葡萄籽中原花青素提取工藝優(yōu)化及其對氧化損傷修復(fù)作用研究

葡萄籽中原花青素提取工藝優(yōu)化及其對氧化損傷修復(fù)作用研究【摘要】目的：葡萄籽膠囊中原花青素提取工藝的優(yōu)化，研究原花青素對斑馬魚體內(nèi)氧化損傷的修復(fù)作用。方法:以原花青素含量為指示因子，對其萃取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，選出最優(yōu)的萃取條件；戊唑醇建造氧化應(yīng)激模型，用谷胱甘肽測定試劑盒檢測谷胱甘肽含量，電化學(xué)分析法檢測多巴胺含量，ImageJ軟件分析斑馬魚行為學(xué)，比較不同組斑馬魚體內(nèi)谷胱甘肽、多巴胺含量變化及行為學(xué)參數(shù)差異，從而判斷原花青素對氧化損傷的修復(fù)能力。結(jié)果：葡萄籽膠囊中原花青素的含量為682.6mg/g；空白組斑馬魚谷胱甘肽含量為359.0mg/100g，模型組斑馬魚谷胱甘肽含量為234.4mg/100g，DMSO組斑馬魚谷胱甘肽含量為328.4mg/100g，原花青素低濃度組（1mg/L）斑馬魚谷胱甘肽含量為255.0mg/100g，中濃度組（1.5mg/L）谷胱甘肽含量為268.1mg/100g，高濃度組（3mg/L）谷胱甘肽含量為307.3mg/100g。空白組斑馬魚多巴胺含量為4205.0ng/g，模型組斑馬魚多巴胺含量為4543.7ng/g，DMSO組斑馬魚多巴胺含量為4139.2ng/g，低濃度組斑馬魚多巴胺含量為4294.5ng/g，中濃度組斑馬魚多巴胺含量為4301.2ng/g，高濃度組斑馬魚多巴胺含量為4298.5ng/g，三個濃度組多巴胺均低于模型組，且與空白組相近；三個濃度組與空白組靜止時間及移動距離相近，模型組靜止時間顯著低于其他組，移動距離高于其他組。結(jié)論：由上述結(jié)果可得葡萄籽原花青素對斑馬魚體內(nèi)氧化損傷具有一定的修復(fù)作用?！娟P(guān)鍵詞】葡萄籽膠囊；原花青素；提取工藝；氧化損傷Optimizationofproanthocyanidinextractionfromgrapeseedanditsrepaireffectonoxidativedamage【Abstract】Objective:OptimizationoftheExtractionProcessofProanthocyanidinsfromGrapeSeedCapsulesandStudyontheRepairingEffectofProanthocyanidinsonOxidativeDamageinZebrafish.Methods:Usingtheoriginalanthocyanincontentasaindicator,theextractionprocesswasoptimizedusingresponsesurfacemethodologytoselecttheoptimalextractionconditions.Azebrafishoxidativestressmodelwasestablishedusingtebuconazole,withglutathioneassaykitusedtomeasureglutathionecontentandelectrochemicalanalysisusedtodetectdopaminecontent.ImageJsoftwarewasusedtoanalyzezebrafishbehavior,anddifferencesinglutathioneanddopaminecontentchangesaswellasbehavioralparameterswerecomparedbetweendifferentgroupsofzebrafish,Thus,therepairabilityofproanthocyanidintooxidativedamagewasevaluated.Results:Thecontentoforiginalanthocyaniningrapeseedscapsulesis682.6mg/g.Theglutathionecontentintheblankgroupofzebrafishis359.mg/100g,whiletheglutathionecontentinthemodelgroupofzebrafishis234.4mg/100g,andintheDMSOgroupis328.4mg/100g.Inthelowconcentrationgroupoforiginalanthocyanin(1mg/L),theglutathionecontentinzebrafishis255.mg/100g.Inthemediumconcentrationgroup(1.5mg/L),theglutathionecontentis268.1mg/100g.Inthehighconcentrationgroup(3mg/L),theglutathionecontentis307.3mg/100g.Thedopaminecontentintheblankgroupofzebrafishis4205.ng/g,whilethedopaminecontentinthemodelgroupofzebrafishis4543.7ng/g,andintheDMSOgroupis4139.2ng/g.Inthelowconcentrationgroupofzebrafish,thedopaminecontentis4294.5ng/g,whileinthemediumconcentrationgroup,itis4301.2ng/g,andinthehighconcentrationgroup,itis4298.5ng/g.Thedopaminecontentinallthreeconcentrationgroupsislowerthanthemodelgroupandsimilartotheblankgroup.Thestatictimeandmovingdistanceofthethreeconcentrationgroupsaresimilartotheblankgroup,whilethemodelgrouphasasignificantlylowerstatictimeandhighermovingdistancethanothergroups.Conclusion:Accordingtotheaboveresults,grapeseedproanthocyanidinshaveacertainrepaireffectonoxidativedamageinzebrafish.【Keywords】GrapeSeedCapsulesProanthocyanidinExtractiontechnologyOxidativedamage目錄1前言 前言原花青素(Procyanidins,PC)，也稱原花色素，是一種生物類黃酮，通常是紅褐色粉狀，氣微、味濕,溶于大多表面活性劑,是在植物中普遍生存的一大類多酚類化合物的統(tǒng)稱，是一個良好的自由基清除劑和類脂肪過氧化抑制劑。從分子結(jié)構(gòu)上,原花色素中最基本的成分為兒茶素、表兒茶素、以及兒茶素與表兒茶素形成的二聚體（圖1），其次為三聚體、四聚體等甚至十聚體[1]。按聚合度的大小，通常將二-五聚體稱為低聚原花青素（Procyanidolicoligomer，OPCs），將五聚體以上的稱為高聚原花青素[2]（(Procyanidolicpolymers，PPCs）。注：n=2-4稱為低聚原花青素，n>=5稱為高聚體圖1原花青素基本結(jié)構(gòu)葡萄籽中原花青素種類豐富，是一種有效的抗氧化劑，可以有效的防止脂質(zhì)的氧化和自由基的攻擊，保護(hù)人體免受氧化的損害，但由于其性質(zhì)不穩(wěn)定，不同的提取方法會對提取率和質(zhì)量產(chǎn)生影響[3]，因此，提取工藝是影響原花青素得率的重要因素，提取方法主要有酶提取法、超臨界CO2提取法等[4]，楊亞超等人利用超聲輔助萃取法，紫外-分光光度法，對葡萄籽原花色素進(jìn)行了分析，并用顯色反應(yīng)ABTS法對葡萄籽原花色素進(jìn)行了研究[5]；李瑞麗等人采用響應(yīng)面優(yōu)化法，所得到的最佳提取條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度60%，提取時間為60min[6]；原花青素含量的測定方式也有多種，包括鹽酸-正丁醇法、間接原子吸收法、電化學(xué)法、HPLC法[7-8]等，最常用的是鹽酸-香草醛法[9]來測定原花青素的含量。原花青素有多種功能，在化妝品中運(yùn)用提供了新思路[10]，具有美白祛斑、抗皺、防曬、保濕等功效，顯著的抗癌[11]，抗氧化抗衰老作用[12]，另外還有研究表明它可以抗心肌缺血再灌注損傷，其發(fā)揮抗動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作用[13]是通過抑制低密度脂蛋白氧化，有著廣泛的藥理活性及安全性[14]；高淵等人[15]發(fā)現(xiàn)OPC可通過其代謝物PCA發(fā)揮血管舒張功能保護(hù)作用，原花青素也能改善氧化損傷[16]，其含有數(shù)個酚性羥基，在機(jī)體內(nèi)被氧化產(chǎn)生氫離子，這些氫離子與自由基或氧化物結(jié)合，從而避免脂質(zhì)發(fā)生氧化[17]；氧化損傷指的是在細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程中自由基水平與細(xì)胞的抗氧化能力之間的氧化還原失去平衡，使得細(xì)胞抗氧化能力的相對不足，一些具有高毒性的活性氧自由基增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，活性氧基團(tuán)（ROS）的過量生成及抗氧化防護(hù)體系的破壞也是導(dǎo)致上述發(fā)生的重要原因，補(bǔ)充抗氧化劑可能有助于預(yù)防或緩解神經(jīng)退行性疾病。原花青素抗氧化作用的機(jī)制是通過增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化，并清除自由基來實現(xiàn)的，并且肝臟是生物代謝主要器官，其中谷胱甘肽含量豐富，毒害后會出現(xiàn)明顯反應(yīng)，谷胱甘肽（GSH）是一種低分子清除劑，對于動植物而言，它是一種多功能的抗氧化肽，在體內(nèi)普遍存在并且用于抵抗氧化損傷[18]，可以清除O2、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是一種由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸構(gòu)成的三肽，它是人體組織中一種重要的非蛋白合成物質(zhì)，同時也是GSH-PX和GST兩種酶的底物，是這兩種酶對氫過氧化物進(jìn)行降解的必要物質(zhì)，近年來，研究表明，谷胱甘肽還可以促進(jìn)維生紊E還原為還原狀態(tài)，可能與加重氧化損傷有關(guān)，因此，谷胱甘肽的含量是評價人體抗氧化能力的一個重要指標(biāo)[19]，其測量方法有比色法、HPLC法、熒光法等。氧化應(yīng)激也是多巴胺能功能細(xì)胞神經(jīng)紊亂的重要原因[20]，多巴胺是大腦中含量最高的一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，作為神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能，特別是對運(yùn)動控制起到重要作用[21],其含量與神經(jīng)系統(tǒng)健康與否密切相關(guān)，因此多巴胺含量的多少是檢測機(jī)體神經(jīng)損傷程度的重要因素，檢測多巴胺含量的方法有HPLC法、液相質(zhì)譜聯(lián)用和電化學(xué)分析法[22]。關(guān)于體內(nèi)氧化損傷的研究對象，陳晨[23]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚是一種常見的神經(jīng)科學(xué)模式生物，它擁有與人類類似的神經(jīng)發(fā)育等特征，斑馬魚和人類的基因有著70%的同源性，且84%的人類疾病相關(guān)基因都能在斑馬魚組織中找到，作為主要模式生物之一被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和藥物篩選等科研領(lǐng)域[24]，所以在對斑馬魚做出的實驗結(jié)果也多適用于人體，可用于藥物恢復(fù)性的研究及篩選；TaoHuang[25]等人發(fā)現(xiàn)三唑類藥物對斑馬魚的線粒體氧化磷酸化受損和氧化應(yīng)激，以及脂質(zhì)代謝失調(diào)具有影響，這種代謝紊亂會導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育遲緩、畸形和異常的運(yùn)動情況；氧化損傷后導(dǎo)致斑馬魚的神經(jīng)損傷也會影響其運(yùn)動軌跡，Sharma等人以神經(jīng)系統(tǒng)毒性角度探究[26-28]斑馬魚運(yùn)動軌跡所受影響，JuliaCanzian等人[29]通過對斑馬魚行為學(xué)的檢測來判斷斑馬魚神經(jīng)受損的程度，斑馬魚行為學(xué)檢測軟件有斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)及ImageJ。因此本實驗以斑馬魚為研究對象，戊唑醇建造氧化應(yīng)激模型，DMSO為萬能溶劑溶解原花青素，用比色法檢測各組斑馬魚體內(nèi)谷胱甘肽含量，電化學(xué)分析法檢測多巴胺含量變化以及ImageJ檢測行為學(xué)差異，研究原花青素對體內(nèi)氧化損傷的修復(fù)作用，為原花青素在動物體內(nèi)實驗上提供實驗參考，為原花青素的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。2試劑與儀器2.1實驗試劑本實驗所用實驗試劑如表1所示：表1試劑的規(guī)格及廠家試劑規(guī)格生產(chǎn)廠家葡萄籽膠囊300顆/盒澳大利亞HealthyCare公司戊唑醇粉末5g拜耳股份公司兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品20mg對照品實驗耗材中心谷胱甘肽試劑盒100T/96樣南京建城生物工程研究所香草醛100g南京建城生物工程研究所濃鹽酸分析純廣州化學(xué)試劑廠無水乙醇分析純廣州化學(xué)試劑廠甲醇分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠DMSO（二甲基亞砜）分析純天津市科密化學(xué)試劑有限公司去離子水廣東藥科大學(xué)2.2實驗儀器本實驗所用實驗儀器如表2所示：表2儀器的型號及廠家儀器型號廠家電子分析天平ML-204梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠烘箱ST-01佛山市順德區(qū)柏昊金屬制品有限公司紫外分光光度計UV-1750日本島津公司離心機(jī)TD-WS/55湖南平凡科技有限公司電化學(xué)工作站CHI660E/CH上海辰華儀器有限公司反滲透純水設(shè)備CDLF1廣州市濾博水處理科技有限公司2.3實驗動物Tubingen品系斑馬魚，購于南京-樹梨花生物有限公司3實驗方法3.1原花青素提取條件的優(yōu)化3.1.1單因素試驗以原花青素為評價對象，考察了乙醇濃度、萃取時間和萃取溫度對萃取率的影響。（1）溶劑濃度的影響在圓底燒瓶中準(zhǔn)確稱取4份葡萄籽粉各0.1g，向其中加入濃度為20%，40%，60%，80%的乙醇溶劑10mL,在60℃水浴恒溫提取60min,過濾后用乙醇定容至50mL[30]；（2）提取溫度的影響在圓底燒瓶中準(zhǔn)確稱取4份葡萄籽粉各0.1g，向其中添加10mL60%的乙醇，水浴恒溫分別為30℃,50℃,70℃,90℃提取60min,過濾之后用乙醇定容至50mL[30]；（3）提取時間的影響在圓底燒瓶中準(zhǔn)確稱取4份葡萄籽粉各0.1g，向其中加入10mL60%的乙醇溶劑，水浴恒溫提取60min，80min,100min,120min,過濾后用乙醇定容至50mL[30]；香草醛-鹽酸法測定含量：將上述濾液0.4mL，添加2.4mL4%香草醛甲醇溶液，并將其混合均勻，之后再加入1.2mL濃鹽酸，將其完全混合均勻，在室溫下進(jìn)行顯色15分鐘，在500nm波長下進(jìn)行吸光度的測定[31]。3.1.2響應(yīng)面分析法優(yōu)化原花青素提取根據(jù)響應(yīng)面分析法的原理，通過單因素的實驗，對提取時間、提取溫度和乙醇濃度優(yōu)選三個水平[32]，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件，結(jié)果見表3。表3響應(yīng)面試驗影響因素水平與編碼水平水平及編碼-101A乙醇濃度（%）204060B提取溫度（℃）305070C提取時間（min)801001203.2原花青素的含量測定記錄制作標(biāo)準(zhǔn)曲線精確稱取10mg的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，放入燒杯中，加乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙醇定容。分別量取1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL和3.5mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25mL容量瓶，用乙醇定容，量取上述5個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.4mL置于試管中，向試管中加入4%香草醛甲醇溶液2.4mL和濃鹽酸1.2mL，再取0.4mL乙醇溶液加入4%香草醛甲醇溶液2.4mL和濃鹽酸1.2mL作為空白對照。搖晃均勻后進(jìn)行遮光處理，將上述反應(yīng)完成的溶液，在500nm的波長下測定上述反應(yīng)的吸光值，將吸光度做為y軸，x軸為兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用鹽酸-香草醛法去測定原花青素的含量，將優(yōu)化提取工藝后得到原花青素吸光度，葡萄籽原花青素的含量用下列公式去計算：Y1=v×x×n其中：Y1為提取物中原花青素總量，mg/g；v為提取液體積，mL；x為提取液濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；m為葡萄籽粉末質(zhì)量g。3.3氧化損傷模型的建立3.3.1戊唑醇濃度的確定取50條斑馬魚，分5組放入培養(yǎng)皿中，每組10條斑馬魚于0.5L溶液，分別置于戊唑醇濃度為0、0.5mg/L、0.7mg/L、1mg/L、2mg/L。暴露48h后記錄每組的死亡個體數(shù)，將致死數(shù)為0的戊唑醇濃度就作為模型組中戊唑醇濃度。3.3.2斑馬魚行為學(xué)的測定空白組與模型組培養(yǎng)四天后分別取5條斑馬魚，依次放入培養(yǎng)皿中，待其適應(yīng)培養(yǎng)皿環(huán)境2-3分鐘后，拍攝視屏長度為2min的動作捕捉畫面。使用ImageJ運(yùn)動跟蹤軟件以每秒25幀的速度測量游泳活動，在預(yù)定義的場地內(nèi)捕捉游泳動作(一個場地對應(yīng)一個孔洞，內(nèi)徑約為120毫米)[33]。對每個動畫文件設(shè)置檢測變量，以保證對所有斑馬魚的最佳檢測。隨后，使用ImageJ軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并提供斑馬魚的移動距離與靜止時間，以表征每個個體的游泳活動。將得到結(jié)果與對照組進(jìn)行對比，記錄實驗數(shù)據(jù)。3.3.3多巴胺的含量測定將斑馬魚頭部剪下，使用眼科剪沿著脊柱像斑馬魚兩眼之間剪開，暴露出腦組織，使用解剖針將腦組織從中分離后置于放有生理鹽水的離心管中。將已放入腦組織的離心管放進(jìn)35攝氏度的恒溫水浴，保證組織的活性，放置待用。從離心管中取出制得的斑馬魚腦組織，用冰鹽水漂洗，吸水紙吸干，稱重記錄數(shù)據(jù)后放入研磨缽中，加入適量的人工腦脊液，用手在冰水浴中進(jìn)行5min的研磨，將勻漿液裝入1.5毫升離心管內(nèi)，以2500rpm/min離心10min，取出上清液以做檢測。取1mL上述步驟制得的腦組織上清液于燒杯中，再加入19mL的人工腦脊液，將溶液混合均勻，等待測定。使用CHI660E電化學(xué)工作站，采用飽和甘汞電極參比電極、鉑片對電極、制得的修飾碳纖維電極作為工作電極，使用差分脈沖伏安法(DPV)作為測定方法[34]，在起始電壓為?0.3，終止電壓為0.6V，脈沖振幅為50mV，脈沖寬度為0.2s，脈沖周期為0.5s的條件下測定，記錄峰高。實驗最佳條件下，在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，調(diào)節(jié)掃描速率為10mv/s,從-0.4v—0.6v之間進(jìn)行掃描，以縱坐標(biāo)為多巴胺濃度，橫坐標(biāo)為峰電流大小建立多巴胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，電流單位為A，濃度單位為ug/L。按下列公式計算斑馬魚腦組織中多巴胺含量。斑馬魚腦組織中多巴胺含量=溶液中多巴胺濃度3.3.4谷胱甘肽的含量測定斑馬魚的解剖（見圖2）：將斑馬魚放入裝有冰水混合的燒杯中20分鐘左右，直到斑馬魚靜止不動。將其置于泡沫板上，用針插入眼部及尾部固定，剪開腹部并取出內(nèi)臟團(tuán)，將其放入洗凈并滴有幾滴生理鹽水的表面皿中，使用解剖針及鑷子將肝組織從中分離出來，分離出的肝組織置于加入生理鹽水的離心管內(nèi)。圖2斑馬魚解剖示意圖斑馬魚組織勻漿的制備：從離心管中取出所得的斑馬魚組織，用冰鹽水漂洗后吸水紙吸干，稱重記錄數(shù)據(jù)后放入研缽中，加入適量的勻漿遞質(zhì)，手動研磨5分鐘使組織勻漿化。在2500轉(zhuǎn)/分下，將該勻漿液注入1.5ml的離心管中離心10min，取上清液進(jìn)行測定。制備上清液后進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后進(jìn)行谷胱甘肽含量計算（按標(biāo)準(zhǔn)曲線法查表）。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液按按表4進(jìn)行配制。表4谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制稀釋管123456標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液（uL）10008006004002000100umol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液（uL）02004006008001000標(biāo)準(zhǔn)品濃度（umol/L）020406080100用稀釋后的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照操作表，將空白管調(diào)零，420nm處，用1厘米的光學(xué)直徑，測量每一管吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。谷胱甘肽質(zhì)量/肝重量（mg/100g）=濃度x2.55x12.75x307x3.4氧化損傷修復(fù)作用的研究斑馬魚給藥：將斑馬魚分6組，每組別放入10條受試斑馬魚，每組溶液為1000mL，其中四組加入一定量的戊唑醇，一組加入濃度為1%的DMSO溶液，另一組加入去離子水，每兩天更換一次，周期為四天。將6組魚分別稱為空白組、DMSO組、模型組、低濃度組（1mg/L）、中濃度組（1.5mg/L）和高濃度組（3mg/L）；空白組，DMSO組及模型組繼續(xù)喂養(yǎng)斑馬魚，其余組置于戊唑醇溶液中，每組溶液均為1000mL，每兩天更換一次，給藥周期為七天。按“3.3.2斑馬魚行為學(xué)的測定”在第十一天檢測斑馬魚行為學(xué)，“3.3.3多巴胺的含量測定、3.3.4谷胱甘肽的含量測定”在第十二天檢測谷胱甘肽及多巴胺含量。4結(jié)果與分析4.1單因素試驗根據(jù)提取溫度、時間、乙醇濃度對原花青素含量的影響作圖，結(jié)果如圖3所示。ABC注：A.提取時間影響圖；B.溫度影響圖；C.乙醇濃度影響圖圖3各種單因素對葡萄籽原花青素含量的影響由圖3(A)可知，提取時間為100min時葡萄籽原花青素含量最高，原花青素含量隨著時間的增大而逐漸減少，故選擇時間為100min為最佳提取時間。由圖3(B)可知，在50℃時葡萄籽原花青素含量最高，隨著溫度的上升而逐漸減少，故選擇50℃為最佳提取溫度。由圖3（C）可知，原花青素含量隨著乙醇濃度的升高先上升后下降，在40%時達(dá)到最高，可能是因為隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，其對氫鍵破壞能力增大，而水對其滲透力減弱，因此隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會導(dǎo)致原花青素的含量減小。故確定40%乙醇為最佳提取濃度。4.2響應(yīng)面分析法優(yōu)化原花青素的提取4.2.1響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方案進(jìn)一步試驗。結(jié)果見表5。編號No.A提取溫度/（℃）B乙醇濃度/%C提取時間/（min）原花青素含量/（mg/g923020100493.137060100551.845040100669965040100682.677020100522.585040100671.395040100680.4105020120524.7115040100684.9127040120603.713506080567.6145060120630.715502080529.2163060100574.317704080592.4表5響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果4.2.2響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗用DesignExpert10分析軟件建立方程:Y=0.3938+0.0010A+0.0141B+0.0044C-0.0057AB+0.0003AC-0.0075BC-0.0244A^2-0.0387B^2-0.0122C^2；由模型的“P值”＜0.0001可知該回歸方程模型達(dá)到了較為顯著的水平，可靠性較高；決定系數(shù)R2=99.17%；失擬項>0.05,不顯著，說明擬合度較好；綜上，該模型可用于預(yù)測最佳提取條件。注：R2=0.9917,RAdj2=0.9811,RPred2=0.9122；CV%=1.07<10。P<0.05,差異顯著，P<0.014.2.3單因素交互作用及葡萄籽原花青素提取驗證試驗由DesignExpert10分析軟件得到最佳提取條件為溫度49.959℃，乙醇濃度為44.124%，提取時間為104.872min。各單因素交互作用的等高線及響應(yīng)面曲面圖見下圖4-6。圖4提取溫度和乙醇濃度對原花青素含量的等高線及響應(yīng)面曲面圖圖5提取溫度和提取時間對原花青素含量的等高線及響應(yīng)面曲面圖圖6提取時間和乙醇濃度對原花青素含量的等高線及響應(yīng)面曲面圖由圖4-圖6可知，響應(yīng)面曲面的陡峭度大小順序為AB>BC>AC,且等高線均呈橢圓形，表明乙醇濃度和提取溫度、提取溫度和提取時間、乙醇濃度和提取時間的交互作用對原花青素得率影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。4.3原花青素含量測定結(jié)果兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7，相關(guān)系數(shù)r=0.9958。圖7兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線代入3.2中公式可得最佳提取條件下葡萄籽原花青素含量為682.6mg/g。4.4氧化損傷修復(fù)作用測定結(jié)果與分析4.4.1氧化應(yīng)激模型的建立表6戊唑醇給藥濃度及其致死率戊唑醇濃度（mg/L）00.50.712死亡數(shù)量（條）004710致死率（%）004070100如表6所示，當(dāng)戊唑醇濃度為0.5mg/L死亡數(shù)量為0，致死率為0。腦組織按照“3.3.3多巴胺的含量測定”方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8，相關(guān)系數(shù)r=0.9957。圖8多巴胺含量標(biāo)準(zhǔn)曲線注：*與空白組相比，p＜0.05，差異顯著圖9模型組與空白組多巴胺含量柱狀圖如圖7及圖9所示，當(dāng)戊唑醇濃度為0.5mg/L，模型組斑馬魚腦中多巴胺含量高于空白組;肝組織按照“3.3.7谷胱甘肽的含量測定”方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖10，相關(guān)系數(shù)r=0.9987；計算得出谷胱甘肽含量見圖11.圖10谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著圖11空白組與模型組谷胱甘肽含量柱狀圖如圖11所示，當(dāng)戊唑醇濃度為0.5mg/L時，模型組谷胱甘肽含量低于空白組；圖12斑馬魚運(yùn)動軌跡（b）注：**與空白組相比，差異顯著。圖13空白組與模型組斑馬魚行為學(xué)參數(shù)如圖12、圖13所示，圖13（a）中可看出模型組斑馬魚運(yùn)動距離高于空白組，（b）中可看出靜止時間低于空白組；由此可得模型組使斑馬魚運(yùn)動行為增強(qiáng)。綜上所述，本實驗可使用0.5mg/L的戊唑醇建造氧化損傷模型。4.4.2多巴胺含量測定結(jié)果將六組斑馬魚解剖后，多巴胺濃度與峰電流關(guān)系見圖14；多巴胺含量測定結(jié)果見圖15。圖14多巴胺濃度與峰電流關(guān)系注：ns與空白組相比，p>0.05,差異不顯著；*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著圖15不同組多巴胺含量柱狀圖由圖15可得DMOS組與空白組差異不顯著，說明DMSO組對實驗的影響可忽略；模型組多巴胺含量較空白組增加8.1%，低濃度組多巴胺含量較模型組減少5.5%，中濃度組較模型組減少5.3%，高濃度組較模型組減少5.4%，且三組均與空白組差異不顯著，由此可得原花青素會減輕多巴胺增多而導(dǎo)致的機(jī)體神經(jīng)損傷。4.4.3谷胱甘肽含量測定結(jié)果將六組斑馬魚解剖后，肝組織按照“3.3.7谷胱甘肽的含量測定”進(jìn)行含量檢測，結(jié)果見圖16。注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，p<0.01，差異顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著圖16不同組谷胱甘肽含量柱狀圖從圖16中可得，DMSO組與空白組差異不顯著，可忽略其影響；模型組谷胱甘肽含量較空白組下降34.6%；低濃度組較模型組谷胱甘肽含量上升11.7%，中濃度組較模型組谷胱甘肽含量上升23.1%，高濃度組較模型組谷胱甘肽含量上升49.9%；由此可得葡萄籽原花青素對氧化損傷具有一定的修復(fù)作用，高濃度組可使谷胱甘肽含量恢復(fù)致正常水平。4.4.4斑馬魚行為學(xué)檢測結(jié)果ImageJ測得斑馬魚行為學(xué)結(jié)果見圖17、18。注：a為空白組，b為模型組，c為DMSO組，d為1mg/L原花青素組，e為1.5mg/L原花青素組，f為3mg/L原花青素組圖17各組斑馬魚行為學(xué)測定結(jié)果（b）注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異顯著圖18不同組別斑馬魚具體行為學(xué)數(shù)據(jù)由圖18（a）（b）與空白組相比，斑馬魚暴露在模型組時靜止時間減少，移動距離增加；而低、中、高濃度組以及與空白組相比移動距離與靜止時間差異均不顯著；結(jié)果表明，戊唑醇會導(dǎo)致斑馬魚運(yùn)動行為增強(qiáng)，給予原花青素則會使其有所恢復(fù)。5小結(jié)采用響應(yīng)面法得到葡萄籽膠囊原花青素的最優(yōu)提取條件為溫度49.959℃，乙醇濃度為44.124%，提取時間為104.872min，此條件下原花青素含量為682.6mg/g。低、中、高濃度組斑馬魚肝組織中谷胱甘肽含量均低于空白組，高于模型組，且高濃度組與空白組差異不顯著，說明葡萄籽膠囊原花青素對氧化損傷有一定的修復(fù)作用，高濃度組會使其恢復(fù)到正常水平；斑馬魚腦組織中模型組的多巴胺含量略高于空白組，而低、中、高濃度組均組低于模型組，說明原花青素會減輕多巴胺導(dǎo)致的神經(jīng)損傷；用ImageJ軟件處理后，模型組斑馬魚靜止時間低于其他組，移動距離高于其他組，與空白組相比差異較顯著，說明戊唑醇使斑馬魚運(yùn)動行為增強(qiáng)，而低、中、高濃度組與空白組相近，差異不顯著，說明給予一定的原花青素對斑馬魚運(yùn)動行為增強(qiáng)有所恢復(fù)。通過優(yōu)化葡萄籽膠囊原花青素的提取條件，可以探索更高效、經(jīng)濟(jì)的提取技術(shù)；研究證明了原花青素對斑馬魚氧化損傷的修復(fù)作用，對開發(fā)原花青素類產(chǎn)品具有重要的價值，為原花青素在動物體內(nèi)實驗上提供實驗參考。

參考文獻(xiàn)步文磊,王茵.原花青素的生物活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊),2007:311-315.張慧文,張玉,馬超美.原花青素的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2015,36:296-304.鄭永麗.葡萄籽中原花色素的分析、提取與純化[J].河北工業(yè)大學(xué),2004.劉玟君,李金洲,陳子雋,等.原花青素的研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2021,60:5-9.楊亞超,寧夢帆,菅蓁.煙臺產(chǎn)區(qū)酒渣葡萄籽原花青素含量與抗氧化性研究[J].現(xiàn)代食品,2022,28:173-175.李瑞麗,張玎婕,趙琪,等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助浸提葡萄籽原花青素[J].食品研究與開發(fā),2021,42:53-60.MadiganD,McMurroughI,SmythMR.Determinationofproanthocyanidinsandcatechinsinbeerandbarleybyhigh-performanceliquidchromatographywithdual-electrodeelectrochemicaldetection[J].Analyst,1994,119:863-868.ShojiT,YanagidaA,KandaT.Gelpermeationchromatographyofanthocyaninpigmentsfromroseciderandredwine[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,1999,47:2885-2890.桑雅麗,李曉春,王欣宇,等.山葡萄籽中原花青素的提取及其含量測定[J].赤峰學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2018,34:40-42.顧龍建.基于谷胱甘肽設(shè)計的抗氧化肽活性研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2013.胥鑫萌,王文權(quán),孫潔怡,等.原花青素在化妝品中的應(yīng)用[J].中國洗滌用品工業(yè),2021:56-60.邱蘭麗,顏梓一,賀延苓,等.原花青素抗癌的生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2020,27:173-176.吳金瀅,胡迪,孫新.原花青素抗衰老作用的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,2022,43:452-454.TerraX,Femandez-LarreaJ,PujadasG,etal.Inhibitoryeffectsofgrapeseedprocyanidinsonfoamcellformationinvitro[J].AgricFoodChem,2009,57:2588－2594．尹夢宇.原花青素定量分析方法及抗氧化功效的應(yīng)用研究[D].長沙:湖南師范大學(xué),2019.高淵,王雅慧,嚴(yán)嘯,等.原花青素對C57BL／6J小鼠動脈舒張功能保護(hù)作用的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2013,13:553-556.饒美榮,曾芬,鐘咪,等.原花青素抗UVB誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響[J].中成藥,2022,44:4044-4049.步文磊,王茵.原花青素的生物活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊),2007:311-315.宋玉果,王滌新.谷胱甘肽作為脂質(zhì)過氧化損傷指標(biāo)的研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1999,33:317-319.段理人,李俊英,彭蓉.帕金森病多巴胺失調(diào)綜合征的研究進(jìn)展[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2019,19:6.李凡,舒斯云,包新民.多巴胺受體的結(jié)構(gòu)和功能[J].中國神經(jīng)科學(xué)雜志,2003:405-410.成慧靈,周美,許茜,等.利用七氯對斑馬魚多巴胺神經(jīng)元毒性影響構(gòu)建帕金森病模型[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2022,39:1047-1053.陳晨.典型抗抑郁藥物阿米替林對斑馬魚的行為毒性及機(jī)制研究[D].南京：江蘇大學(xué),2022.HuangT,JiangH,ZhaoY,etal.Acomprehensivereviewof1,2,4-triazolefungicidetoxicity