者，為少陽證表現(xiàn)；單純型流感極期或中毒型流感表現(xiàn)為高熱惡熱、自汗出、不惡寒，與化熱入里的陽明實(shí)熱證相仿[34]；若病邪入太陰，則表現(xiàn)為吐利、腹?jié)M而痛；若表現(xiàn)為無熱惡寒、手足厥冷、脈沉微，與少陰證相似；邪入厥陰，可表現(xiàn)為消渴、寒熱錯(cuò)雜；然太陰、厥陰多為雜病，而少陰符合流感重癥表現(xiàn)，已不能單用中醫(yī)辨證治療[35]。2.1.2芳香中藥的應(yīng)用歷史及應(yīng)用現(xiàn)狀殷商時(shí)期人們?yōu)榱祟A(yù)防疾病，將帶有芳香氣味的藥物燒熏或做成香囊佩戴。葛洪（晉代）在其《肘后備急方》中記有“密以艾灸病人床四角”，其大意為在病榻四個(gè)角落用艾灸熏香，提出了用熏艾來預(yù)防疫病傳播；在《治瘴氣疫癘溫毒諸方》中記載的老君神明白散、度瘴散和赤散方中，也多含有芳香類中藥如肉桂、白術(shù)、細(xì)辛等[36]。在宋代至金元時(shí)期，芳香類中藥用于防疫的作用被廣泛發(fā)展?！短交菝窈蛣┚址健芬粫杏涊d的多個(gè)防疫方中多含有柴胡、白術(shù)、蒼術(shù)、藿香等芳香類中藥。明清時(shí)期關(guān)于疫病的理論探討以及防疫方藥的記載逐漸增多。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中也有關(guān)于熏燒芳香中藥如蘇合香、沉香、降真香等用來防治疫病的記載。芳香中藥在現(xiàn)代治療病毒性疾病中也發(fā)揮著重要作用。在新冠肺炎疫情期間，總結(jié)全國各省區(qū)中醫(yī)藥治療新冠肺炎的診療方案用藥規(guī)律，芳香中藥均占據(jù)重要地位；總結(jié)全國各省區(qū)中醫(yī)藥治療新冠肺炎的診療方案用藥規(guī)律，芳香中藥均占據(jù)重要地位[37]。2.2芳香中藥抗病毒的藥理活性現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，芳香中藥具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用，所含揮發(fā)性成分為主要有效成分，通過調(diào)控促炎、抗炎因子的產(chǎn)生，相互協(xié)調(diào)達(dá)到保護(hù)機(jī)體、治療炎癥的作用[38]。2.3芳香中藥抗病毒的藥效研究具有抗病毒作用的復(fù)方或中成藥：（1）宣肺解毒顆粒史利卿等人[39]發(fā)現(xiàn)，該藥能明顯降低FM1型流感病毒感染后的小鼠肺指數(shù)，減少血凝，提高小鼠的存活率。在FM1型流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺炎模型中，IL-2含量顯著下降，而宣肺解毒顆?？商岣逫L-2含量。（2）葛根湯王新汝等[40]研究發(fā)現(xiàn)，葛根湯能夠明顯減輕甲型流感病毒引起的肺組織損害，在體內(nèi)發(fā)揮確切的抗流感病毒療效。耿子凱等[41]研究發(fā)現(xiàn)，葛根湯水提物能夠顯著抑制甲型H1N1流感病毒造成的細(xì)胞的病變，葛根湯可延遲病毒生長動(dòng)力學(xué)，進(jìn)而推遲病毒生長平臺(tái)期的到來。（3）抗病毒顆粒誠光等[42]實(shí)驗(yàn)表明，該藥可以明顯地延長甲1型流感病毒FM1株感染小鼠的平均存活時(shí)間和存活率，對FM1株感染小鼠的肺指數(shù)也有顯著的抑制作用，這表明了抗病毒顆粒有抗流感病毒效果。2.4芳香中藥揮發(fā)性單體成分抗病毒的藥效研究多數(shù)中藥揮發(fā)性成分單體是芳香中藥發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)，具有抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。舉例揮發(fā)性單體成分：（1）百秋里醇研究發(fā)現(xiàn)廣藿香油中的百秋李醇單體具有體內(nèi)抗H1N1流感病毒作用，并可增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，減弱全身和肺部炎癥反應(yīng)[43]。（2）肉桂醛研究表明[44]，肉桂醛對流感病毒的抗病毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肉桂醛能夠顯著抑制病毒復(fù)制和感染，可能是通過打斷病毒RNA聚合酶和核蛋白之間的相互作用及減少細(xì)胞內(nèi)核蛋白水平來發(fā)揮作用的。（3）蒼術(shù)酮ChengD.等[45]研究表明蒼術(shù)酮及其類似物的抗腫瘤和抗病毒作用，包括對人類乙型肝炎病毒、流感病毒等的抑制作用。（4）對傘花烴YuY.等[46]評估了從金絲桃的空中部分提取物中分離出的化合物對流感病毒的抗病毒活性，并發(fā)現(xiàn)其主要成分為傘花烴和異巖菖蒲苷。結(jié)果顯示，這些化合物能夠顯著抑制病毒復(fù)制和感染。（5）丁香酚WangG.等[47]研究多種中藥提取物對不同亞型流感病毒的抗病毒效果，發(fā)現(xiàn)丁香酚具有很好的抗病毒活性，能夠抑制不同亞型的流感病毒。（6）桉油精CermelliC.等[48]發(fā)現(xiàn)桉油精對不同呼吸道病原微生物的抑制效果，能夠有效抑制多種細(xì)菌和病毒包括流感病毒。（7）香荊芥酚YangL.等[49]研究多種中藥材對不同病毒的抗病毒活性，包括丁香、肉桂、香荊芥等。結(jié)果顯示，香荊芥酚精能夠抑制甲型流感病毒的復(fù)制和感染。3單體配伍理論研究課題組以新中藥為研究的主要方向，對靈芝孢子、霍山石斛、阿薩伊與瑪咖等40多種中藥新品種、新外來中藥進(jìn)行了藥性研究，構(gòu)建了研究范式，對中醫(yī)藥品種的豐富起到了推動(dòng)和示范作用，建立了中醫(yī)藥研究的新方法，開辟了新方向。此外，《中藥新家族——化學(xué)中藥》一書中，作者提出“化學(xué)中藥”的概念，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下應(yīng)用的化學(xué)藥物，開展化學(xué)中藥研究能夠發(fā)展中醫(yī)藥理論、增加中藥藥用資源，完善中藥用藥規(guī)范[50]，應(yīng)用中醫(yī)藥的術(shù)語對常用的化學(xué)藥物進(jìn)行中醫(yī)藥特性表述。如阿司匹林，“用于外感發(fā)熱，頭痛身疼。本品芳香疏散，功善發(fā)汗解表、祛風(fēng)退熱止痛”；“布洛芬，芳香行散”，“四環(huán)素，清熱燥濕，避穢泄?jié)幔糜诨魜y”，可以看出化學(xué)中藥中也可被賦予芳香藥性，能夠用于治療傳染性疾病。本課題組前期對國外天然植物資源的中藥化進(jìn)行研究，逐漸形成具有中醫(yī)藥原創(chuàng)特色的新研究模式和領(lǐng)域，探索出了中藥藥性系統(tǒng)研究方法[51]，即“文獻(xiàn)研究→理論推導(dǎo)→實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證→實(shí)踐應(yīng)用”四步法。在此基礎(chǔ)上，課題組結(jié)合中藥藥性理論，賦予百秋李醇、香荊芥酚、對傘花烴、桉油精四種揮發(fā)性單體成分中藥藥性，為揮發(fā)性單體成分配伍奠定初步的理論基礎(chǔ)。賦予百秋李醇中藥藥性，其性溫味辛，入肺經(jīng)散肺經(jīng)之邪氣，具有芳香化濁，解疫毒、抗疫病之效，為君藥；賦予香荊芥酚中藥藥性，其性涼味辛，有芳香化濕解表、健脾和胃、補(bǔ)腎益精的功效，為臣藥；賦予對傘花烴中藥藥性，其性溫，味辛、苦，入肺、腎經(jīng)，具有芳香辟穢，止咳平喘，化濁降脂之效，為佐藥；賦予桉油精中藥藥性，其味辛性溫，具有芳香辟穢、止咳化痰、止痛之功，入脾胃經(jīng)，可用于治療脘痞、泄瀉等癥，為使藥。四藥配伍，共奏芳香化濕，解毒防疫，健脾和胃之效，用于病毒性肺炎所致的胸悶咳嗽、喘促乏力、鼻塞、流涕、惡心嘔吐等癥。4中藥揮發(fā)性成分制劑研究進(jìn)展4.1中藥揮發(fā)性成分給藥方法口服給藥口服用藥是目前常用且便捷的給藥方式。王賽君等[52]通對我國中成藥數(shù)據(jù)庫中的揮發(fā)油使用情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，以口服為主的中成藥所占的比重最大，其劑型主要有片劑，散劑，顆粒劑，丸劑，內(nèi)服液體制劑等。經(jīng)皮給藥目前中藥精油經(jīng)皮給藥新劑型研究集中在微納米乳、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、脂質(zhì)體等。有研究開發(fā)裝載迷迭香、薰衣草和牛至混合精油的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，與克霉唑的聯(lián)合給藥，研究結(jié)果表明兩者潛在協(xié)同作用提高了后者抗念珠菌病的治療效果[53]。透皮用藥研究表明揮發(fā)油可有效透過皮膚的外層屏障——角質(zhì)層而被人體吸收，崔利利等[54]考察3種揮發(fā)油（干姜、辛夷、蓽橙茄）和氮酮，通過不同的比例混合，考察羅通定的促透作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單一揮發(fā)油相比，混合揮發(fā)油有較好的促滲性。鼻腔給藥已知的兩種藥物鼻腔給藥途徑，一種是鼻黏膜血液循環(huán)吸收，另一種是鼻腦通路[55]，呼吸區(qū)最大，含有豐富的毛細(xì)血管；嗅區(qū)在解剖學(xué)上位于上鼻甲和相應(yīng)的鼻中隔的黏膜之間，靠近篩板，靠近頭蓋骨，藥物通過這個(gè)途徑被吸收到顱內(nèi)[56]。4.2中藥揮發(fā)性成分制劑研究中藥揮發(fā)油的物理化學(xué)性質(zhì)并不穩(wěn)定，所以相關(guān)制劑的研究非常困難。在對芳香類中藥揮發(fā)油進(jìn)行提取分離和產(chǎn)品研制的過程中，新技術(shù)新方法的運(yùn)用為中藥揮發(fā)油相關(guān)制劑的研究與開發(fā)提供了技術(shù)支撐[57]。中藥揮發(fā)油新型制劑具體有：滴丸、軟膠囊、微乳與微乳凝膠膏劑、微球、脂質(zhì)體、聚合物膠束和包合物等[58]。滴丸吸收迅快、生物利用度高，可提高患者的用藥依從性[59]。軟膠囊軟膠囊具有不需要黏合劑，崩解速度更快；有效防止藥物受濕度和空氣中氧氣、光線的影響，從而提高藥物的穩(wěn)定性的優(yōu)勢[60]。微乳與微乳凝膠膏劑將揮發(fā)油制成乳劑，可解決揮發(fā)油不溶于水、液體制劑質(zhì)量不均一等問題[61]。脂質(zhì)體脂質(zhì)體是一種微囊，它由一種脂質(zhì)雙分子層包裹著藥物而成，它的特點(diǎn)是裝載了一種靶向輸送的藥物，可以延長藥效，降低副作用，改變給藥途徑[62]。滴丸雖易于制備和服用，能夠提高藥物的口感，但具有一定的溶解度限制，藥效不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)服用完畢。微乳與微乳凝膠膏劑具有良好的滲透性，藥物的吸收效率和生物利用度高但其制備過程相對復(fù)雜，難以控制藥物的釋放速率和劑量。脂質(zhì)體藥效相對較為穩(wěn)定，能夠提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性，其制備成本相對較高，穩(wěn)定性和溶解度也存在一定限制，需要避免溫度、pH值等因素的影響。而軟膠囊便于攜帶和儲(chǔ)存，生物利用度高，吸收率高且藥效穩(wěn)定，同時(shí)可以避免口感問題，故制備軟膠囊具有相對優(yōu)勢。4.3中藥揮發(fā)性成分軟膠囊制備方法研究進(jìn)展過去，為了將具有揮發(fā)性成分的藥物制作成藥劑，通常都要經(jīng)過吸附和固化等工序。因?yàn)樵谂渲频倪^程中，需要進(jìn)行加熱，所以揮發(fā)性成分很容易從輔料中逃逸出來，這會(huì)導(dǎo)致藥量的損失，從而影響到藥劑的效果。此外，如果添加輔料，還會(huì)使制劑的體積變大。而軟膠囊可避免上述問題，且軟膠囊劑的體積小，便于攜帶。中藥揮發(fā)油軟膠囊是一種將中草藥的揮發(fā)性成分以軟膠囊的形式封裝，方便服用和吸收的制劑。幾種常見的中藥揮發(fā)油軟膠囊制備方法有：直接封裝法：直接封裝法是另一種常見的中藥揮發(fā)油軟膠囊制備方法。朱婷婷[63]等人利用直接封裝法制備香薷揮發(fā)油軟膠囊，該方法直接將中草藥揮發(fā)油填充到軟膠囊中，不需要添加任何載體或其他材料。此方法制備過程簡單，但由于揮發(fā)油密度較大，易產(chǎn)生氧化或變質(zhì)，影響其質(zhì)量和療效。因此在制備過程中需要注意保證揮發(fā)油的質(zhì)量和新鮮度。微膠囊法：微膠囊法是中藥揮發(fā)油軟膠囊制備的一種新興方法。周耀等[64]用此方法制備白芷軟膠囊，將中草藥揮發(fā)油包裹在膠囊殼體內(nèi)，在體內(nèi)自然釋放。相比于傳統(tǒng)的制備方法，該方法能夠更好地保持揮發(fā)油的活性和穩(wěn)定性，并且有較好的控釋能力。微膠囊法制備過程中，首先將中藥揮發(fā)油混合到適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將混合物加入到膠囊殼體內(nèi)，并通過冷凍干燥等工藝制備出微膠囊。微膠囊制備過程復(fù)雜，但能夠獲得更為優(yōu)異的制劑性質(zhì)。

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前言中藥揮發(fā)油是芳香中藥的特色表現(xiàn)形式，具有較強(qiáng)的生物活性，療效確切[5]。中醫(yī)將流行性感冒歸于“時(shí)疫”，“風(fēng)溫”等范疇。在抗流感病毒的臨床治療中芳香中藥療效突出[6]，加強(qiáng)對芳香中藥中揮發(fā)性成分的研究，對于防治流感病毒、研發(fā)新藥具有重要啟示。因此，本課題將對芳香中藥揮發(fā)性單體成分進(jìn)行研究。本課題組經(jīng)前期研究，從經(jīng)典抗疫名方及臨床常用方中篩選出了芳香中藥揮發(fā)性單體成分，并對已篩選出的揮發(fā)性單體成分賦予中藥藥性，建立配伍理論依據(jù)；進(jìn)行抗流感病毒的體外實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選單體抗流感病毒最優(yōu)濃度，并進(jìn)行合理配伍探討其增效作用，對單體配伍創(chuàng)新藥的初步制劑工藝進(jìn)行研究。中藥揮發(fā)性成分單體在抗病毒方面發(fā)揮重要作用，現(xiàn)代研究表明百秋李醇具有抗病毒作用[7-8]，香荊芥酚能抑制病毒復(fù)制，對傘花烴通過SARS-CoV-2C端結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)核定位信號（NLS），在該信號上對傘花烴削弱該蛋白質(zhì)的核易位并抑制病毒復(fù)制[9]，桉油精通過與RNA和IBVN-蛋白結(jié)合[10]，達(dá)到抑制病毒的作用，四者相伍發(fā)揮中醫(yī)藥配伍優(yōu)勢，體現(xiàn)協(xié)同增效，多靶點(diǎn)遏制病毒性肺炎加重。綜合分析芳香中藥單體成分抗流感病毒作用臨床應(yīng)用，確認(rèn)芳香中藥單體成分抗流感病毒的功效，為更好的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；將單體成分進(jìn)行配伍優(yōu)化組方，開展抗流感病毒的芳香中藥單體配伍創(chuàng)新藥的初步制劑工藝研究，以便有效控制從提取到制劑各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可靠，為芳香中藥單體配伍創(chuàng)新藥的質(zhì)量控制提供科學(xué)有效的方法。研究思路見圖1。圖1研究思路圖芳香中藥揮發(fā)性單體及其配方體外抗流感病毒藥效研究第一節(jié)芳香中藥揮發(fā)油單體成分體外抗流感病毒藥效研究基于課題組前期研究基礎(chǔ)，以文獻(xiàn)和理論研究篩選出的4種揮發(fā)性單體成分（百秋李醇、香荊芥酚、對傘花烴、桉油精）為研究對象，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究四種單體成分抗病毒藥效，評價(jià)藥物對細(xì)胞的毒性，尋找藥物濃度對細(xì)胞的安全范圍，并篩選出藥效最好的四種單體濃度。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)病毒流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)，血凝滴度為1:256；由中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院李敏老師惠贈(zèng)。1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞MDCK犬腎細(xì)胞，由中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院李敏老師惠贈(zèng)。1.3藥物實(shí)驗(yàn)所用藥物及其相關(guān)信息見表1。表1實(shí)驗(yàn)藥物相關(guān)信息名稱廠家批號百秋里醇成都瑞芬思生物科技有限公司RFS-B03702012009香荊芥酚成都瑞芬思生物科技有限公司RFS-X04811812016對傘花烴成都瑞芬思生物科技有限公司RFS-D03711809025桉油精成都瑞芬思生物科技有限公司RFS-A00311812016磷酸奧司他韋膠囊宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司02222090031.4試劑實(shí)驗(yàn)所用試劑及其相關(guān)信息見表2。表2實(shí)驗(yàn)試劑相關(guān)信息名稱廠家批號二甲基亞砜（DMSO）Bioruler公司r21075231PBS緩沖溶液GIBCO，Thermofisher公司8122571MEM培養(yǎng)基GIBCO，Thermofisher公司8122450胎牛血清（FBS）GIBCO，Thermofisher公司2168090RP青鏈霉素混合液（P/S）GIBCO，Thermofisher公司24418340.25%Trypsin-EDTAGIBCO，Thermofisher公司23230737.5%BSASolarbio公司H1130TPCK胰酶上海麥克林生化科技有限公司C13286934Hank’s平衡鹽溶液Solarbio公司H1025CCK-8試劑Adamaslife公司P20114331.5儀器實(shí)驗(yàn)所用儀器及其相關(guān)信息見表3。表3實(shí)驗(yàn)儀器相關(guān)信息名稱廠家型號電子分析天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司BSA224S二氧化碳培養(yǎng)箱Thermo公司311自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀BIO-RAD公司Epoch2C倒置顯微鏡Nikon公司TS2-S-SM低速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司SC-2542生物安全柜上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司BJ-2CD2實(shí)驗(yàn)方法2.1試劑配制完全培養(yǎng)基：89%MEM，1%P/S，10%FBS。病毒培養(yǎng)基：MEM，TPCK胰蛋白酶（2μg/ml），1%BSA，1%P/S。藥物溶液：將四種揮發(fā)性單體成分分別加入DMSO溶液，各配制成100mM母液，用MEM培養(yǎng)基將藥液稀釋到濃度為200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.12μM、1.56μM的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。陽性藥物：磷酸奧司他韋實(shí)驗(yàn)前以MEM培養(yǎng)基配制成母液濃度20mM，4℃儲(chǔ)存。CCK8溶液：CCK8試劑用MEM培養(yǎng)基稀釋10倍。2.2藥物的細(xì)胞毒性測定用0.25%EDTA-胰酶將生長成單層的MDCK細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，按200μl/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長成完整單層后，棄上清液，PBS清洗細(xì)胞3次。加入不同濃度的含藥細(xì)胞培養(yǎng)液100μl/孔，每個(gè)藥物的稀釋濃度平行做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照組和空白對照組，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去上清液，用MEM清洗1次，加入100μl稀釋后的CCK8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育40min后，在酶標(biāo)儀波長450nm處測定OD值（CCK8法），按公式1計(jì)算細(xì)胞存活率。（公式1）2.3病毒感染性實(shí)驗(yàn)將病毒株用病毒培養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)10倍次稀釋。接種MDCK細(xì)胞。待相應(yīng)96孔板細(xì)胞長成完整單層后，棄上清液，用Hank’s溶液清洗一次。按100μl/孔加入10-1～10-8不同稀釋度病毒，每個(gè)稀釋度平行做6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，每天觀察感染細(xì)胞圓縮、脫落等細(xì)胞病變（cytopathiceffect，CPE）情況，測定半數(shù)感染量（TCID50）。2.4藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)將MDCK細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL，含細(xì)胞2×104/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長成單層棄去上清液；加入終濃度為100μL（100TCID50）使用病毒培養(yǎng)液稀釋的流感病毒稀釋液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)吸附1h，棄去上清液；分別加入不同濃度梯度的藥物，各給藥組設(shè)置8個(gè)濃度梯度，8種濃度梯度分別為：200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.12μM、1.56μM，每孔100μL，每濃度6孔。設(shè)置正常細(xì)胞對照孔和病毒對照孔。培養(yǎng)板置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)并觀察CPE。當(dāng)病毒對照組細(xì)胞CPE達(dá)+++～++++時(shí)，采用CCK8法測定OD值，按下式計(jì)算病毒抑制率，并計(jì)算藥物的治療指數(shù)。藥物病毒抑制率和治療指數(shù)的計(jì)算公式如公式2、公式3。（公式2）TI=TC50/IC50（公式3）2.5神經(jīng)氨酸酶檢測收集“2.4”中給藥48h后的細(xì)胞上清液，使用神經(jīng)氨酸酶試劑盒檢測上清液中的神經(jīng)氨酸酶活性，比較熒光強(qiáng)度，測定結(jié)果用NA抑制率表示，計(jì)算公式如公式4，神經(jīng)氨酸酶加樣見表4。（公式4）表4神經(jīng)氨酸酶加樣表陽性對照陰性對照樣品神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液70μl70μl70μl神經(jīng)氨酸酶10μl--溶解神經(jīng)氨酸酶的樣品的溶液10μl10μl-神經(jīng)氨酸酶樣品--10μlMilli-Q水-10μl10μl神經(jīng)氨酸酶熒光底物10μl10μl10μl總體積100μl100μl100μl2.6雞紅細(xì)胞法測定病毒HA水平收集“2.4”中給藥48h后的細(xì)胞上清液，在96孔的血凝板的孔中加入PBS50μL/孔，再加入各濃度的細(xì)胞上清液50μL/孔混合均勻，進(jìn)行2倍梯度稀釋，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將50μL雞紅細(xì)胞懸液加入每孔，待雞紅細(xì)胞與病毒液充分混勻后，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，取出觀察。紅細(xì)胞凝集以“+”記錄，無凝集以“-”記錄。2.7統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)為最少三次實(shí)驗(yàn)的平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBMSPSSStatistics20進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式展現(xiàn)。結(jié)果繪圖用GraphPadPrism8.0.1繪制。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1藥物的細(xì)胞毒性細(xì)胞存活率結(jié)果見表5。揮發(fā)性單體成分濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系見圖2。四種單體成分在50μM~200μM范圍內(nèi)表現(xiàn)出不同程度的毒性作用，對傘花烴、桉油精、香荊芥酚、百秋里醇TC50分別為246.1μM、232.1μM、353.9μM、139.6μM。表5單體成分與細(xì)胞存活率關(guān)系（n=3）濃度（μM）細(xì)胞存活率（%）對傘花烴TC50=246.1μM桉油精TC50=232.1μM香荊芥酚TC50=353.9μM百秋里醇TC50=139.6μM奧司他韋TC50=786.4μM1.5625110.35±11.7198.85±2.32102.61±6.10103.01±4.58110.98±6.383.125109.37±8.0487.55±2.8995.69±7.0697.6±5.52106.88±6.206.25104.76±18.8883.21±0.8490.25±8.0293.13±1.55103.05±4.6912.5103.68±7.8078.88±10.1986.86±8.2983.59±4.5296.31±1.892585.29±3.3176.02±4.6084.24±8.0580.01±9.3787.47±5.295082.34±5.6573.26±0.4775.34±3.9479.13±4.5882.35±5.0010075.63±6.2060.09±5.5767.42±7.5977.38±5.5680.22±1.9120056.40±12.9250.62±4.2660.28±6.6526.06±1.4477.44±10.74圖2藥物濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系3.2病毒感染性實(shí)驗(yàn)流感病毒（H1N1）接種MDCK細(xì)胞后約2d出現(xiàn)CPE，依據(jù)CPE結(jié)果（見表6），按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50為5×10-5。3.3藥物抗病毒結(jié)果從CPE觀察結(jié)果可看出，正常細(xì)胞無細(xì)胞病變，病毒對照組100%病變。單體成分抗病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。各單體成分對流感病毒的有效最大抑制濃度分別為：桉油精200μM，IC50為24.09μM，治療指數(shù)TI為9.63；百秋里醇200μM，IC50為29.22μM，治療指數(shù)TI為4.77；對傘花烴200μM，IC50為182.8μM，治療指數(shù)TI為1.35；香荊芥酚200μM，IC50為36.7，治療指數(shù)TI為9.64。揮發(fā)性單體成分濃度與病毒抑制率的關(guān)系見圖3。表6單體成分抗病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）組別濃度（μM）抑制率（%）CPEIC50(μM)TI桉油精TC50=232.1μM1.56255.65±4.01++++24.099.633.12516.54±12.89++++6.2526.64±5.75+++12.537.81±6.64+++2550.56±6.95++5065.18±4.09++10075.28±4.20++20083.39±0.61+百秋里醇TC50=139.6μM1.56257.39±1.41+++29.224.773.12537.35±1.77++6.2546.30±5.38++12.549.57±2.47++2550.12±2.71++5056.26±1.18+10057.12±0.75+20060.16±0.59+對傘花烴TC50=246.1μM1.56250.76±0.54++++182.81.353.1255.44±2.05++++6.2510.13±4.88+++12.515.72±1.74+++2523.83±4.50++5035.55±2.72++10042.40±3.38+20047.09±3.68+香荊芥酚TC50=353.9μM1.56257.39±1.41++++36.79.643.12537.35±1.77+++6.2546.30±5.38+++12.549.57±2.47+++2550.12±2.71+++5056.26±1.18++10057.12±0.75+20060.16±0.59+注：-無細(xì)胞病變；+25%病變；++5%病變；+++75%病變；++++100%病變圖3揮發(fā)性單體成分濃度與病毒抑制率的關(guān)系3.4神經(jīng)氨酸酶檢測結(jié)果神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，揮發(fā)性單體成分濃度與NA抑制率關(guān)系見圖4，四種揮發(fā)性單體成分均具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用，桉油精濃度為200μM時(shí)NA抑制率最高，濃度為6.25μM時(shí)抑制率明顯增加；百秋里醇濃度為100μM時(shí)NA抑制率最高，濃度為3.125μM和100μM時(shí)抑制率明顯增加；香荊芥酚濃度為200μM時(shí)NA抑制率最高，濃度為100μM時(shí)抑制率明顯增加；對傘花烴濃度為100μM時(shí)NA抑制率最高，濃度為50μM時(shí)抑制率明顯增加。表7揮發(fā)性單體成分各濃度抑制率（n=3）組別濃度（μM）NA抑制率（%）組別濃度（μM）NA抑制率（%）桉油精1.562538.89±4.38對傘花烴1.5625-61.92±1.353.12581.92±2.533.125-29.20±8.516.2587.58±2.026.25-15.51±9.0112.590.66±4.3412.5-14.22±9.912593.66±0.8625-2.42±5.455097.52±0.6750-2.46±6.40100100.11±2.301006.04±0.80200102.88±2.15200-18.02±8.13百秋里醇1.562547.16±2.38香荊芥酚1.56258.93±4.193.12554.22±4.453.1259.45±1.726.2563.32±2.556.2511.41±2.9012.564.12±4.2012.519.16±4.022564.75±2.862521.48±5.365064.68±2.385057.20±9.3410065.41±1.9910067.39±2.3820076.77±1.1320072.98±1.73圖4揮發(fā)性單體成分濃度與NA抑制率關(guān)系3.5病毒HA水平檢測結(jié)果雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示（表8），病毒組發(fā)生了雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象（圖5），桉油精濃度為1.5625μM~6.25μM時(shí)出現(xiàn)雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，對傘花烴與香荊芥酚各濃度均有雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，百秋里醇1.5625μM~100μM時(shí)出現(xiàn)雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。病毒對照組病毒對照組正常細(xì)胞組圖5病毒/正常細(xì)胞紅細(xì)胞凝集圖表8單體成分紅細(xì)胞凝集情況（n=3）組別揮發(fā)性單體各濃度（μM）紅細(xì)胞凝集情況1.56253.1256.2512.52550100200桉油精+++對傘花烴++++++++香荊芥酚++++++++百秋里醇+++++++-注：“+”雞紅細(xì)胞凝集；“-”雞紅細(xì)胞無凝集4討論和結(jié)論本實(shí)驗(yàn)選擇使用流感病毒株A/PR/8/34（H1N1），因?yàn)榇瞬《局昃哂幸韵绿攸c(diǎn)：（1）穩(wěn)定性：A/PR/8/34（H1N1）是一種經(jīng)典的流感病毒株，已被廣泛應(yīng)用于流感研究領(lǐng)域。這種病毒株易于培養(yǎng)和保存，不容易突變或失活，因此可以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。（2）易感性：人類對A/PR/8/34（H1N1）病毒比較敏感，且該病毒株的致病性較強(qiáng)，可以很好地模擬流感病毒感染過程，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為真實(shí)可靠。（3）可靠性：由于A/PR/8/34（H1N1）是一種經(jīng)典的流感病毒株，其生物學(xué)特性和遺傳信息已經(jīng)被廣泛研究和了解。因此，對于該病毒株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行有效地比對、分析和推廣，其在流感領(lǐng)域的參考價(jià)值也更高。選擇狗腎細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。流感病毒侵犯呼吸道，故呼吸道上皮細(xì)胞最適于病毒增殖，但是在體外抗病毒實(shí)驗(yàn)中，有的細(xì)胞不適合病毒的復(fù)制增殖，因此在實(shí)驗(yàn)中選取合適的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)很重要。MDCK細(xì)胞被認(rèn)為是培養(yǎng)甲型和乙型流感病毒最合適的細(xì)胞系[11]。該細(xì)胞感染后能夠迅速產(chǎn)生流感病毒，具有在短時(shí)間內(nèi)取得最高滴度的特點(diǎn)。但是在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞經(jīng)多次傳代后，細(xì)胞狀態(tài)出現(xiàn)萎縮、脫落的現(xiàn)象，因此在實(shí)驗(yàn)過程需確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)是否良好。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，是一種常見的血清學(xué)檢測方法，用于檢測抗原-抗體反應(yīng)性。流感病毒的血凝素HA是病毒表面的主要糖蛋白之一，屬于主要的保護(hù)性抗原，它不僅可誘導(dǎo)特異性中和抗體，而HA還可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。另外，HA具有凝集多種動(dòng)物紅細(xì)胞的性質(zhì)，借助HA對紅細(xì)胞受體的作用，使病毒吸附于細(xì)胞，在穿膜過程中起關(guān)鍵作用在該實(shí)驗(yàn)中，如果存在相應(yīng)的抗體與被測抗原結(jié)合，則可觀察到紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，四種揮發(fā)性單體成分的結(jié)果均為陽性，說明上清液中有病毒存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，揮發(fā)性單體成分桉油精、百秋里醇和香荊芥酚具有明顯的抗流感病毒活性，而對傘花烴抗流感病毒活性較低。四種單體成分在50μM~200μM范圍內(nèi)表現(xiàn)出不同程度的毒性作用，其中百秋里醇毒性最強(qiáng)，香荊芥酚毒性最低。在藥物的各濃度范圍中，大部分為細(xì)胞的安全濃度。

第二節(jié)中藥揮發(fā)油單體配方體外抗流感病毒藥效研究本課題組使用中藥藥性系統(tǒng)研究方法“四步法”賦予了百秋里醇、香荊芥酚、桉油精、對傘花烴中藥藥性并分析了組方配伍原理。四藥配伍，共奏芳香化濕，解毒防疫，健脾和胃之效，用于流行性感冒所致的發(fā)熱、咳喘、鼻塞、流涕、惡心嘔吐等癥。本節(jié)探究揮發(fā)性單體配伍后抗流感病毒的活性，探究單體配伍后有無抗流感病毒的增效減毒作用。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)病毒同第一節(jié)。1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞同第一節(jié)。1.3藥物同第一節(jié)。1.4試劑同第一節(jié)。1.5儀器同第一節(jié)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1試劑配制單體配方藥物溶液：由于“第一章第一節(jié)”實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對傘花烴抗流感病毒活性較弱，因此對單體成分進(jìn)行不同的配伍方式，即加入對傘花烴組和不加入對傘花烴組。配伍（含對傘花烴）：使用藥效最好的單體濃度：百秋李醇200μM，香荊芥酚200μM，對傘花烴200μM，桉油精200μM合并配制成總濃度800μM，用MEM培養(yǎng)基將藥液稀釋到濃度為400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。配伍（無對傘花烴）：使用藥效最好的單體濃度：百秋李醇200μM，香荊芥酚200μM，桉油精200μM合并配制成總濃度600μM，用MEM培養(yǎng)基將藥液稀釋到濃度為300μM、150μM、75μM、37.5μM、18.75μM、9.375μM、4.6875μM、2.34375μM的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。其余同第一節(jié)。2.2藥物的細(xì)胞毒性測定同第一節(jié)。2.3病毒感染性實(shí)驗(yàn)同第一節(jié)。2.4藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)同第一節(jié)。2.5神經(jīng)氨酸酶檢測同第一節(jié)。2.6雞紅細(xì)胞法測定病毒HA水平同第一節(jié)。2.7統(tǒng)計(jì)方法同第一節(jié)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1藥物的細(xì)胞毒性配伍（含對傘花烴）中細(xì)胞存活率最高的。細(xì)胞TC50見表9。揮發(fā)性單體配方濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系見圖7。表9單體配方與細(xì)胞存活率關(guān)系（n=3）濃度（μM）細(xì)胞存活率（%）濃度（μM）細(xì)胞存活率（%）配伍（含對傘花烴）TC50=193.4μM配伍（無對傘花烴）TC50=1472μM3.12547.43±1.782.3437557.69±3.536.2554.48±3.054.687564.53±6.1212.555.20±