蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)

關(guān)于蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)引言在人體的進(jìn)化過(guò)程中蛋白質(zhì)執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務(wù)：酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)或者核酸分子；抗體起到防護(hù)的作用;……從生態(tài)角度，蛋白質(zhì)也是非常理想的物質(zhì):生物合成不需要消耗很多能量專(zhuān)一性很強(qiáng)不產(chǎn)生副作用并且能很快降解第2頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)沒(méi)有像化學(xué)試劑那樣被普遍應(yīng)用，其原因:(1)蛋白質(zhì)分子量非常大(10000-1000000)，不能通過(guò)化學(xué)方法生產(chǎn);(2)蛋白質(zhì)的功能是在生理?xiàng)l件下?lián)]發(fā)的，在其它條件下(如在有機(jī)溶劑中)是不穩(wěn)定的;(3)專(zhuān)一性致使其應(yīng)用范圍受到影響。

蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的原因第3頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問(wèn)題1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差第4頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算機(jī)模擬突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析基因構(gòu)建Pr設(shè)計(jì)循環(huán)第一節(jié)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理第5頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果分析與原先的結(jié)構(gòu)比較蛋白質(zhì)合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的輸入第6頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天Pr突變體設(shè)計(jì)的3個(gè)步驟利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的aa利用能量?jī)?yōu)化及動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的Pr結(jié)構(gòu)比較，利用Pr結(jié)構(gòu)-功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)新Pr可能具有的性質(zhì)第7頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合

第8頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天在上述的設(shè)計(jì)工作完成后，要進(jìn)行合成或突變實(shí)驗(yàn)并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設(shè)計(jì)的成功與否，必須要有理論與實(shí)驗(yàn)的緊密相結(jié)合

第9頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類(lèi)設(shè)計(jì)的目的主要有兩個(gè)：

一是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案和指導(dǎo)性信息，如以此提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專(zhuān)一性等；

二是探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理，如簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋白質(zhì)內(nèi)相互作用力的類(lèi)型及本質(zhì)的很好途徑，也為解決蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題尋找定性和定量的規(guī)律。第10頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次分為兩個(gè)層次：

一是在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)已知基礎(chǔ)上的分子設(shè)計(jì)；二是在三維結(jié)構(gòu)未知的情況下，借助一級(jí)結(jié)構(gòu)序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)工作。第11頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類(lèi)1．定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法2．拼接組裝設(shè)計(jì)法3．從頭設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)第12頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原則1．活性設(shè)計(jì)2．對(duì)專(zhuān)一性的設(shè)計(jì)3．Scaffold設(shè)計(jì)(框架)4．疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)需合理分布5．最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列第13頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。（內(nèi)部十分保守的區(qū)域）Pr內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體），沒(méi)有重疊所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿(mǎn)足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個(gè)交換反應(yīng)，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所取代疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力第14頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿(mǎn)足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長(zhǎng)、鍵角以及整體的幾何。對(duì)于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用。最優(yōu)的aa側(cè)鏈幾何排列。Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)結(jié)構(gòu)及功能的專(zhuān)一性。這是Pr設(shè)計(jì)最困難的問(wèn)題第15頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)α螺旋時(shí)，應(yīng)選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設(shè)計(jì)全β結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)角時(shí)常選擇Pro-Asn殘基對(duì)。

第16頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天溶菌酶結(jié)構(gòu)例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設(shè)計(jì)

Cutte成功設(shè)計(jì)了一個(gè)具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA。第17頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天設(shè)計(jì)步驟蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)步驟圖修正設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)序列合成檢測(cè)結(jié)構(gòu)信息分析建立結(jié)構(gòu)模型設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)第18頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)有兩類(lèi)：一是進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進(jìn)行蛋白質(zhì)分子裁剪拼接，即“中改”。

第19頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、定位突變

基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質(zhì)工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質(zhì)修飾和基因定位突變兩類(lèi)。

第20頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決方法

定位突變常見(jiàn)的設(shè)計(jì)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專(zhuān)一性，以及通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。

第21頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天Hartley等于1986年完成了一個(gè)設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決的辦法：熱穩(wěn)定性對(duì)氧化的穩(wěn)定性對(duì)重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學(xué)性質(zhì)引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團(tuán)，His、Cys以及Tyr的置換專(zhuān)一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)，改變酸堿度

第22頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）定位突變的種類(lèi)

要進(jìn)行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學(xué)合成、基因直接修飾法、盒式突變技術(shù)等。根據(jù)基因突變的方式，分為以下三類(lèi)：

插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；

刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；

替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。第23頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型

可以通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)、二維核磁共振等測(cè)定結(jié)構(gòu)，也可以根據(jù)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)或其他結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法建立起結(jié)構(gòu)模型。第24頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置在改造中如何恰當(dāng)?shù)剡x擇突變殘基是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，這不僅需要分析殘基的性質(zhì)，同時(shí)還需要借助于已有的三維結(jié)構(gòu)或分子模型。

第25頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．預(yù)測(cè)突變體的結(jié)構(gòu)

根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點(diǎn)及突變后的氨基酸種類(lèi)，利用相關(guān)軟件進(jìn)行突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較

第26頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．構(gòu)建突變體，獲得突變體蛋白

依據(jù)所設(shè)計(jì)好的突變，利用化學(xué)合成或PCR等方法構(gòu)建突變體。進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證突變體后，將突變體進(jìn)行表達(dá)，純化蛋白質(zhì)，獲得所設(shè)計(jì)的新蛋白質(zhì)。第27頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)測(cè)定新蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等，并與對(duì)應(yīng)的天然蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)突變?cè)O(shè)計(jì)的效果，同時(shí)進(jìn)一步修正設(shè)計(jì)方案。第28頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定第29頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測(cè)定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)分析該酶的Cys35被結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。第30頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．突變方法鑒定突變功能殘基通過(guò)引進(jìn)另外一種突變來(lái)檢測(cè)隨機(jī)突變技術(shù)刪除分析及連接片段掃描突變

第31頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結(jié)構(gòu)有關(guān)。非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專(zhuān)一性研究。探測(cè)突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。

第32頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）定位突變的應(yīng)用RNaseT1的結(jié)構(gòu)改造是分于設(shè)計(jì)中的一個(gè)成功實(shí)例T1核糖核酸酶含有104個(gè)aa殘基，天然酶有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學(xué)的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個(gè)二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。

第33頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天T4噬菌體溶菌酶圖2-3T4溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)（Gassner,etal.1996）紅色強(qiáng)調(diào)的為α螺旋結(jié)構(gòu)域核心中被蛋氨酸置換的10個(gè)殘基T4溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)紅色強(qiáng)調(diào)的為α螺旋中被置換的殘基突變引入二硫鍵去除Gly或引入Pro

Ser38→Asp和Asn144→Asp

第34頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：甲基對(duì)硫磷水解酶（Methylparathionhydrolase,MPH）結(jié)構(gòu)和功能的研究

有機(jī)磷農(nóng)藥的長(zhǎng)期廣泛使用已經(jīng)使很多水體及土壤被嚴(yán)重污染,而且直接影響到人們的身體健康。有機(jī)磷水解酶(OrganophosphorusHydrolase,

OPH)的改造：提高對(duì)特定底物的催化效率;擴(kuò)大底物范圍;增加酶的穩(wěn)定性

DongYJ,2005

第35頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天目的和意義

通過(guò)對(duì)MPH的結(jié)晶和三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定，研究MPH活性中心的結(jié)構(gòu)，并通過(guò)定點(diǎn)突變及活性測(cè)定來(lái)驗(yàn)證，確定MPH的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,為MPH的改性和利用提供科學(xué)的依據(jù)和良好的材料。

OPH是目前在各方面研究最為透徹的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶，同時(shí)也是應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥降解酶，為此對(duì)甲基對(duì)硫磷水解酶的深入研究將有利于甲基對(duì)硫磷水解酶的廣泛應(yīng)用。第36頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天載體污染序列的分析在進(jìn)行序列分析時(shí)，首先需確定序列是否含有載體序列的污染，如果含有載體序列，需截去后再進(jìn)行其他分析。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html在線(xiàn)分析。

MatchtoVector:Strong

Moderate

Weak

Segmentofsuspectorigin:

SegmentsmatchingvectorStrongmatch:

1-113,3838-4071bp。真正的目標(biāo)序列：114~3,837bp。

第37頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天1ThenucleotidesequenceincludingmpdfromPseudomonas

sp.WBC-32Plesiomonassp.M6的甲基對(duì)硫磷水解酶基因匹配區(qū)為134~1866，Identities=1720bp／1733bp(99％)

CDS:331aa(398-1393bp)3Pseudomonasputida的甲基對(duì)硫磷降解蛋白基因匹配區(qū)為168~1393，Identities=1025／1026(99％)CDS:341aa(368-1393bp)

兩個(gè)基因的CDS不一致，分別匹配于MPH的398，368-1393bp同源序列搜索（Blastn:114-3837bp）123第38頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天甲基對(duì)硫磷水解酶基因的分析結(jié)論：MPH基因的CDS:398—1393（331aa)以1393位的TGA結(jié)束的可能的ORF有八個(gè),MW:34.4kD–ATG:368，398bp典型的啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu):TTGCAA-17個(gè)氨基酸-TATACT(320-365bp)典型的核糖體結(jié)合位點(diǎn):AGGA(381bp)第39頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天MPH與OPH的序列比對(duì)二者同源性?xún)H為13.6%，確定MPH是一個(gè)有別于OPH的蛋白質(zhì)。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一級(jí)序列的相似性加以解釋?zhuān)茰y(cè)二者功能上的相似性與其一級(jí)序列構(gòu)成的高級(jí)結(jié)構(gòu)中活性中心結(jié)構(gòu)的相似性有關(guān)。第40頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天MPH信號(hào)肽的分析預(yù)測(cè)：神經(jīng)網(wǎng)算法結(jié)論：信號(hào)肽（1-35氨基酸）。

C值表示切割點(diǎn)的可能性，S值表示具有信號(hào)肽的可能性第41頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天MPH信號(hào)肽的分析預(yù)測(cè)：馬爾可夫算法信號(hào)肽的一般結(jié)構(gòu)為：正電荷的n-region；疏水的h-region；中性極性的c-region。

MPH具有典型的信號(hào)肽的三部分結(jié)構(gòu)結(jié)論：可能的信號(hào)肽為1-35氨基酸。第42頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天mlmAUMPH的凝膠過(guò)濾柱層析圖

第43頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天MPH的SDS分析第44頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.1484.370Mg14.34515.060Mn0.0750.497Fe1.1582.388Co0.0500.040Cu10.8129.296Zn0.201272.122MPH中金屬種類(lèi)及含量的測(cè)定MPH的濃度：0.217mg/ml,結(jié)論：MPH中含鋅離子第45頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天硒代蛋氨酸MPH的表達(dá)純化在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)添加高濃度的與蛋氨酸有共同的合成途徑的終產(chǎn)物賴(lài)氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸，以及與賴(lài)氨酸具有相互協(xié)同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸來(lái)抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使細(xì)菌利用培養(yǎng)基中外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPH。由于硒代蛋氨酸不穩(wěn)定而易發(fā)生氧化，因此在純化時(shí)需要加快速度，并在緩沖液中添加還原劑以保持還原性環(huán)境，如5mM?-巰基乙醇。第46頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天甲基對(duì)硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶體第47頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天甲基對(duì)硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶體第48頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天硒代蛋氨酸MPH的晶體第49頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天同源二聚體每個(gè)亞基含有一個(gè)由兩個(gè)二價(jià)金屬離子組成的中心。Ala36為MPH的N末端第一個(gè)氨基酸（不具有1-35個(gè)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)）。甲基對(duì)硫磷水解酶（MPH）三維結(jié)構(gòu)圖第50頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天aba:ThebinuclearmetalcenteroftheOPH;b:ThebinuclearmetalcenteroftheMPH;MPH與OPH雙核金屬中心結(jié)構(gòu)比較第51頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天a:ThesupposedleavinggroupsubsiteoftheMPH;b:TheleavinggroupsubsiteoftheOPH;abMPH與OPH雙核金屬中心附近氨基酸比較推測(cè)：Trp179，Phe196，Phe119是MPH底物結(jié)合部位的氨基酸第52頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天甲基對(duì)硫磷水解酶中三個(gè)芳香族氨基酸的功能研究

在MPH三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上可以看出Trp179，Phe196，Phe119的芳香側(cè)鏈伸向MPH雙核金屬中心的上方，處于活性中心的入口處，推測(cè)為底物結(jié)合部位的氨基酸。通過(guò)定點(diǎn)突變將以上三個(gè)不同位點(diǎn)突變成含有芳香環(huán)的類(lèi)似氨基酸及不具芳香環(huán)側(cè)鏈很小的丙氨酸，從而獲得了針對(duì)Trp179，Phe196和Phe119三個(gè)位點(diǎn)的六個(gè)突變體W179F、W179A、F196W、F196A、F119W和F119A，系統(tǒng)比較了突變體與野生酶的催化動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，以確定三種氨基酸在MPH的結(jié)構(gòu)和功能中的作用。第53頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天mpd基因表達(dá)載體的構(gòu)建第54頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天W179F，W179A，F(xiàn)196W和F196A突變體基因的擴(kuò)增第55頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天MPH及其突變體的表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS分析第56頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天E.coliBL21(DE3)/pET5a-mpd表達(dá)產(chǎn)物的SDS分析第57頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天EnzymeSpecificactivity（U/mg）

Km(uM)

Kcat(s-1)

Kcat/Km(s-1mM-1)

MPH50.5100%37.4100%37.1100%993.3100%W179F34.568.4%48.4129.6%30.682.5%632.663.7%W179A8.416.6%74.6199.6%7.921.3%106.110.7%F196W64.0126.8%50.0133.7%52.8142.3%1056.8106.4%F196A4.89.6%107.4287.2%5.013.5%46.84.7%F119W29.257.8%28.275.5%20.856.1%738.874.4%F119A32.063.3%41.1109.9%23.863.9%578.358.2％MPH及其突變體的比活力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

第58頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)小結(jié)

利用生物信息學(xué)手段對(duì)MPH的結(jié)構(gòu)基因的編碼序列進(jìn)行分析，確定MPH是一種結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)，并在對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)MPH的純化、結(jié)晶獲得P1晶型和P43212晶型兩種單晶以及硒標(biāo)記MPH的晶體。通過(guò)合作利用P43212晶型的晶體解析了MPH的三維結(jié)構(gòu)證實(shí)了MPH與OPH功能上的相似性可能與兩種蛋白三維結(jié)構(gòu)的相似性有關(guān)的推測(cè)。同時(shí)，在MPH三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，推測(cè)并通過(guò)定點(diǎn)突變及活性測(cè)定驗(yàn)證了Trp179和Phe196屬于MPH活性中心的底物結(jié)合部位關(guān)鍵氨基酸，Phe119在與底物結(jié)合中的作用不明顯。以上對(duì)于MPH的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系的研究為MPH的改性和利用提供科學(xué)的依據(jù)。第59頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)分子拼接例如，有一種和癌癥的發(fā)病有關(guān)的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個(gè)大小和形狀都非常相似的結(jié)構(gòu)域拼接構(gòu)成的，各結(jié)構(gòu)域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原的這種多結(jié)構(gòu)域特征有利于它的細(xì)胞識(shí)別和粘合作用。

第60頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天英國(guó)劍橋大學(xué)的Winter等人利用分子剪裁技術(shù)成功地在抗體分子上作了實(shí)驗(yàn)(人源化抗體)第61頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天單鏈抗體scFv結(jié)構(gòu)/cmbidata/biotech/antibody/antibodyengnieer.htm)抗DON單鏈抗體改體研究DON:小麥鐮刀菌毒素第62頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

單鏈抗體的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL第63頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa

<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH第64頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

Linker

XhoⅠSalISalⅠEcoRIXhoⅠ雙酶切differentlength連接ＶＨＶＬ

技術(shù)路線(xiàn)EcoRI第65頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化篩選、檢測(cè)

蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)生成

表達(dá)載體構(gòu)建

感受態(tài)細(xì)胞的制備純化親和力初步測(cè)定第66頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

PCR擴(kuò)增重鏈、輕鏈策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2第67頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件50

L反應(yīng)體系如下：10×TaqPCRBuffer5μLdNTP(2.5mM)3μLForwardPrimer(20mM)1μLReversePrimer(20mM)1μLTemple1μLrTaq0.3μL

AddddH2Otoafinalvolumeof50μLPCR循環(huán)條件為：94℃5min，1個(gè)循環(huán)；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31個(gè)循環(huán)；72℃40s，25個(gè)循環(huán)；72℃7min，1個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5μL，1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)。第68頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天VH

和VL的PCR擴(kuò)增結(jié)果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000第69頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

菌落PCR重組子驗(yàn)證123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100第70頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及其純化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD第71頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

改體抗體的ELISA初步測(cè)定312456789101112第72頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天單鏈抗體抗體：是體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子。由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）組成。雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建與表達(dá)第73頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天單鏈抗體（scFv）：抗體可變區(qū)的重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過(guò)一段多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的彈性短肽（Linker）相連，融合表達(dá)出來(lái)的抗體片斷。

第74頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙特異性單鏈抗體能識(shí)別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復(fù)合物）稱(chēng)為雙特異性單鏈抗體。本實(shí)驗(yàn)將能夠各自產(chǎn)生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達(dá)出能同時(shí)與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結(jié)合的雙特異性單鏈抗體。ZEN:玉米赤霉烯酮DON:小麥鐮刀菌毒素第75頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天技術(shù)路線(xiàn)

DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設(shè)計(jì)

PCR擴(kuò)增目的片段

制備感受態(tài)細(xì)胞

酶切目的片段、載體，linker連接

轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物

酶切驗(yàn)證重組子

表達(dá)、純化蛋白第76頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天載體的構(gòu)建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ連接

Linker第77頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500第78頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bp第79頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天重組驗(yàn)證第80頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR驗(yàn)證以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行Anti-DON基因的PCR分析。第81頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙特異性抗體的表達(dá)第82頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

我們知道,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)受其氨基酸序列控制,而功能又與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

如果能夠找到構(gòu)造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,我們就能得到具有任意結(jié)構(gòu)和功能的全新蛋白質(zhì),這就是蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)問(wèn)題。第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)第83頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)概念

從頭設(shè)計(jì)能夠根據(jù)生物分子的活性位點(diǎn)特征產(chǎn)生一系列的結(jié)構(gòu)片段，通過(guò)連接這些結(jié)構(gòu)片段可以構(gòu)成一個(gè)全新分子；或者在結(jié)合腔內(nèi)對(duì)一個(gè)已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。

從頭設(shè)計(jì)方法可以生成全新的分子結(jié)構(gòu)。第84頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)包括

一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)第85頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)過(guò)程設(shè)計(jì)目標(biāo)序列生成結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)合成構(gòu)建模型檢測(cè)第86頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)程序模擬分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法PDA循環(huán)（ProteinDesignAutomation）第87頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)的選擇依據(jù)設(shè)計(jì)的目的可以分為：從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)從頭功能設(shè)計(jì)第88頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天從頭設(shè)計(jì)方法包含的步驟1、活性位點(diǎn)分析：對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的具體的化學(xué)信息進(jìn)行掃描、分析和歸類(lèi)。這些信息的三維空間相互關(guān)系都必須充分考慮。

2、配體分子構(gòu)建：采用不同的片段選擇和分子構(gòu)建方法，產(chǎn)生相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)。

3、評(píng)價(jià)：使用特定的評(píng)分系統(tǒng)將構(gòu)建的分子與活性位點(diǎn)的匹配性進(jìn)行排序，可以選擇其中優(yōu)良的結(jié)果作為合成實(shí)驗(yàn)的對(duì)象;可將之做新一輪計(jì)算的起點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。第89頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天二級(jí)模塊單元的自組裝最簡(jiǎn)單、最直接的策略—合成單一二級(jí)結(jié)構(gòu)單元優(yōu)點(diǎn)

無(wú)論是從設(shè)計(jì)或合成看，是簡(jiǎn)單的；容易合成。缺點(diǎn)

涉及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)。第90頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)（一）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)原則1．二級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則α螺旋β折疊片轉(zhuǎn)角2．超二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則第91頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-N帽C帽第92頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天β折疊(HPHPH或PHPHP，5-10aa)第93頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)角

（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）

第94頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的幾種超二級(jí)結(jié)構(gòu)

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β第95頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天從頭設(shè)計(jì)的三股式β折疊

從頭設(shè)計(jì)的20個(gè)氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)實(shí)例結(jié)構(gòu)骨架模板、分級(jí)迭代算法1mg/110RMB第96頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天ββα型異源四聚體的設(shè)計(jì)歷程

結(jié)構(gòu)域替換寡聚化策略

異源專(zhuān)一性的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)23個(gè)氨基酸自動(dòng)折疊成的鋅指結(jié)構(gòu)（ββα5）的核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)(Struthersetal.,1996,1998)；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)（Alietal.,2004)；ββαT2異源四聚體衍生物ββαhetT1的X-射線(xiàn)結(jié)構(gòu)(Alietal.,2005).第97頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天

全新設(shè)計(jì)的α/β新蛋白Top7（BrianKuhlman,etal.2003）第98頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天α/β-筒狀蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)(Offredi1,etal.2003)(A)β-sheetbarrel(紅色)(B)四周環(huán)繞α-helixbarrel(藍(lán)色)(C)二者由簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)域αβ1、αβ3和βABα（灰色）連接(D)全新α/β-筒狀蛋白質(zhì)。216aa第99頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天74aa

Degrado設(shè)計(jì)四螺旋束螺旋（Helix）：Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly；連接（Loop）：Pro-Arg-Arg；肽鏈：NH2-Met-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-COOH第100頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天四螺旋束第101頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天舉例Hodges設(shè)計(jì)（周期性重復(fù)七肽）/~jps/coilcoil.html2/.../phyb516/regulatoryproteinsu3.htm3/sc172/sc172_4.html

coiled-coilfrom:/…/phvb516/regulatorvproteinsu3.htm疏水性aa第102頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天coiled-coil

from:/~ips/coilcoil.html

第103頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天國(guó)外的一些大型軟件包主要有SYBYL、BIOSYM等。國(guó)內(nèi)的北京大學(xué)化學(xué)系（來(lái)魯華課題組）有PEPMODS蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)系統(tǒng)中國(guó)生物物理研究所（陳潤(rùn)生課題組）中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所（丁達(dá)夫課題組）等設(shè)計(jì)有PMODELING程序包。第104頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的現(xiàn)狀和前景

現(xiàn)狀

蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)不僅使我們有可能得到自然界不存在的具有全新結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì),并且已經(jīng)成為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)折疊理論和研究蛋白質(zhì)質(zhì)折疊規(guī)律的重要手段。由于我們對(duì)蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的理論基礎(chǔ)即蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識(shí)還不夠,所以蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)還處在探索階段。第105頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天前景

隨著新實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的速度和效率必將得到極大的提高。如組合化學(xué)方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)中必然能夠大大地縮短設(shè)計(jì)的周期,并將徹底改變蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)的面貌。第106頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天■計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)包括能量表達(dá)、能量?jī)?yōu)化、側(cè)鏈構(gòu)象的離散化、殘基分類(lèi)（內(nèi)核、表面、邊界）、功能位點(diǎn)設(shè)計(jì)、專(zhuān)一性、穩(wěn)定性及序列空間的穩(wěn)健性預(yù)測(cè)、負(fù)設(shè)計(jì)等方面內(nèi)容。

第四節(jié)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

★一、能量表達(dá)★二、能量?jī)?yōu)化★三、序列優(yōu)化★四、序列-結(jié)構(gòu)專(zhuān)一性★五、底物專(zhuān)一性設(shè)計(jì)★六、金屬結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)第107頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

★一、能量表達(dá)

蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)通過(guò)能量表達(dá)（函數(shù)）或力場(chǎng)計(jì)算給定序列的能量，決定系列序列的能量順序，并了解蛋白質(zhì)內(nèi)的相互作用力。能量的表達(dá)包括內(nèi)坐標(biāo)項(xiàng)、范德華作用項(xiàng)、氫鍵項(xiàng)、靜電相互作用項(xiàng)、溶劑效應(yīng)項(xiàng)及熵效應(yīng)項(xiàng)等。項(xiàng)目的選擇是根據(jù)提高實(shí)驗(yàn)與理論的相關(guān)性的要求進(jìn)行的。改善的能量表達(dá)用于設(shè)計(jì)新的序列，完善這個(gè)循環(huán)。

在典型的分子力學(xué)力場(chǎng)中，共價(jià)鍵、鍵角、扭角等是必須考慮的。在產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)構(gòu)象集合（庫(kù)）和修飾蛋白質(zhì)主鏈時(shí)這些內(nèi)坐標(biāo)項(xiàng)都應(yīng)該包括。通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)分析能產(chǎn)生很好的內(nèi)坐標(biāo)項(xiàng)。※①內(nèi)坐標(biāo)項(xiàng)第108頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

★一、能量表達(dá)

范德華勢(shì)涉及蛋白質(zhì)內(nèi)的堆積，堆積專(zhuān)一性對(duì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)非常重要。對(duì)于蛋白質(zhì)內(nèi)核的設(shè)計(jì)，堆積是非常關(guān)鍵的。范德華勢(shì)提供了側(cè)鏈專(zhuān)一性堆積的物理基礎(chǔ)，據(jù)此可以設(shè)計(jì)很好折疊的蛋白質(zhì)。

氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)也非常重要，特別是對(duì)α螺旋及全序列設(shè)計(jì)。在某些蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中把氫鍵歸入靜電勢(shì)中?！蹥滏I項(xiàng)※②范德華作用項(xiàng)第109頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

★一、能量表達(dá)

靜電相互作用在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中是重要的，但靜電對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用尚有爭(zhēng)論。在溫和的溫度條件下，靜電相互作用還不能補(bǔ)償去溶劑能，但靜電相互作用對(duì)確定專(zhuān)一性非常重要。在極端的條件下鹽橋可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

※④靜電相互作用項(xiàng)第110頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天※⑤溶劑效應(yīng)項(xiàng)溶劑效應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)也非常重要。疏水效應(yīng)是蛋白質(zhì)折疊的驅(qū)動(dòng)力，可以理解為暴露于水的非極性基團(tuán)的能量損失依賴(lài)于表面積。計(jì)算蛋白質(zhì)-溶劑相互作用非常費(fèi)時(shí)，因此一些研究組發(fā)展了一些近似方法，利用辛醇-水以及氣-水的自由能。結(jié)合自由能與分子的表面積有關(guān)，這些能量可以直接用于蛋白質(zhì)內(nèi)核殘基，也可用于與蛋白質(zhì)折疊相聯(lián)系的溶劑暴露表面積相互作用的度量。第111頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

★一、能量表達(dá)

一個(gè)溶劑化的非折疊蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換一個(gè)側(cè)鏈到一個(gè)折疊蛋白質(zhì)，部分或完全去溶劑位置所要求的能量，與從水到氣體或一個(gè)非極化溶劑是不同的。但是轉(zhuǎn)化能與表面積的改變間近似的線(xiàn)性關(guān)系對(duì)這兩種情況都應(yīng)該是正確的。溶劑化能可以從溶劑可及表面的改變乘以原子的溶劑化參數(shù)得到。在能量函數(shù)中加入溶劑化項(xiàng)將有助于提高蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的理論預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性。

※⑤溶劑效應(yīng)項(xiàng)第112頁(yè),共122頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)

★一、能量表達(dá)

溶劑化與靜電相互作用是緊密聯(lián)系在一起的。存在多種靜電溶劑化模型：(a)半經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停蕾?lài)于溶劑化參數(shù)；(b)最簡(jiǎn)單模型，使用距離依賴(lài)介電常數(shù)/表面積計(jì)算靜電相互作用。事實(shí)證明，距離依賴(lài)介電常數(shù)/表面積模型沒(méi)有很好的相關(guān)性；近年來(lái)發(fā)展了一些新的模型，如Karplus于1999年提出的(c)環(huán)境依賴(lài)模型、(d)Poission-Boltzmann(PB)連續(xù)介質(zhì)模型以及(e)MM/PBSA模型等。在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中有時(shí)把簡(jiǎn)單熵效應(yīng)加到能量函數(shù)中。依賴(lài)于折疊的側(cè)鏈熵的改變與可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)目的改變相關(guān)。這種簡(jiǎn)單的熵效應(yīng)模型在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的實(shí)踐中尚未取得成功。

※⑥熵效應(yīng)項(xiàng)