放射免疫技術(shù)

免疫學(xué)檢驗(yàn)1精品PPT·值得借鑒第一頁(yè)，共四十一頁(yè)。第十九章放射免疫技術(shù)2精品PPT·值得借鑒第二頁(yè)，共四十一頁(yè)。放射免疫技術(shù)的基本概念及類型放射標(biāo)記物的鑒定與純化。RIA和IRMA的測(cè)定原理及關(guān)鍵技術(shù)。RIA和IRMA的臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)本章要點(diǎn)衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三頁(yè)，共四十一頁(yè)。目錄放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備1放射免疫分析性2免疫放射分析34精品PPT·值得借鑒第四頁(yè)，共四十一頁(yè)。放射免疫技術(shù)是將放射性核素高敏感的示蹤特點(diǎn)和抗原抗體反應(yīng)的高特異性特點(diǎn)相結(jié)合的一種體外測(cè)定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。其基本模式是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，通過(guò)免疫反應(yīng)進(jìn)行定量測(cè)定。具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡(jiǎn)便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。放射免疫技術(shù)根據(jù)其方法學(xué)原理的不同主要有兩種類型：RIA和IRMA。前言5精品PPT·值得借鑒第五頁(yè)，共四十一頁(yè)。第一節(jié)放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備放射性核素作為放射性免疫技術(shù)的標(biāo)記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標(biāo)記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），是建立放射免疫技術(shù)的基礎(chǔ)。6精品PPT·值得借鑒第六頁(yè)，共四十一頁(yè)。一、放射性核素的基本知識(shí)基本概念指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時(shí)釋放射線（α、β、γ），又稱為放射性衰變?；绢愋鸵罁?jù)其衰變方式α衰變、β衰變、γ衰變最常用的放射性核素是125I

7精品PPT·值得借鑒第七頁(yè)，共四十一頁(yè)。125I的優(yōu)點(diǎn)化學(xué)性質(zhì)比較活潑，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，且容易獲得高比活性的標(biāo)記物；在衰變過(guò)程中產(chǎn)生γ射線，便于測(cè)量且效率高；半衰期適中（60天左右），且廢棄物較容易處理。125I的缺點(diǎn)用125I取代H，可能使原物質(zhì)免疫活性受到影響；易因發(fā)生輻射損傷而使標(biāo)記抗原變性；作為商品化試劑的產(chǎn)品貨架期較短。8精品PPT·值得借鑒第八頁(yè)，共四十一頁(yè)。放射性核素放射活性的檢測(cè)利用射線照射閃爍體（NaI晶體），導(dǎo)致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時(shí)，閃爍體發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉(zhuǎn)換成光電子并放大107倍；從光電倍增管輸出的電信號(hào)經(jīng)過(guò)放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處理，并在定標(biāo)器上顯示。9精品PPT·值得借鑒第九頁(yè)，共四十一頁(yè)。二、放射性核素標(biāo)記抗原抗體方法主要包括間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法（氯胺T法）衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十頁(yè)，共四十一頁(yè)。125I-125I或125I+125I-標(biāo)記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應(yīng)（一）直接標(biāo)記法——氯胺T法（Ch-T）

氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標(biāo)記物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亞硫酸鈉（還原劑）終止反應(yīng)。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)。使用無(wú)還原劑的高比放射性碘源被標(biāo)記物用量要少Ch-T用量要低控制總反應(yīng)體積<200μl反應(yīng)時(shí)間1分鐘~2分鐘弱堿性反應(yīng)條件衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。（二）間接標(biāo)記法預(yù)先將125I用Ch-T法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團(tuán)可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。三、放射標(biāo)記物的純化與鑒定（一）放射標(biāo)記物的純化因游離的125I與125I標(biāo)記抗原（抗體）分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進(jìn)行分離純化聚合、損傷物標(biāo)記蛋白游離125I衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。比放射活性高比放射性高純度完整免疫活性放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率應(yīng)大于95%

免疫活性標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力標(biāo)記物與過(guò)量抗體反應(yīng)百分比該值越大,標(biāo)記物免疫活性好（二）放射標(biāo)記物的鑒定衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)。計(jì)算法自身置換法

比放射活性單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度單位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性過(guò)高，將影響標(biāo)記物免疫活性衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)。比放射性－計(jì)算法

結(jié)果欠準(zhǔn)，計(jì)算簡(jiǎn)便依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）來(lái)計(jì)算標(biāo)記物的比放射性.衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)。比放射性－自身置換法比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來(lái)測(cè)定標(biāo)記物的比放射性。作一條常規(guī)的RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系包括定量標(biāo)記抗原、不同濃度的非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品抗原、限量抗體；同時(shí)另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品、只加抗體和不同劑量的標(biāo)記抗原的自身置換曲線。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)。自身置換曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線

反應(yīng)平衡后，測(cè)定B/T%。若從兩條曲線上取一點(diǎn)相同的B/T%，則（標(biāo)記物+標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)準(zhǔn)曲線=（標(biāo)記物）自身置換曲線。由此便可直接計(jì)算標(biāo)記抗原的含量，并進(jìn)一步求得比放射活性。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)。自身置換法測(cè)定標(biāo)記化合物的比放射活性，只適用于RIA的標(biāo)記抗原。使用時(shí)應(yīng)注意：①標(biāo)記物與未標(biāo)記物對(duì)抗體（受體）的親和力應(yīng)相同；②非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除；③制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線時(shí)，操作步驟應(yīng)相同，特別是B與F分離的條件要一致。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)。第二節(jié)放射免疫分析

放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標(biāo)記的抗原（Ag*）與未標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異抗體（Ab）來(lái)對(duì)待檢樣品中的抗原進(jìn)行定量測(cè)定的一種技術(shù)。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)。一、檢測(cè)原理RIA屬于競(jìng)爭(zhēng)性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待測(cè)物Ag)對(duì)特異性抗體具有相同的結(jié)合力，當(dāng)三者同時(shí)存在于同一反應(yīng)體系時(shí)，Ag*和Ag相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體。Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點(diǎn)，二者通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關(guān)系。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。PPT內(nèi)容概述免疫學(xué)檢驗(yàn)。具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡(jiǎn)便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時(shí)。釋放射線（α、β、γ），又稱為放射性衰變。α衰變、β衰變、γ衰變?；瘜W(xué)性質(zhì)比較活潑，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，且容易獲得。利用射線照射閃爍體（NaI晶體），導(dǎo)致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時(shí)，閃爍體發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光。從光電倍增管輸出的電信號(hào)經(jīng)過(guò)放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處理，并在定標(biāo)器上顯示。直接標(biāo)記法（氯胺T法）。125I或125I+。因游離的125I與125I標(biāo)記抗原（抗體）分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進(jìn)行分離純化。①標(biāo)記物與未標(biāo)記物對(duì)抗體（受體）的親和力。③制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線時(shí)，操作步驟。Ag*和Ag的量大于。隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放。(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)。(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)。分離結(jié)合標(biāo)記物（分離技術(shù)）。小結(jié)。40第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)二、方法與類型非平衡法，即標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標(biāo)記抗原與特異性抗體達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合。兩種類型平衡法，即標(biāo)記抗原、標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）、特異性抗體同時(shí)加入反應(yīng)體系中。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十五頁(yè)，共四十一頁(yè)。三、關(guān)鍵技術(shù)抗原抗體反應(yīng)分離結(jié)合標(biāo)記物（分離技術(shù)）放射性測(cè)定數(shù)據(jù)處理衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十六頁(yè)，共四十一頁(yè)。Ag*Ag反應(yīng)條件體積溫度時(shí)間pHAb(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)（一）抗原抗體反應(yīng)牢固的抗原抗體復(fù)合物衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十七頁(yè)，共四十一頁(yè)。二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)（二）分離結(jié)合標(biāo)記物衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十八頁(yè)，共四十一頁(yè)。晶體閃爍計(jì)數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計(jì)數(shù)器測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)曲線衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第二十九頁(yè)，共四十一頁(yè)。

RIA由于具有敏感度高、特異性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好、用血量少、可測(cè)定小分子量和大分子量物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測(cè)定。

但由于放射性核素的放射性對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一定的危害性，且其廢物的儲(chǔ)存和銷毀會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此操作時(shí)必須加以注意。四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十頁(yè)，共四十一頁(yè)。第三節(jié)免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是從放射免疫分析（RIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核素標(biāo)記免疫測(cè)定，其特點(diǎn)為用核素標(biāo)記的抗體直接與待檢抗原反應(yīng)，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段。31精品PPT·值得借鑒第三十一頁(yè)，共四十一頁(yè)。一、檢測(cè)原理IRMA屬于非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)，其基本檢測(cè)原理是將放射性核素（125I）標(biāo)記在抗體上，并用過(guò)量的標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，并采用固相免疫吸附方式對(duì)B和F進(jìn)行分離。檢測(cè)免疫復(fù)合物的放射性，從而得到待檢樣本的濃度。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。二、方法與類型（一）單位點(diǎn)IRMA衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。（二）雙位點(diǎn)IRMA衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。三、關(guān)鍵技術(shù)抗原抗體反應(yīng)分離技術(shù)放射性測(cè)定數(shù)據(jù)處理衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十五頁(yè)，共四十一頁(yè)。Ab*AgAb(待檢Ag)（一）抗原抗體反應(yīng)固相抗原抗體復(fù)合物*牢固的抗原抗體復(fù)合物衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十六頁(yè)，共四十一頁(yè)。固相吸附分離技術(shù)（二）分離技術(shù)一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預(yù)包被抗體稀釋到3μg/ml~10μg/ml，室溫過(guò)夜，棄包被緩沖液（含有未結(jié)合物質(zhì)和過(guò)剩標(biāo)記物），并洗滌去掉結(jié)合不牢固抗體，從而達(dá)到分離的目的；然后，再加入1%牛血清白蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆?。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十七頁(yè)，共四十一頁(yè)。晶體閃爍計(jì)數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計(jì)數(shù)器測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品PPT·值得借鑒第三十八頁(yè)，共四十一頁(yè)。

IRMA的優(yōu)點(diǎn)

效率高、操作簡(jiǎn)便

靈敏度高

特異型強(qiáng)

穩(wěn)定性好四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用

IRMA的缺點(diǎn)

抗體用量較多

抗體的純化較難RMA的測(cè)定對(duì)象主要限于有兩個(gè)以上抗原決定簇的肽類或蛋白質(zhì)?？贵w適用于大分子蛋白質(zhì)和多肽類激素的檢測(cè)分析，如腫瘤標(biāo)志物CA15-3，人血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、降鈣素、HBsAg等，某些難以標(biāo)記的病毒抗原也可通過(guò)IRMA進(jìn)行檢測(cè)。衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫技術(shù)專業(yè)精品