Ti3C2-MgIn2S4異質(zhì)結(jié)與可控釋放策略集成用于miRNA光電傳感器設(shè)計(jì)

摘要從光電化學(xué)傳感機(jī)理入手，對(duì)光電化學(xué)傳感技術(shù)進(jìn)行了歸類，并對(duì)各種光電化學(xué)傳感技術(shù)進(jìn)行了綜述?？偨Y(jié)了光電化學(xué)傳感技術(shù)的發(fā)展方向和前景。光電極修飾工藝的惡劣操作條件和耗時(shí)的制造工藝限制了光電化學(xué)（PEC）傳感器的潛在應(yīng)用。為了克服這些缺點(diǎn)，本研究引入了一種獨(dú)特的用于microRNA-155（miRNA-155）檢測(cè)的分開(kāi)型PEC生物傳感器。具體而言，采用Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)作為光敏材料，并采用由多功能卟啉基金屬有機(jī)骨架（PCN-224）組成的靶控葡萄糖釋放系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)放大。Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)有效地分離了光生電子和空穴，提高了光電轉(zhuǎn)換效率，為PEC生物傳感過(guò)程中提供了較強(qiáng)的初始光電流信號(hào)。與此同時(shí)，多孔的PCN-224作為靈活的納米容器，使用捕獲探針（CP）封裝葡萄糖。在miRNA-155存在的情況下，CP形成CP-miRNA-155復(fù)合物，然后與PCN-224分離，可控地釋放被捕獲的葡萄糖。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產(chǎn)生的H2O2，過(guò)氧化氫對(duì)Ti3C2/MgIn2S4表面產(chǎn)生的空穴起到清除作用，顯著增加了可見(jiàn)光照射下的光電流信號(hào)值。最后，該傳感器表現(xiàn)出良好的miRNA-155檢測(cè)性能，檢測(cè)限低（0.17fM），線性范圍寬（0.5fM-1.0nM）。因此，本文提出的基于Ti3C2/MgIn2S4的分開(kāi)型PEC傳感器是一種很有前途的miRNA-155敏感準(zhǔn)確檢測(cè)工具，為其他高性能傳感器的創(chuàng)新制備提供了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：光電化學(xué)；納米材料；異質(zhì)結(jié)；分開(kāi)型生物傳感器；金屬有機(jī)骨架ABSTRACT

Starting

from

the

principle

of

PEC

sensor,

it

classifies

it

and

summarizes

different

sensing

strategies

of

PEC.

Finally,

the

development

trend

and

prospect

of

PEC

biosensor

are

summarized.Theharshoperatingconditionsandtime-consumingfabricationprocessofthephotoelectrodemodificationprocesshavelimitedthepotentialapplicationsofphotoelectrochemicalsensors.Toovercomethesedrawbacks,thisstudyintroducedauniquesplit-typePECbiosensorformicroRNA-155(miRNA-155)detection.Specifically,aTi3C2/MgIn2S4heterojunctionwasadoptedasthephotosensitivematerial,andatarget-controlledglucosereleasesystem,comprisingamultifunctionalporphyrin-basedmetal-organicframework(PCN-224),wasusedforsignalamplification.TheTi3C2/MgIn2S4heterojunctioneffectivelyseparatedthephotoelectronsandholes,andamelioratedtheconversionefficiencyofphotoelectricity,offeringastronginitialphotocurrentsignalduringPECbiosensing.Meanwhile,theporousPCN-224actedasanimblenanocontainerthatencapsulatedglucoseusingacaptureprobe(CP).InthepresenceofmiRNA-155,theCPformedaCP-miRNA-155complexandthendetachedfromPCN-224,controllablyreleasingthetrappedglucose.Theoxidizationofglucosebyglucoseoxidaseresultedinhydrogenperoxidegeneration,whichactedasascavengerfortheholesgeneratedonthesurfaceofTi3C2/MgIn2S4,andsignificantlyimprovedthelightcurrentrespondundervisiblelightirradiation.Finally,thesensorexhibitedgoodperformanceformiRNA-155detectionwithalowdetectionlimit(0.17fM)andwidelinearityrange(0.5fM-1.0nM).Thus,theproposedTi3C2/MgIn2S4-basedsplit-typePECsensorisaprospectivetoolforsensitiveandaccuratecheckofmiRNA-155andprovidesaninnovativebasisforthepreparationofotherhigh-performancesensors.Keywords：photochemistry；nanomaterials；heterojunction；Separate

type

biosensor；Metal-organic

skeleton1前言1.1光電化學(xué)傳感器的研究背景和意義隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染的加劇，各種疾病的發(fā)生，人們對(duì)儀器的便捷性、快速性以及背景信號(hào)的敏感性提出了更高的要求。光電化學(xué)分析技術(shù)的本質(zhì)是電化學(xué)原理，具有廣闊的適用范圍。該技術(shù)不但能檢測(cè)到各種環(huán)境中的重金屬和有機(jī)殺蟲(chóng)劑，而且能檢測(cè)DNA、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、抗原、抗體等。與電致化學(xué)發(fā)光（ECL）、電化學(xué)分析等技術(shù)相比，光電電化學(xué)分析技術(shù)更具優(yōu)越性[1]。光電化學(xué)分析與電致化學(xué)發(fā)光分析的工作機(jī)理完全不同，即光電化學(xué)分析中的光電化學(xué)分析與電致化學(xué)分析有著本質(zhì)的區(qū)別。該方法類似于電致化學(xué)發(fā)光，但其探測(cè)信號(hào)與激發(fā)光源分離，所以背景信號(hào)相對(duì)較低。這種制備技術(shù)具有成本低、靈敏度高、操作方便等特點(diǎn)。而利用同樣的光敏材料對(duì)同樣的物體進(jìn)行檢測(cè)，則可以降低探測(cè)下限。因此，基于該方法的光、電、化學(xué)分析方法受到人們的高度重視[2-3]。當(dāng)前，以光電化學(xué)為基礎(chǔ)的生物傳感技術(shù)，利用各種分析和探測(cè)手段，對(duì)光電化學(xué)過(guò)程中光電信息進(jìn)行探測(cè)。在此，我們總結(jié)了基于電活性物質(zhì)的光電化學(xué)生物傳感技術(shù)的研究進(jìn)展[4]，基于生物親和機(jī)理的光電化學(xué)生物傳感技術(shù)[5]1.2光電化學(xué)傳感器的基本分類光電電化學(xué)（PEC）技術(shù)已被廣泛地用于生命科學(xué)中，并已有一系列的研究結(jié)果。在光電化學(xué)生物傳感技術(shù)迅速發(fā)展的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生了一系列的光電化學(xué)生物傳感技術(shù)。按照檢測(cè)基準(zhǔn)，光電化學(xué)傳感可劃為電勢(shì)型和電位型（主要是光學(xué)尋址電位型）兩類。自從Hafeman于1988年首次報(bào)道了一種基于電解質(zhì)-絕緣體-半導(dǎo)體的新型傳感器件之后，光學(xué)尋址電位型傳感器件受到了極大的重視，并且得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。光尋址傳感器被廣泛用于檢測(cè)離子[11]、細(xì)胞[12]、DNA[13]及免疫分子[14]等多個(gè)領(lǐng)域。由于這種方法使用起來(lái)比較簡(jiǎn)便，所以比較普遍。按其與生物體的結(jié)合機(jī)理，目前已知的主要有兩種類型：催化式和親和式。按照光電活性物質(zhì)的類別劃分，它可以被劃分成金屬?gòu)?fù)合物型、小有機(jī)分子型、納米復(fù)合物型和半導(dǎo)體納米顆粒型等。除此之外，根據(jù)傳感器的類型還可以劃分為：電活性物質(zhì)型、空間位阻型和酶標(biāo)記型等。1.3光電化學(xué)傳感器不同傳感策略的應(yīng)用光電化學(xué)是一種新的研究方向近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的，它能夠?qū)ι锎蠓肿舆M(jìn)行特異性的檢測(cè)和處理。光電電化學(xué)傳感技術(shù)將光學(xué)檢測(cè)技術(shù)與電化學(xué)技術(shù)有機(jī)地融合在一起，由于其適合小型化、高安全性、成本低等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種新興的傳感技術(shù)。目前，基于被測(cè)物質(zhì)自身特性的多種光電化學(xué)分析方法均表現(xiàn)出較高的靈敏性，為進(jìn)一步發(fā)展光電化學(xué)分析技術(shù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。利用光敏材料作為標(biāo)記，通過(guò)對(duì)其光電流進(jìn)行調(diào)制，達(dá)到對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行探測(cè)，是目前最簡(jiǎn)單的一種方案。這一節(jié)將重點(diǎn)介紹PEC傳感器中的不同分析策略，以便讓讀者更加清晰地認(rèn)識(shí)到它們的應(yīng)用范圍以及它們的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。1.3.1光電活性物質(zhì)做標(biāo)記將有機(jī)小分子、金屬配合物和量子點(diǎn)等有機(jī)分子用作光電化學(xué)傳感材料。該材料既可以通過(guò)插入DNA分子中進(jìn)行電子傳輸，也可以通過(guò)與DNA分子末端相連實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的光響應(yīng)增強(qiáng)。蒽醌類化合物（AQ）作為光敏劑和還原試劑，被應(yīng)用于光電檢測(cè)領(lǐng)域?；诖耍琌kamoto等首先將蒽醌類化合物引入到光電化學(xué)傳感體系中，并將其植入到DNA分子中，使其與DNA分子發(fā)生交互影響，從而產(chǎn)生良好的光電化學(xué)傳感性能。該陰極電流是由將雙鏈DNA接枝到金電極上，并利用靜電作用在DNA中插入蒽醌類分子而得到的（見(jiàn)圖1.1）。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，光生空穴在DNA間的輸送效率被核酸序列強(qiáng)烈影響，換句話說(shuō)，空穴轉(zhuǎn)移效率會(huì)因?yàn)榭昭ㄖg距離的增加而下降。圖1.1AQ修飾的DNA鏈修飾在金電極上的電流產(chǎn)生機(jī)制圖吲哚二吡啶類（Ru-bipy）化合物是一類重要的熒光探針，在光電化學(xué)等領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值。研究人員利用兩個(gè)PIND與Ru(bpy)22+偶聯(lián)，制備出一類新型的具有雙重嵌入性的聯(lián)吡啶類光敏體（PIND-Ru-PIND）。PIND-Ru-PIND是一種新型的具有高比表面積、高比表面積和高比表面積的多級(jí)結(jié)構(gòu)的金屬氧化物。在循環(huán)過(guò)程中，草酸起到了一個(gè)電子供體的作用，并對(duì)其進(jìn)行了信號(hào)放大。利用這類材料的低分解特性以及核酸/PIND-Ru-PIND材料優(yōu)異的光電特性，有望在無(wú)模板PCR條件下，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子的高靈敏分析。與伏安法相比，該方法的敏感度提升了4個(gè)數(shù)量級(jí)。有機(jī)小分子既能充當(dāng)電子載體，通過(guò)改變其所帶的電流，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的探測(cè)，又能對(duì)DNA的損傷進(jìn)行探測(cè)。研究人員在前期研究的基礎(chǔ)上，發(fā)展了兩種DNA損傷探測(cè)新技術(shù)。一種是以氧化為基礎(chǔ)的光電化學(xué)法（如圖1.2（A）），一種是光電指示劑（如圖1.2（B））。結(jié)果表明，該技術(shù)將全部反應(yīng)物都固定在了電極上，且反應(yīng)物均被固定在了電極上，因此，該技術(shù)更為便捷。而內(nèi)嵌的方式由于其高的信號(hào)強(qiáng)度，基本上無(wú)須光電流探測(cè)器。本項(xiàng)目將發(fā)展一種基于光電化學(xué)傳感技術(shù)的DNA損傷分析新技術(shù)。但該類技術(shù)對(duì)雙氧水（H2O2）的要求較高，且僅能對(duì)與DNA相互作用的有機(jī)化合物進(jìn)行分析，因而不適合用于生物信息學(xué)分析。為解決上述問(wèn)題，研究人員隨后提出了一種新型的基于光生載流子輸運(yùn)特性的新型納米材料，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物組織中DNA分子的實(shí)時(shí)在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在有葡萄糖的情況下，酶產(chǎn)生雙氧水（H2O2）與鐵離子（Fe2+)反應(yīng)，生成-OH。以具有較強(qiáng)親和力的DNA插入基團(tuán)（例如，二吡啶基等）為探針，提出了一種新型的可用于DNA雙鏈識(shí)別的光電化學(xué)分析新方法。該雙鏈DNA加入Ru(bpy)2dppz的溶液中，其埋入DNA的凹陷中，并朝著電極的方向擴(kuò)展。DNA與草酸負(fù)離子間的靜電斥力使其電流明顯降低。圖1.2（A）光電化學(xué)催化氧化和（B）光電指示劑檢測(cè)DNA損傷的原理圖除有機(jī)小分子外，無(wú)機(jī)半導(dǎo)體還可用作光電活性物質(zhì)，從而改變光響應(yīng)。研究人員利用介孔二氧化鈦（TiO2）的高Cu2+(Cu2+-TiO2）實(shí)現(xiàn)了基于g-C3N4的光電化學(xué)傳感（圖1.3）。該結(jié)構(gòu)是在前期TiO2光電轉(zhuǎn)換效率高，光電性質(zhì)優(yōu)良的基礎(chǔ)上提出的。利用g-C3N4構(gòu)筑光電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)水中Cu2+的高靈敏、高Cu2+的光電化學(xué)響應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，利用光電化學(xué)傳感技術(shù)，可有效地增強(qiáng)光電化學(xué)傳感系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度。傳統(tǒng)的g-C3N4改性方法存在著載流子遷移率低、光吸收能量受限、光生載流子的快速?gòu)?fù)合等問(wèn)題，導(dǎo)致其光電性能不夠理想等問(wèn)題。將抗體、BSA及抗原分別接枝在其表面后，因其空間位阻及蛋白非導(dǎo)電特性，使其在電極表面的電流更小。但將Cu2+-TiO2引入到雙電阻（Ab2）中，TiO2的高光電轉(zhuǎn)化效率使其在Cu2+的作用下，其光電流也隨之增大。因而，該光電化學(xué)傳感器對(duì)其光、電信號(hào)進(jìn)行了二次放大，極大地增加了其探測(cè)靈敏度圖1.3（A）PT-Cl/C3N4納米片薄膜；（B）Cu2+–TiO2–Ab2和（C）NMP-22傳感器的構(gòu)建示意圖另外一個(gè)簡(jiǎn)便的辦法是將量子點(diǎn)用作標(biāo)記。利用量子點(diǎn)較高的光電轉(zhuǎn)化效率，在其表面進(jìn)行熒光探針與熒光探針結(jié)合，可以有效改變熒光探針與熒光探針之間的相互作用，提高熒光探針的靈敏度。研究人員通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞表面的量子點(diǎn)進(jìn)行修飾，建立了一種可對(duì)IL-6進(jìn)行熒光增敏的光電化學(xué)傳感器（圖1.4所示）。以此為基礎(chǔ)，在將電極上被量子點(diǎn)標(biāo)記的抗原改時(shí)，強(qiáng)化的電信號(hào)以達(dá)到光電流信號(hào)放大的作用，進(jìn)而提升了對(duì)IL-6的檢測(cè)靈敏度。圖1.4PEC免疫傳感器構(gòu)建的示意圖1.3.2空間位阻其中，最簡(jiǎn)單的一種方式就是通過(guò)空間位阻來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)光電流場(chǎng)的調(diào)制。至于位阻探測(cè)，則是用來(lái)探測(cè)蛋白質(zhì)，比如抗體（Ab），抗原（Ag）等。下面就是一個(gè)關(guān)于抗體測(cè)試的例子。利用光電化學(xué)傳感器對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別，通過(guò)對(duì)被識(shí)別的抗原（光電化學(xué)標(biāo)志物）進(jìn)行識(shí)別，提高被識(shí)別抗原的電流響應(yīng)。而最簡(jiǎn)便的測(cè)定方式，則是先將抗體與電極結(jié)合，然后再將被測(cè)定的抗原結(jié)合在電極上。由于蛋白本身是非傳導(dǎo)性材料，當(dāng)被測(cè)抗原與電極結(jié)合時(shí)，其空間位阻增加，使其無(wú)法進(jìn)入電極，從而導(dǎo)致電流降低。然而，這種方法存在著檢測(cè)靈敏度不高的問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，還可以通過(guò)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行化學(xué)鍵合，從而增加目標(biāo)蛋白的位阻，降低目標(biāo)蛋白的電流，從而達(dá)到增強(qiáng)目標(biāo)蛋白識(shí)別能力的目的。一些研究人員就是利用這種方法，對(duì)其進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行了初步的研究（圖1.5所示）。金納米顆粒被先被接枝到Bi2S3改性的ITO電極上，再由硫磺基團(tuán)與金納米顆粒間的相互作用，將半胱氨酸接枝于金納米顆粒上。接著，由蛋白激酶A催化，使其發(fā)生磷酸化。然后，通過(guò)磷酸酯酶與磷酸酯酶的特異結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸酯酶的生物素修飾。因?yàn)檫@種蛋白是不能傳導(dǎo)的，因此，電流就會(huì)驟然降低。接著，通過(guò)對(duì)該蛋白的選擇性識(shí)別，對(duì)其進(jìn)行持續(xù)地化學(xué)修飾，使其在電極表面的電化學(xué)行為進(jìn)一步降低。用多種方式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，可以在不同程度上提高空間位阻，從而導(dǎo)致電流下降顯著，降低了傳感器的檢出限。圖1.5基于Phos-tag的PEC生物傳感器的構(gòu)建示意圖然而，通過(guò)對(duì)其他蛋白進(jìn)行改性來(lái)提高其位阻值，這種方式也有其不足之處。這種方法不但費(fèi)用昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)，還增加了測(cè)試過(guò)程的復(fù)雜性。于是，人們開(kāi)始思考，能否找到更加便捷、高效的信號(hào)增強(qiáng)方式。納米SiO2因其尺寸均一、比表面積大、低毒性、生物相容性好、良好的穩(wěn)定性、價(jià)格低廉而成為生物醫(yī)藥與檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。由于納米SiO2導(dǎo)電性能較低，且易于進(jìn)行官能化改性，因此通常采用納米SiO2作為光電化學(xué)傳感材料。此外，納米二氧化硅（SiO2@Ab2）具有高比表面積，可用作多種Ab2的負(fù)載材料。本項(xiàng)目擬采用SiO2@Ab2復(fù)合物來(lái)改性傳感器，通過(guò)SiO2與多層Ab2協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)光電特性的抑制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)光電特性的有效調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)光電特性的有效調(diào)控。研究人員率先將二氧化硅二電阻應(yīng)用于光電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域，使其具有更強(qiáng)的探測(cè)能力。由TiO2-NT分別對(duì)CdS:MnQDs和CdTeQDs進(jìn)行了改性。如圖1.6所示，最終獲得TiO2-NTs、CdS:MnQDs和CdTeQDs三種材料，并對(duì)它們進(jìn)行協(xié)同敏化，獲得具有強(qiáng)烈的光電性能。再通過(guò)-COOH和-NH2反應(yīng)，將抗體修飾到CdTeQDs上，再通過(guò)BSA對(duì)其進(jìn)行功能化。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)反應(yīng)部位進(jìn)行化學(xué)鍵合，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)部位的化學(xué)鍵合。因?yàn)檫@三個(gè)步驟都被改變了，因此，電流會(huì)慢慢地減少。但是，當(dāng)SiO2@Ab2改性到電極上后，其表面的電流就會(huì)明顯降低圖1.6夾心式PEC免疫傳感器的構(gòu)建示意圖1.3.3酶標(biāo)記近年來(lái)，基于“夾心”式的檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)檢測(cè)中，這種“夾心”結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的放大。隨后，該方法被研究人員用于光電化學(xué)傳感。盡管該方法簡(jiǎn)便，但是由于待測(cè)物質(zhì)的加載量較小，并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的增強(qiáng)，因此，基于該方法，人們正在尋求新的突破點(diǎn)。此后，基于酶標(biāo)記的“夾心”式光電化學(xué)傳感器被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域。2010年，研究者率先在此領(lǐng)域有了新的進(jìn)展，利用GOx（GOx）將Au與單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Au的某種信號(hào)的某種放大（見(jiàn)圖1.7）。在此基礎(chǔ)上，將GOx與TiO2-NTs結(jié)合，使其在葡萄糖緩沖液中進(jìn)行檢測(cè)。而TiO2-NTs價(jià)帶上的空穴被作為電子供體的H2O2捕捉，這樣就能降低電子空穴的復(fù)合率，從而讓本傳感器發(fā)生比較明顯的電信號(hào)改變。圖1.7TiO2-Au-Ab1-a-SYN-{Ab2-Au-GOx}免疫傳感器的構(gòu)建步驟及a-SYN的檢測(cè)圖雖然使用GOx標(biāo)記放大了信號(hào)，但是在一端形成免疫復(fù)合物，而在電極的另外一端出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)，引入的酶標(biāo)GOx也僅僅是催化基底產(chǎn)生H2O2的作用，對(duì)傳感器并沒(méi)有明顯的信號(hào)放大。因此，科研人員一直在尋找更好的檢驗(yàn)手段。隨后，有研究人員利用辣根過(guò)氧化物（HRP）對(duì)其進(jìn)行了免疫熒光分析，結(jié)果極大地增強(qiáng)了其對(duì)免疫細(xì)胞的識(shí)別能力。由于HRP能將1-氯化萘-4-CN（4-CN）轉(zhuǎn)化成BCP沉積于電極表面，增大了電子轉(zhuǎn)移的阻力，增大了降低的電流，有望提升檢測(cè)的靈敏度，因此受到了廣泛關(guān)注。在圖1.8中，Ab1先被修飾至CdSQDs修飾的電極，然后順序地被修飾至Ag和Ab2，并且按照順序，電流被降低。而在電極表面引入HRP標(biāo)記的Ab2后，其所產(chǎn)生的電流明顯降低。一方面，由于HRP在有H2O2的條件下，會(huì)對(duì)4-CN生成沉積物進(jìn)行催化，沉積物粘附在電極表面，既是絕緣層，又會(huì)增大空間位阻，從而會(huì)對(duì)電子的傳輸造成極大的障礙，導(dǎo)致信號(hào)大大降低。另外，由于HRP在一定的波段，對(duì)光線有較大的吸收，所以其對(duì)光線的反應(yīng)也會(huì)降低。圖1.8基于QDs放大及HRP催化產(chǎn)生BCP的夾心式免疫檢測(cè)原理圖目前，除以HRP為標(biāo)記建立弱化光電化學(xué)傳感體系之外，人們也逐漸將堿性磷酸酶（ALP）作為標(biāo)記來(lái)建立信號(hào)增強(qiáng)的光電化學(xué)傳感體系。研究人員利用ALP酶建立了用于監(jiān)控CML藥物表現(xiàn)的光電化學(xué)傳感器（見(jiàn)圖1.9）。本項(xiàng)目提出了一種新的檢測(cè)方法，即在無(wú)改性ALP的情況下，檢測(cè)溶液中沒(méi)有特定的給電子物質(zhì)，因此檢測(cè)電流相對(duì)較低。然而，當(dāng)將堿性磷酸酯接枝到電極表面時(shí)，堿性磷酸酯酶將堿性磷酸酯水解制得的堿性磷酸酯可用作電子給體捕集空穴，提高其光電性能。光電信號(hào)產(chǎn)生顯著改變，以達(dá)到探測(cè)靶點(diǎn)的目的圖1.9多重信號(hào)放大的光電化學(xué)傳感器的組裝示意圖1.4本文研究計(jì)劃我們計(jì)劃將Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)與可控釋放策略集成用于miRNA-155光電傳感器設(shè)計(jì)，希望以Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)為光敏材料，以葡萄糖包封的卟啉基MOF（PCN-224,PCN:多孔配位網(wǎng)絡(luò)）為信號(hào)指示載體，所制備的體系在miRNA-155濃度增加時(shí)出現(xiàn)相應(yīng)的增強(qiáng)PEC響應(yīng)信號(hào)。在這種靶誘導(dǎo)的PCN-224信號(hào)釋放分子擴(kuò)增策略的控制下，分開(kāi)型PEC系統(tǒng)提供了高效和超高靈敏度的miRNA-155檢測(cè)。本研究提出了一種創(chuàng)新、有前景的分開(kāi)型PEC平臺(tái)，用于低豐度miRNA-155的高精度測(cè)試。與文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)miRNA-155檢測(cè)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了更低的miRNA-155檢測(cè)限。2Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)與可控釋放策略集成用于miRNA-155的分開(kāi)型光電電化學(xué)傳感2.1引言監(jiān)測(cè)超低水平生物標(biāo)志物在蛋白質(zhì)鑒定、藥物評(píng)價(jià)和癌癥早期診斷等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中至關(guān)重要[12-17]。一些研究集中在光電化學(xué)（PEC）生物分析上，以實(shí)現(xiàn)體外生物檢測(cè)技術(shù)。得益于快速和特異性的抗原-抗體識(shí)別反應(yīng)，光電化學(xué)生物分析在體外生物檢測(cè)技術(shù)中具有易于集成、操作方便和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，引起了人們極大的興趣[18-20]。然而，大多數(shù)PEC生物傳感器是通過(guò)將目標(biāo)識(shí)別單元的生物識(shí)別分子（如適配體、抗體和多肽）預(yù)先固定到電極表面而構(gòu)建的[21-23]。當(dāng)緊密固定在電極上時(shí)，生物認(rèn)知分子會(huì)失去部分生物活性[24,25]。而且，傳統(tǒng)的PEC生物傳感器固有的缺點(diǎn)是穩(wěn)定性和可重復(fù)性差，制造過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)。為了解決這些問(wèn)題，研究人員提出了分開(kāi)型PEC檢測(cè)模式，它是一種理想的檢測(cè)方法。該方法在遠(yuǎn)離電極的地方進(jìn)行生物過(guò)程，所以排除了生物識(shí)別系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)之間的交互干擾[26-28]。此外，由于PEC生物傳感器的生物識(shí)別過(guò)程是在液相中進(jìn)行的，而不是在固液相界面中進(jìn)行的，因此較于傳統(tǒng)生物傳感器，PEC生物傳感器的再現(xiàn)性和穩(wěn)定性有望提高。事實(shí)上，優(yōu)秀光伏材料的設(shè)計(jì)對(duì)于高性能分開(kāi)型生物傳感平臺(tái)至關(guān)重要。MgIn2S4是一種三元金屬硫族半導(dǎo)體，具有合適的帶隙（2.1–2.3eV）、優(yōu)異的光電響應(yīng)和無(wú)毒特性，在光催化領(lǐng)域顯示出巨大的前景。但MgIn2S4的光電轉(zhuǎn)換效率較低，可見(jiàn)光響應(yīng)有限，限制了其應(yīng)用。近年來(lái)，Ti3C2MXene納米片因其優(yōu)異的電子空穴分離遷移率、大的比表面積和良好的生物相容性而被應(yīng)用于傳感器的制備[29]。此外，Ti3C2MXene具有豐富的表面基團(tuán)（例如，-OH，-F和-O），能夠與其他半導(dǎo)體構(gòu)建異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，由于電子耦合和強(qiáng)烈的物理效應(yīng)，光生載流子在異質(zhì)結(jié)上的轉(zhuǎn)移和分離效率可以顯著提高。因此，Ti3C2MXene和MgIn2S4可以結(jié)合成一種新型材料（Ti3C2/MgIn2S4），利用這兩種材料的顯著優(yōu)勢(shì)進(jìn)行先進(jìn)的PEC生物分析。此外，具有類金屬性質(zhì)的Ti3C2MXene具有合適的費(fèi)米能級(jí)（Ef）與MgIn2S4形成肖特基結(jié)，從而促進(jìn)光激發(fā)電荷的轉(zhuǎn)移和分離。因此，以Ti3C2/MgIn2S4為光電轉(zhuǎn)換材料，制備分開(kāi)型PEC生物傳感器是可行的。金屬有機(jī)骨架MOFs具有各種吸引人的特性，包括大孔隙體積、高負(fù)載能力、可調(diào)結(jié)構(gòu)、可調(diào)尺寸和多功能性[30,31]。由于MOFs具有較高的孔隙率，增加了孔隙形狀的可調(diào)性，因此可以作為納米載體負(fù)載信號(hào)生成分子，并在特定刺激下釋放它們[32-34]。在這種情況下，將MOFs引入分開(kāi)型傳感平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。更重要的是，在MoFs中選擇和修飾特定的蓋帽材料，可以特異性識(shí)別分析物，這是準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤生物標(biāo)志物的前提。本研究以Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)為光敏材料，以葡萄糖包封的卟啉基MOF（PCN-224,PCN:多孔配位網(wǎng)絡(luò)）為信號(hào)指示載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA-155（miRNA-155）的高靈敏度檢測(cè)（圖2.1）。首先將葡萄糖作為信號(hào)放大分子裝載在PCN-224的孔隙中，再用特制的捕獲探針（CP）將其密封。miRNA-155的加入導(dǎo)致設(shè)計(jì)的CP鏈延伸，然后與PCN-224分離。當(dāng)分子通道打開(kāi)時(shí)，葡萄糖分子從PCN-224中釋放出來(lái)，并被葡萄糖氧化酶（GOx）原位氧化生成過(guò)氧化氫（H2O2）分子，過(guò)氧化氫清除了Ti3C2/MgIn2S4的孔洞。通過(guò)巧妙集成Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)作為光活性材料，所制備的體系在miRNA-155濃度增加時(shí)出現(xiàn)相應(yīng)的增強(qiáng)PEC響應(yīng)信號(hào)。在這種靶誘導(dǎo)的PCN-224信號(hào)釋放分子擴(kuò)增策略的控制下，分開(kāi)型PEC系統(tǒng)提供了高效和超高靈敏度的miRNA-155檢測(cè)。2.2實(shí)驗(yàn)部分2.2.1Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)的合成用Ti3C2納米片（買(mǎi)來(lái)的Ti3C2納米片）修飾的MgIn2S4納米花異質(zhì)結(jié)通過(guò)后水熱步驟合成（圖2.1A）。簡(jiǎn)單地，將Ti3C2（1.5g）、MgCl2?6H2O（0.1016g）、InCl3?4H2O（0.2932g）、TAA（0.3005g）有序地溶解在乙二醇（70mL）中，得到混合溶液。接下來(lái)，將均相溶液密封在25mL特氟龍內(nèi)襯的高壓滅菌器中，在180攝氏度反應(yīng)12h。降溫至室溫后，用去離子水和乙醇沖洗多次后收集，在60攝氏度下干燥過(guò)夜。相比之下，原始MgIn2S4是在相同的條件下制備的，沒(méi)有Ti3C2。2.2.2將葡萄糖裝入PCN-224，CP封蓋PCN-224是根據(jù)先前報(bào)道的文獻(xiàn)制備的。通常，將ZrOCl4（60mg），H2TCPP（40mg），苯甲酸（2160mg）和PVP（40mg）分散在DMF（6.4mL）中，并在反應(yīng)釜中以120攝氏度加熱6h，然后收集，用DMF和無(wú)水乙醇在6000rpm下沖洗數(shù)次10min，并在60攝氏度下干燥。然后，將得到的PCN-224（20mg）浸入含有2.0M葡萄糖分子的去離子水中，并在室溫下攪拌過(guò)夜。隨后，將中孔PCN-224與CP混合并在25攝氏度下輕輕攪拌4h。最終產(chǎn)物離心后用去離子水清洗，然后分散在1.0mL0.01MPBS緩沖液（pH=7）中。2.2.3分開(kāi)型PEC生物傳感平臺(tái)的制造將葡萄糖負(fù)載的PCN-224（20μL）用60μLPBS（pH=7）稀釋，并與不同濃度的miRNA-155（20μL）樣品混合。將整個(gè)混合物在室溫下?lián)u動(dòng)50min，然后將混合物離心幾次。之后，將上述上清液滴入4mLPBS中作為PEC測(cè)定的電解質(zhì)。在修飾之前，用丙酮，乙醇和超純水仔細(xì)地預(yù)清潔氟摻雜氧化錫（FTO）電極（有效面積：0.25cm2），然后在氮?dú)猓∟2）氣氛下干燥20min。在裸FTO電極上注入100μL6.0mg/mLTi3C2/MgIn2S4液液組裝Ti3C2/MgIn2S4，在37攝氏度下干燥12h，將Ti3C2/MgIn2S4修飾電極作為工作電極。最后，將Ti3C2/MgIn2S4電極置于0.1MPBS（含1.0mMGox）中進(jìn)行進(jìn)一步的PEC測(cè)試。2.3結(jié)果和討論2.3.1分開(kāi)型PEC生物傳感平臺(tái)設(shè)計(jì)為降低復(fù)雜電極修飾引起的背景噪聲，以Ti3C2/MgIn2S4復(fù)合光敏材料為miRNA-155檢測(cè)光敏材料，在可控釋放體系基礎(chǔ)上制備了一種新型的分離型PEC生物傳感平臺(tái)。通過(guò)水熱反應(yīng)在Ti3C2納米片上原位生長(zhǎng)了一層薄薄的MgIn2S4納米花（圖2.1A）。由于超薄結(jié)構(gòu)的電荷輸送距離短，界面接觸面積大，Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)可以表現(xiàn)出較高的載流子遷移率，暴露在光源下可以賦予自身明顯的初始光電流信號(hào)。如圖2.1B所示，以Zr團(tuán)簇和TCPP組成的介孔PCN-224為納米載體封裝葡萄糖分子，再由CP進(jìn)行門(mén)控。一旦引入目標(biāo)分析物，miRNA-155和CP的識(shí)別和雜交促進(jìn)了miRNA-155-CP復(fù)合物的形成，miRNA-155-CP復(fù)合物從PCN-224中解放出來(lái)，可控釋放包裹的葡萄糖。當(dāng)大量葡萄糖分子從孔中釋放出來(lái)時(shí)，溶液中的GOx有效地催化葡萄糖氧化生成H2O2，從而有效地觸發(fā)Ti3C2/MgIn2S4表面孔捕獲以獲得放大信號(hào)(圖2.1C)。顯然，光電流強(qiáng)度與葡萄糖釋放量成正比，而葡萄糖釋放量取決于miRNA-155的含量。此外，所設(shè)計(jì)的分開(kāi)型PEC系統(tǒng)只需改變特定的靶點(diǎn)和捕獲探針，即可輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)其他腫瘤生物標(biāo)志物的超靈敏檢測(cè)，為各種生物標(biāo)記的精確檢測(cè)提供平臺(tái)。因此，所開(kāi)發(fā)的分開(kāi)式[18]PEC生物傳感系統(tǒng)具有很大的潛力，為生物分析和醫(yī)學(xué)診斷鋪平了道路。2.3.2形態(tài)特征采用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察純Ti3C2、純MgIn2S4和Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)的形貌。如圖2.2A和B所示，Ti3C2呈片狀、厚度超薄，純MgIn2S4由許多具有特殊花狀形態(tài)的納米微球組成。經(jīng)過(guò)水熱反應(yīng)后，如圖2.2C和D所示，Ti3C2納米片被非常薄且互鎖的MgIn2S4納米片完全包裹，Ti3C2/MgIn2S4納米材料由覆蓋在Ti3C2納米片襯底上的小MgIn2S4納米片組成.在HRTEM圖像（圖2.2E）中，0.32nm晶格條紋表歸因于MgIn2S4的（311）晶面，0.26nm的晶格條紋是Ti3C2的（0110）晶面，說(shuō)明兩種材料緊密結(jié)合，異質(zhì)結(jié)成功形成為了。進(jìn)一步說(shuō)明Ti3C2/MgIn2S4的分布，在圖中進(jìn)行了能量色散光譜（EDS）元素映射。在制備的Ti3C2/MgIn2S4異質(zhì)結(jié)中觀察到Ti、C、Mg、In和S等分布良好的元素，進(jìn)一步證明了MgIn2S4納米花均勻地包裹在Ti3C2納米片表面。在圖2.3A中，7.1?處的衍射峰與Ti3C2四方結(jié)構(gòu)的（002）晶格平面（曲線a）吻合較好。在曲線b中，3個(gè)強(qiáng)特征衍射峰分別出現(xiàn)在27.8?、41.8?、48.3?，分別對(duì)應(yīng)六方MgIn2S4（JCPDS卡號(hào)：31-0792）的（311）、（422）和（440）個(gè)平面。值得注意的是，Ti3C2/MgIn2S4的特征峰強(qiáng)度與Ti3C2和MgIn2S4的特征峰強(qiáng)度相似（曲線c），證明了Ti3C2和MgIn2S4的成功結(jié)合。然后利用X射線光電子能譜（XPS）研究了Ti3C2/MgIn2S4混合物的化學(xué)狀態(tài)和表面原子組成。圖2.1分離式PEC生物傳感平臺(tái)的設(shè)計(jì)：（A）Ti3C2/MgIn2S4光活性材料的制備；（B）cp-capPCN-224和miRNA-155識(shí)別的制備，（C）分開(kāi)型PEC生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖圖2.2(A)Ti3C2，（B）MgIn2S4和（C）Ti3C2/MgIn2S4的SEM圖像；（D）Ti3C2/MgIn2S4的TEM和（E）HRTEM圖像；（F）Ti、C、Mg、In、S的EDS元素映射圖圖2.3（A）Ti3C2（a）、MgIn2S4（b）、Ti3C2/MgIn2S4（c）的XRD圖譜2.3.3改性PCN-224的表征SEM和TEM圖像（圖2.4A和B）顯示PCN-224具有直徑約1μm的立方體形狀。同時(shí)，根據(jù)PCN-224的N2吸附-解吸等溫線和巴雷特-喬伊納-哈倫達(dá)（BJH）孔分布（圖2.4C），得到的PCN-224的孔徑為2.47nm，布魯諾爾-埃米特-泰勒（BET）表面積為2213m2g?1，保證了葡萄糖分子的有效負(fù)載。此外，修飾的官能PCN-224的表面電荷變化由zeta電位描述（圖2.4D）。CP首先被共軛到PCN-224的表面上，以覆蓋PCN-224的孔出口。PCN-224吸附帶負(fù)電荷的CP后，PCN-224的zeta電位值由19.1mV變?yōu)?17.2mV，隨著靶miRNA的添加，由于生物門(mén)CP的分離，zeta電位值從-17.2mV增加到-7.2mV。并通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)一步證明CP封端PCN-224的成功制備。2.3.4分開(kāi)型PEC生物傳感平臺(tái)的可行性研究為了驗(yàn)證所提出的分開(kāi)型PEC生物傳感平臺(tái)的可行性，研究了Ti3C2/MgIn2S4光電極在不同濃度H2O2電解質(zhì)中的光電流強(qiáng)度。與背景信號(hào)（曲線a）相比，添加H2O2時(shí)c曲線信號(hào)變化較大，而不添加H2O2時(shí)c曲線信號(hào)變化幾乎不存在（曲線b），證明了PEC生物傳感平臺(tái)的可行性。此外，我們進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)光電流的增加是由于miRNA-155控釋系統(tǒng)中的葡萄糖，而不是miRNA-155本身或其他因素。同樣，加入CP封住葡萄糖負(fù)載的PCN-224后，光電流的變化也不明顯（曲線c）。miRNA-155與cp封住的葡萄糖負(fù)載PCN-224共存導(dǎo)致光電流明顯增加（曲線d）。所有這些結(jié)果表明，利用PEC傳感系統(tǒng)檢測(cè)miRN