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關(guān)于氨基酸類藥物二、氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法
1、目前全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬(wàn)噸左右,其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸,其次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。
2、氨基酸的生產(chǎn)方法有天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成法等四種。
3、氨基酸及其衍生物類藥物已有百種之多,但主要是以20種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?;?、取代及成鹽等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。第2頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天(一)水解法1、基本原理與過程
以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料,通過酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物,經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過程為水解、分離和結(jié)晶精制三個(gè)步驟。
第3頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天(1)蛋白質(zhì)水解方法
目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法三種。①酸水解法:蛋白質(zhì)原料用6~10mol/L鹽酸或8mol/L硫酸于110~120℃(回流煮沸)水解12~24h,除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點(diǎn)是水解迅速而徹底,產(chǎn)物全部為L(zhǎng)-型氨基酸,無(wú)消旋作用。缺點(diǎn)是色氨酸全部被破壞,絲氨酸及酪氨酸部分被破壞,且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。工業(yè)上較普遍采用。第4頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天②堿水解法:蛋白質(zhì)原料經(jīng)6mol/L氫氧化鈉或4mol/L氫氧化鋇于100℃水解6h即得多種氨基酸混合物。該法水解迅速而徹底,且色氨酸不被破壞,但含羥基或巰基的氨基酸全部被破壞,且產(chǎn)生消旋作用。工業(yè)上多不采用。③酶水解法:蛋白質(zhì)原料在一定pH和溫度條件下經(jīng)蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的過程稱為酶水解法。此法優(yōu)點(diǎn)為反應(yīng)條件溫和,無(wú)需特殊設(shè)備,氨基酸不破壞,無(wú)消旋作用。缺點(diǎn)是水解不徹底,產(chǎn)物中除氨基酸外,尚含較多肽類。工業(yè)上很少用該法生產(chǎn)氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨。第5頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天(2)氨基酸分離方法
氨基酸分離方法較多,通常有溶解度法、等電點(diǎn)沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。
①溶解度法:是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異而進(jìn)行分離的方法。
胱氨酸和酪氨酸均難溶于水,但在熱水中酪氨酸溶解度較大,而胱氨酸溶解度變化不大,故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。
②特殊試劑沉淀法:系采用某些有機(jī)或無(wú)機(jī)試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物的分離方法。第6頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天③吸附法:是利用吸附劑對(duì)不同氨基酸吸附力的差異進(jìn)行分離的方法。如顆?;钚蕴繉?duì)苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于對(duì)其它非芳香族氨基酸的吸附力,故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸分離出來。
④離子交換法:是利用離子交換劑對(duì)不同氨基酸吸附能力的差異進(jìn)行分離的方法。氨基酸為兩性電解質(zhì),在特定條件下,不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不同,故同一種離子交換劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不同。第7頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天(3)氨基酸的精制方法
分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質(zhì),需進(jìn)行精制,常用的有結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù),也可采用溶解度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度較小,且pI為6.0,故丙氨酸可在pH6.0時(shí),用50%冷乙醇結(jié)晶或重結(jié)晶加以精制。
溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍,若將含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積(w/v)的熱水中,調(diào)pH4.0左右,經(jīng)脫色過濾可除去大部分酪氨酸;濾液濃縮至原體積的1/3,加2倍體積(v/v)的95%乙醇,4℃放置,濾取結(jié)晶,用95%乙醇洗滌,烘干即得苯丙氨酸精品。第8頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天2、用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝
絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法生產(chǎn),但目前由于發(fā)酵方法及酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展,僅有幾種氨基酸仍采用酸水解法生產(chǎn)。現(xiàn)胱氨酸與亮氨酸生產(chǎn)為例。L-胱氨酸(L-Cystine,L-Cys2)的制備:
(1)L-胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì):以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化而成,結(jié)構(gòu)為:第9頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體,分解點(diǎn)258~261℃,pI為5.05,〔α〕25D為-232°。在25℃水中溶解度為0.011,在75℃水中為0.052。溶于無(wú)機(jī)酸及無(wú)機(jī)堿,在熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮。可被還原為L(zhǎng)-半胱氨酸。(2)工藝路線第10頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天
(3)工藝過程①水解:在1-1.5h內(nèi)升溫至110~117℃水解7h(自100℃時(shí)計(jì))后出料,玻璃布過濾,收集濾液。②中和:用30%工業(yè)堿調(diào)至pH4.8,靜置36h,滌綸布濾取沉淀,離心甩干得L-胱氨酸粗品Ⅰ。③粗制:加入10mol/L鹽酸、水,升溫至65~70℃,攪拌0.5小時(shí),加活性炭16kg/0.2t粗品Ⅰ
,于80~90℃保溫0.5h,濾除活性炭。用30%工業(yè)堿調(diào)濾液至pH4.8,靜置結(jié)晶,吸出上清液后,底部沉淀經(jīng)離心甩干得胱氨酸粗品(Ⅱ)。第11頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天④精制、中和:粗品Ⅱ加入1mol/LHCl,升溫至70℃,加活性炭1.5~2.5kg/50kg粗品Ⅱ
,85℃攪拌0.5h,過濾,加1.5倍體積蒸餾水,升溫至75~80℃,攪拌下用12%氨水(化學(xué)純)中和至pH3.5~4.0,析出結(jié)晶,濾取胱氨酸結(jié)晶,蒸餾水洗至無(wú)氯離子,真空干燥得L-胱氨酸成品。⑤檢驗(yàn)與含量測(cè)定:應(yīng)為六角形或六角柱形白色結(jié)晶,含量在98.5%以上,干燥失重小于0.5%,熾灼殘?jiān)∮?.2%,氯化物小于0.15%,鐵鹽小于0.001%,重金屬小于20ppm。⑥作用與用途:L-胱氨酸具有增強(qiáng)造血機(jī)能、升高白細(xì)胞、促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)及抗輻射作用。臨床上用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。第12頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天(二)發(fā)酵法
1、基本原理與過程工業(yè)上,發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是利用微生物細(xì)胞中酶的作用,將培養(yǎng)基中有機(jī)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞或其它有機(jī)物的過程。利用微生物代謝中間產(chǎn)物加入NH3或HNO3,合成氨基酸。第13頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天第14頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天★初生氨基酸:微生物通過固氮作用、硝酸還原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相應(yīng)的氨基酸,或微生物通過轉(zhuǎn)氨酶作用,將一種氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一種酮酸上,生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸?!锎紊被幔涸谖⑸镒饔孟?,以初生氨基酸為前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸。大多數(shù)氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生物轉(zhuǎn)化作用而產(chǎn)生。第15頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天第16頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天
2、發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝
微生物利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。目前絕大部分氨基酸皆可通過發(fā)酵法生產(chǎn),其缺點(diǎn)是產(chǎn)物濃度低,設(shè)備投資大,工藝管理要求嚴(yán)格,生產(chǎn)周期長(zhǎng),成本高。本文僅以L-異亮氨酸直接發(fā)酵法為例,說明發(fā)酵法的基本過程。第17頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天
L-異亮氨酸(L-Isoleucine,L-Ile)的制備
(1)L-異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì):L-Ile存在子所有蛋白質(zhì)中,為人體必需氨基酸之一,分子式為C6H13NO2,分子量為131.17,結(jié)構(gòu)式為:第18頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天L-Ile在乙醇中形成菱形葉片狀或片狀晶體,分解點(diǎn)為285~286℃,L-Ile溶于熱醋酸,在20℃乙醇中溶解度為0.072,在25℃水中為4.12,在75℃水中為6.08,不溶于乙醚。
(2)工藝路線第19頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天
(3)工藝過程①
菌種培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基組成(%)為:葡萄糖2尿素0.3玉米漿2.5豆餅水解液0.1(以干豆餅計(jì))pH6.5。二級(jí)種子培養(yǎng)基另加菜籽油0.4,其余同一級(jí)種子培養(yǎng)基。一級(jí)種子培養(yǎng):1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml,接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種,搖床30℃培養(yǎng)(沖程7cm,頻率105次/min)16h。二級(jí)種子培養(yǎng):接種量3.5%,培養(yǎng)8h,如此逐級(jí)第20頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天放大培養(yǎng)得足夠量菌種。
②滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成(%)為:
硫酸銨4.5豆餅水解液0.4,玉米漿2.0
碳酸鈣4.5pH7.2,淀粉水解還原糖初糖濃度11.5。在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液,加熱至118~120℃,維持在1.1×105Pa壓力,滅菌30min,立即通冰鹽水冷卻至25℃。接入1%菌種(v/v),維持180轉(zhuǎn)/min的攪拌速度,升溫至30~31℃,以0.2L/(min·L)通氣量發(fā)酵60h,在24~50h之間不斷補(bǔ)加尿素至0.6,氨水至0.27。
第21頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天③除菌體、酸化發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液加熱至100℃并維持10min,冷卻過濾,濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5,過濾除沉淀。④離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5%的流速進(jìn)H十-型732離子交換柱(Φ40×100cm),以100L去離子水洗柱,再以60℃、0.5mol/L氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫,分部收集洗脫液。第22頁(yè),共26頁(yè),2024年2月25日,星期天⑤濃縮趕氨
合并pH3~12的洗脫液,70~80℃減壓蒸餾、濃縮至粘稠狀,加去離子水至原體積的1/4,再濃縮至粘稠狀。如此重復(fù)三次。⑥脫色、濃縮、中和上述濃縮物加去離子水至原體積的1/4,攪拌均勻,加2mol/L鹽酸調(diào)pH3.5,加上1%(w/v)活性炭,70℃攪拌脫色1h。濾除活性炭,濾液減壓濃縮至適當(dāng)體積,用2mol/L氨水調(diào)pH6.0,5℃沉淀過夜,過濾抽干,105℃烘干得:L-異亮氨酸半成品。第23頁(yè),共26頁(yè),2024年
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