細胞分化細胞生物學件

關(guān)于細胞分化細胞生物學件一個受精卵如何變成一個孩子？第2頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共134頁，2024年2月25日，星期天個體發(fā)育是通過細胞分化來實現(xiàn)的第5頁,共134頁，2024年2月25日，星期天受精后8天。胚芽完成“著陸”，微微嵌入子宮內(nèi)膜。此時它分裂發(fā)育為幾百個細胞第6頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共134頁，2024年2月25日，星期天受精后6星期，人形已隱約可見。這時，胚胎的心跳每分鐘140—150下．是母親心跳的兩倍。

第8頁,共134頁，2024年2月25日，星期天何謂細胞分化？第9頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

細胞分化（Différentiationcellulaire)

由同源細胞逐漸變?yōu)樵谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征等方面具有穩(wěn)定差異的另一類型細胞的過程。第10頁,共134頁，2024年2月25日，星期天并非所有細胞均能分化第11頁,共134頁，2024年2月25日，星期天干細胞(StemCell)是存在于人和動物發(fā)育各階段（包括早期胚胎和成熟組織）的一類原始狀態(tài)的未分化細胞，它能夠自我更新并始終保持很強的分化潛能，可以產(chǎn)生一種、多種、甚至全部的機體細胞類型。具體詳見第五篇第十六章第12頁,共134頁，2024年2月25日，星期天未分化細胞自我更新

(self-renew)無限增殖體外長期培養(yǎng)多向分化潛能

(multipotential)第13頁,共134頁，2024年2月25日，星期天干細胞的類型：

胚胎干細胞embryonicstemcells

胚胎干細胞主要是指來自囊胚內(nèi)細胞團的細胞，有自我更新和多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的各類細胞。成體干細胞

adultstemcells

成體干細胞是處于干細胞狀態(tài)的成體細胞，包括成年和未成年動物組織中的各種干細胞，因此又稱為組織干細胞。如神經(jīng)干細胞、造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、上皮干細胞、肝干細胞、胰腺干細胞等。第14頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞的來源第15頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞的概念成體干細胞又稱組織干細胞，傳統(tǒng)的觀念認為它們是存在于成體組織的未分化細胞，現(xiàn)在認為也包括未成年動物的組織干細胞，它們具有不斷增殖和自我更新能力、又具有多向分化潛能。

如造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、上皮干細胞、胰腺干細胞、肝干細胞等第16頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞的功能自然條件下成體干細胞傾向于分化成所在組織的細胞，參與組織更新和損傷修復；外界條件誘導下成體干細胞可橫向分化成其他組織的細胞，參與這些組織的損傷修復。第17頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成體的組織更新也是細胞分化的結(jié)果

保持親代干細胞的特性增殖、分化成體干細胞終末分化細胞死亡

已存在的細胞通過增殖形成相同類型的子細胞，如肝細胞成體干細胞產(chǎn)生新的分化，如表皮細胞

成體產(chǎn)生新的分化細胞第18頁,共134頁，2024年2月25日，星期天表皮干細胞的分化第19頁,共134頁，2024年2月25日，星期天各種血液細胞的形成過程第20頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Science.1992Mar27;255(5052):1707-10

Neurogenesisinthemammaliancentralnervoussystemisbelievedtoendintheperiodjustafterbirth;inthemousestriatum（紋狀體）nonewneuronsareproducedafterthefirstfewdaysafterbirth.Inthisstudy,cellsisolatedfromthestriatumoftheadultmousebrainwereinducedtoproliferateinvitrobyepidermalgrowthfactor.Theproliferatingcellsinitiallyexpressednestin,anintermediatefilamentfoundinneuroepithelialstemcells,andsubsequentlydevelopedthemorphologyandantigenicpropertiesofneuronsandastrocytes.Newlygeneratedcellswithneuronalmorphologywereimmunoreactiveforgamma-aminobutyricacidandsubstanceP,twoneurotransmittersoftheadultstriatuminvivo.Thus,cellsoftheadultmousestriatumhavethecapacitytodivideanddifferentiateintoneuronsandastrocytes.ReynoldsandWeiss,1992

第21頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Cell.1999Jan8;96(1):25-34

Newneuronsarecontinuouslyaddedinspecificregionsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.Theseneuronsarederivedfrommultipotentstemcellswhoseidentityhasbeenenigmatic.Inthiswork,wepresentevidencethatependymalcells(室管膜細胞)areneuralstemcells.Ependymalcellsgiverisetoarapidlyproliferatingcelltypethatgeneratesneuronsthatmigratetotheolfactorybulb.Inresponsetospinalcordinjury,ependymalcellproliferationincreasesdramaticallytogeneratemigratorycellsthatdifferentiatetoastrocytesandparticipateinscarformation.Thesedatademonstratethatependymalcellsareneuralstemcellsandidentifyanovelprocessintheresponsetocentralnervoussysteminjury.

Johanssonetal.,1999

第22頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Science.279:1528–1530.

MuscleRegenerationbyBoneMarrow-DerivedMyogenicProgenitors

Growthandrepairofskeletalmusclearenormallymediatedbythesatellitecellsthatsurroundmusclefibers.Inregeneratingmuscle,however,thenumberofmyogenicprecursorsexceedsthatofresidentsatellitecells,implyingmigrationorrecruitmentofundifferentiatedprogenitorsfromothersources.Transplantationofgeneticallymarkedbonemarrowintoimmunodeficientmicerevealedthatmarrow-derivedcellsmigrateintoareasofinducedmuscledegeneration,undergomyogenicdifferentiation,andparticipateintheregenerationofthedamagedfibers.Geneticallymodified,marrow-derivedmyogenicprogenitorscouldpotentiallybeusedtotargettherapeuticgenestomuscletissue,providinganalternativestrategyfortreatmentofmusculardystrophies.

Ferrarietal.,1998

第23頁,共134頁，2024年2月25日，星期天不同的細胞存在分化能力的差異細胞分化經(jīng)歷一個分化能力逐漸受限制的過程全能細胞多能細胞單能細胞終末分化細胞第24頁,共134頁，2024年2月25日，星期天細胞如何hui變得不同？第25頁,共134頁，2024年2月25日，星期天細胞有多種途徑產(chǎn)生差異1.不對稱的分裂

細胞分裂時母細胞中的某些分子不均等地分配到兩個子細胞中，造成子細胞向不同方向分化。第26頁,共134頁，2024年2月25日，星期天不對稱分裂：生成不同的子細胞對稱分裂：子細胞形成后因受到不同的影響而成為不同的細胞第27頁,共134頁，2024年2月25日，星期天2.細胞間的相互誘導來自外部的信號使一群細胞中的一個或更多的成員進入不同的發(fā)育途徑，此過程稱為誘導式的相互作用。第28頁,共134頁，2024年2月25日，星期天誘導信號細胞被導入新的發(fā)育途徑細胞間誘導式的相互作用第29頁,共134頁，2024年2月25日，星期天3.相鄰細胞的側(cè)向抑制已分化的細胞可以產(chǎn)生抑制臨近細胞朝相同方向分化的物質(zhì)，阻止它們成為和自己一樣。第30頁,共134頁，2024年2月25日，星期天細胞間的相互接觸和側(cè)向抑制抑制信號第31頁,共134頁，2024年2月25日，星期天4.信號分子的梯度效應當信號分子從一個源頭向外擴散時，往往形成一個信號的濃度梯度，使得距源頭遠近不同的細胞根據(jù)自己周圍信號分子的濃度，表現(xiàn)出各種不同的行為。第32頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成形素蛋白在小雞四肢發(fā)育中的作用第33頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

細胞分化的多向性與細胞決定未分化細胞終末分化細胞A終末分化細胞B終末分化細胞E終末分化細胞C終末分化細胞D第34頁,共134頁，2024年2月25日，星期天移植實驗顯示細胞的決定狀態(tài)第35頁,共134頁，2024年2月25日，星期天DeterminedIndevelopmentalbiology,anembryoniccellissaidtobedeterminedifithasbecomecommittedtoaparticularspecializedpathofdevelopment.Thisdeterminationreflectsachangeintheinternalcharacterofthecell,anditprecedesthemuchmorereadilydetectedprocessofcelldifferentiation.第36頁,共134頁，2024年2月25日，星期天細胞決定雞胚：移植前，肢芽（長出大腿）和翼芽（長出翅膀）兩處細胞形態(tài)相同，均未分化。肢芽組織塊移植至翼芽部位，結(jié)果：翼尖為腳趾。肢芽翼芽長出翅膀第37頁,共134頁，2024年2月25日，星期天不同類型的細胞合成不同的蛋白管家基因（huosekeepinggene）：編碼維持細胞最低限度的功能所不可缺少的蛋白質(zhì)的基因，如組蛋白、細胞周期蛋白的基因，這些基因不參與細胞分化的定向，對細胞分化只有協(xié)助作用。奢侈基因(luxurygene)：有些蛋白和分化細胞的特殊性狀密切相關(guān)，但不是細胞基本生命活動必不可少的，編碼此類蛋白的基因稱為奢侈基因，與各種分化細胞的特殊性狀有直接關(guān)系。細胞分化是奢侈基因按一定時空順序表達的結(jié)果第38頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共134頁，2024年2月25日，星期天細胞分化是基因按一定時空順序表達的結(jié)果，這種在個體發(fā)育過程中不同的基因按照一定的時空順序被激活的現(xiàn)象稱為“基因的差異表達”。成纖維細胞被加入肌源蛋白后分化為肌細胞第40頁,共134頁，2024年2月25日，星期天生皮肌節(jié)：arecollectoionsofembryonicmesodermalcells

成肌細胞Threestagesindevelopmentofskeletalmuscleinmammals。第41頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Myoblastsarecommittedtobecomemusclebuthavenotyetdifferentiated;hencetheyarereferedtoasdetermined.第42頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Myogenicgenes(myoD,myogenin,myf5,mrf4)werefirstidentifiedinstudieswithculturedfibroblasts第43頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Myogenicproteinsaretranscriptionfactors第44頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共134頁，2024年2月25日，星期天絕大多數(shù)細胞的細胞核可始終保持分化的全能性第47頁,共134頁，2024年2月25日，星期天多能細胞：具有演變?yōu)槎喾N細胞類型的能力。單能細胞：僅具有分化形成某一種類型細胞的能力。細胞的全能性：生物體中的一個體細胞或一個性細胞在一定條件下，有能力重新形成完整的個體，或者分化形成該個體任何種類的細胞。此特性稱為“細胞全能性”。受精卵、8細胞期前的胚胎細胞是全能細胞。第48頁,共134頁，2024年2月25日，星期天體細胞克隆技術(shù)的誕生克隆（clone）就是指一個細胞或生物體通過無性繁殖方法擴增所得到的一批同樣的細胞或生物體，簡單來說就是無性繁殖?！拔饔斡洝敝械拿篮锿跎瞄L克?。喊胃姑兂鲂∶篮锿醯?9頁,共134頁，2024年2月25日，星期天1997年2月24日：克隆羊培育成功。隨后幾年中，克隆牛、克隆貓、克隆猴相繼面世。12生肖已經(jīng)克隆了一半。多名研究人員宣布克隆人計劃

克隆人：我到底是誰？第50頁,共134頁，2024年2月25日，星期天體細胞克隆羊多利1997年克隆羊多利的誕生震驚了世界，被譽為20世紀最重大、也是最有爭議的科技突破之一。

第51頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎細胞克隆猴“泰特拉”2000年1月這些克隆猴將用于人類糖尿病和帕金森氏癥的研究。第52頁,共134頁，2024年2月25日，星期天茜茜來到這個世上很不容易，科學家共實驗了188次才獲得成功。

克隆貓CC(clonecat)2002年初

第53頁,共134頁，2024年2月25日，星期天由我國自主完成的成年體細胞克隆牛誕生，至今已產(chǎn)犢14頭，存活5頭。這表明我國已成為繼日本、新西蘭、美國等國家之后掌握體細胞克隆牛關(guān)鍵技術(shù)的少數(shù)國家之一。中國克隆的牛犢第54頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共134頁，2024年2月25日，星期天1.將人類卵細胞中的DNA取出，由此獲得卵細胞的空殼。4.胚胎在子宮內(nèi)逐漸發(fā)育成熟，直至降生。3.將早期胚胎植入代理受孕母親的子宮。2.將體細胞的遺傳物質(zhì)植入空殼，通過電擊刺激卵細胞發(fā)育，并發(fā)育到早期胚胎狀。第56頁,共134頁，2024年2月25日，星期天治療性克隆通常指通過對干細胞的研究來復制人類的某些組織或器官。生殖性克隆是指對整個人的復制，即從被克隆的人身上取得細胞之后，將其植入被去除了遺傳基因物質(zhì)的卵細胞空殼中，通過刺激使新卵細胞分化并形成胚胎，之后將胚胎植入母體的子宮里孕育?？寺雰壕哂信c遺傳物質(zhì)源相同的生理特性。目前，國際上一般把對人類自身的克隆分為治療性克隆和生殖性克隆第57頁,共134頁，2024年2月25日，星期天治療性克隆return第58頁,共134頁，2024年2月25日，星期天克隆人普通人第59頁,共134頁，2024年2月25日，星期天細胞質(zhì)的重新編程作用GenesthatareunexpressedinsomaticcellshavebeenactivatedbyinjectingculturedcellnucleiofthefrogXenopuslaevis（非洲爪蛙）intooocytesofthenewtPleurodeleswaltlii（東方蠑螈）.Thegenesthatwereactivatedarenormallyexpressedinoocytesbutnotinculturedcells.Conversely,genesthatarenormallyexpressedinculturedcellsbutnotinoocytesbecameinactivewhenculturedcellnucleiwereinjectedintooocytes.Thesechangesingeneactivityweredetectedbytwo-dimensionalgelelectrophoresisofproteinssynthesizedbyoocytesinjectedwithnuclei.Controls,whichincludedtheuseofalpha-amanitin,showedthatthesechangesinproteinsynthesisaredependentongenetranscription.Weconcludethatgenesthatbecomeinactiveduringcelldifferentiationcanbereactivated,intheabsenceofcelldivision,bynormalcomponentsofoocytecytoplasm.ProcNatlAcadSciUSA.1977:2470–2474.

DeRobertisEM,GurdonJB.

第60頁,共134頁，2024年2月25日，星期天DNA甲基化修飾可能是一種重新編程的方式DNA自身的共價，限于CG序列的胞嘧啶上。由甲基轉(zhuǎn)移酶催化修飾。甲基化和去甲基化可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。（CTCF蛋白對Pax6表達的調(diào)節(jié)）第61頁,共134頁，2024年2月25日，星期天DNA甲基化可以忠實地得到遺傳第62頁,共134頁，2024年2月25日，星期天基因芯片實驗設(shè)計和過程去甲基化處理48h后ES細胞在沒有滋養(yǎng)層細胞條件下培養(yǎng)1μM甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Azad-2’-deoxycytidine處理RNA準備:

新鮮抽提組織

用RNA600NanoLabChip質(zhì)檢cRNA的準備:擴增率,>20電泳芯片雜交測試基因芯片:均一的背景

良好的整體信號

雜交陽性對照GAPDH,

-actin3’/5’信號

組內(nèi)可重復性數(shù)據(jù)收集:高嚴謹性標準化(TGT,GAPDH)去甲基化第63頁,共134頁，2024年2月25日，星期天Demethylation-inducedchangesofgeneexpressioninmouseEScells2,0322,003Up-regulatedgenesbyDNAdemethylation-Down-regulatedgenesbyDNAdemethylation-1612840-4mRNARatioChangedDnmt2Pax6H19IGF2RDnmt3b第64頁,共134頁，2024年2月25日，星期天1.基因組合調(diào)控產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)模式組合調(diào)控（combinationalcontrol）一些基因調(diào)節(jié)蛋白通過一定的組合形成一系列的調(diào)節(jié)模塊，依次結(jié)合到調(diào)節(jié)序列上，在正確的時間和空間，表達正確的基因模式。該機制可以使為數(shù)不多的基因調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生眾多的細胞類型。第65頁,共134頁，2024年2月25日，星期天基因組合調(diào)控對發(fā)育的重要作用第66頁,共134頁，2024年2月25日，星期天二、基因調(diào)節(jié)模式的遺傳和細胞記憶與特化細胞的特征形成有關(guān)的基因調(diào)節(jié)模式及染色體結(jié)構(gòu)變化是可以遺傳的。第67頁,共134頁，2024年2月25日，星期天正反饋環(huán)的遺傳機制第68頁,共134頁，2024年2月25日，星期天三、基因表達的調(diào)節(jié)是多水平的第69頁,共134頁，2024年2月25日，星期天真核細胞基因表達調(diào)節(jié)的多重性第70頁,共134頁，2024年2月25日，星期天四、細胞質(zhì)的作用胞質(zhì)記憶由細胞質(zhì)中的成分直接或間接作用于基因組，使得特定的基因被選擇性表達的現(xiàn)象。第71頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)細胞分化與腫瘤

腫瘤發(fā)生是細胞去分化或分化阻斷的結(jié)果，其分子基礎(chǔ)是基因突變或表達異常。第72頁,共134頁，2024年2月25日，星期天一、分化異常與腫瘤腫瘤起源于一些未分化或微分化的干細胞，主要表現(xiàn)出增殖過度、分化不全的特征。腫瘤細胞所處的分化狀態(tài)決定了腫瘤的惡性程度。例如白血病是多能造血干細胞在某一階段分化發(fā)育受阻的結(jié)果。第73頁,共134頁，2024年2月25日，星期天二、誘導分化與腫瘤治療腫瘤細胞在一定條件和誘導分化劑的作用下可以向正常細胞轉(zhuǎn)化：維甲酸治療白血病。第74頁,共134頁，2024年2月25日，星期天由同源細胞逐漸變?yōu)樵谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征等方面具有穩(wěn)定差異的另一類型細胞的過程稱為分化。細胞分化是胚胎發(fā)育和維持成體生存的重要因素。本章小節(jié)第75頁,共134頁，2024年2月25日，星期天已分化的細胞能夠去分化、轉(zhuǎn)分化。細胞向哪個方向分化是由各方面因素共同決定的。第76頁,共134頁，2024年2月25日，星期天從基因角度看細胞分化是基因按一定時空順序表達的結(jié)果，這種在個體發(fā)育過程中不同的基因按照一定的時空順序被激活的現(xiàn)象稱為“基因的差異表達”。第77頁,共134頁，2024年2月25日，星期天思考題：解釋下列名詞：細胞分化去分化轉(zhuǎn)分化細胞全能性干細胞管家基因奢侈基因基因的差異表達第78頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

回答下列問題：1.為什么腸上皮細胞頻繁地更新，而大部分神經(jīng)細胞的壽命可與機體的壽命一樣長？第79頁,共134頁，2024年2月25日，星期天分化、增殖狀態(tài)不同的三類細胞：持續(xù)增殖細胞：造血干細胞、表皮基底細胞、骨原細胞暫時不增殖細胞：肝細胞、初級卵母細胞不增殖細胞（終末細胞）：神經(jīng)元、紅細胞、表皮角質(zhì)細胞、骨細胞更新速度不同的三類細胞：不更新、接近機體壽命：神經(jīng)元、骨細胞、脂肪細胞緩慢更新：肝細胞、胃壁細胞、腎皮質(zhì)細胞快速更新：表皮細胞、紅細胞、白細胞

第80頁,共134頁，2024年2月25日，星期天干細胞

stemcell未分化細胞自我更新

(self-renew)無限增殖體外長期培養(yǎng)多向分化潛能

(multipotential)第81頁,共134頁，2024年2月25日，星期天干細胞的類型：

胚胎干細胞embryonicstemcells

胚胎干細胞主要是指來自囊胚內(nèi)細胞團的細胞，有自我更新和多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的各類細胞。成體干細胞

adultstemcells

成體干細胞是處于干細胞狀態(tài)的成體細胞，包括成年和未成年動物組織中的各種干細胞，因此又稱為組織干細胞。如神經(jīng)干細胞、造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、上皮干細胞、肝干細胞、胰腺干細胞等。第82頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎早期發(fā)生：囊胚形成

（囊胚內(nèi)細胞團）第83頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞的分離和建系

將囊胚內(nèi)細胞團的細胞通過體外培養(yǎng)產(chǎn)生未分化的細胞克隆，建立胚胎干細胞系1981年Evans和Martin首次成功分離和建立小鼠胚胎干細胞系1998年Thomson等首次成功分離和建立人胚胎干細胞系胚胎干細胞可在體外誘導分化形成各種成體細胞第84頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞體外誘導分化外源誘導因子誘導ES細胞分化

誘導因子：維甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纖維細胞生長因子(FGFs)等轉(zhuǎn)基因誘導ES細胞分化

用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使某種促分化基因在ES細胞中表達、調(diào)節(jié)其分化與其他細胞共培養(yǎng)誘導ES細胞分化

創(chuàng)造細胞分化的微環(huán)境第85頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞embryonicstemcells（ES細胞）第86頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞體外誘導分化第87頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞adultstemcells又稱組織干細胞tissuestemcells第88頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞的概念成體干細胞又稱組織干細胞，傳統(tǒng)的觀念認為它們是存在于成體組織的未分化細胞，現(xiàn)在認為也包括未成年動物的組織干細胞，它們具有不斷增殖和自我更新能力、又具有多向分化潛能。

如造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、上皮干細胞、胰腺干細胞、肝干細胞等第89頁,共134頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞的功能自然條件下成體干細胞傾向于分化成所在組織的細胞，參與組織更新和損傷修復；外界條件誘導下成體干細胞可橫向分化成其他組織的細胞，參與這些組織的損傷修復。第90頁,共134頁，2024年2月25日，星期天造血干細胞的分化第91頁,共134頁，2024年2月25日，星期天表皮干細胞的分化第92頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

干細胞應用前景細胞治療組織工程藥物篩選發(fā)育研究基因功能研究第93頁,共134頁，2024年2月25日，星期天干細胞和細胞治療

stemcellandcelltherapy第94頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

細胞治療

celltherapy

細胞治療是指將正常或遺傳改造過的人體細胞直接移植或輸入患者體內(nèi)，以達到替代受損細胞、治療疾病的目的。利用干細胞及其分化細胞進行細胞治療是干細胞臨床應用的重要研究方向。

胚胎干細胞和成體干細胞都能用于細胞治療，但目前只有少數(shù)成體干細胞在細胞治療上己開始取得臨床療效，大多數(shù)的干細胞治療還在實驗階段。第95頁,共134頁，2024年2月25日，星期天血液病的細胞治療如白血病的細胞治療

造血干細胞移植：自體移植（臍帶血造血干細胞）無排斥反應同系移植（同卵孿生之間骨髓造血干細胞）一般無排斥反應同種移植（人與人之間骨髓造血干細胞）有排斥反應（供、受者組織相容性抗原不同）

需組織配型、選擇供者（骨髓庫）；抑制受者的免疫應答、誘導免疫耐受。

第96頁,共134頁，2024年2月25日，星期天神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞治療如帕金森氏病細胞治療胚胎干細胞細胞移植神經(jīng)干細胞細胞移植

1、干細胞直接移植

2、誘導分化成相應神經(jīng)細胞（多巴胺能神經(jīng)元）后進行細胞移植

第97頁,共134頁，2024年2月25日，星期天心肌疾病的細胞治療如心肌梗塞的細胞治療

胚胎干細胞誘導分化成心肌細胞細胞移植成體干細胞（骨髓基質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、心肌干細胞等）誘導分化成心肌細胞細胞移植第98頁,共134頁，2024年2月25日，星期天干細胞治療中的難點異體移植的免疫排斥反應解決途徑：自身體細胞核移植（治療性克?。└杉毎蚋脑觳捎米陨砀杉毎闪鲂缘奈ｋU胚胎干細胞植入動物體內(nèi)會形成畸胎瘤，如何防止干細胞移植后可能因分化不徹底形成腫瘤，是必須解決的問題。解決途徑：完善定向誘導分化方法改進篩選純化技術(shù)第99頁,共134頁，2024年2月25日，星期天治療性克隆

（體細胞核移植）

第100頁,共134頁，2024年2月25日，星期天我們實驗室的一項工作胰腺干細胞的β細胞分化與I型糖尿病的干細胞治療第101頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

I型糖尿病的治療外源胰島素治療胰腺或胰島移植干細胞治療：

胚胎干細胞誘導分化成β細胞細胞移植基因?qū)胧蛊浔磉_胰島素細胞移植胰腺干細胞誘導分化成β細胞細胞移植第102頁,共134頁，2024年2月25日，星期天胰腺干細胞的標志

1990年，Lendahl等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞中存在一種新的中間絲蛋白—巢蛋白（nestin），現(xiàn)在nestin已是公認的神經(jīng)干細胞標志之一。

2000年，Hunziker和Stein發(fā)現(xiàn)胰腺導管和胰島中也存在nestin陽性細胞。

2001年，Zulewski等人從胰腺中分離到nestin陽性細胞，將其命名為NIPs（nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells），并發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能(multipotential)，在體外可自發(fā)形成類胰島細胞團（islet-likecellclusters,ICCs）.

因此，人們相信nestin可能也是胰腺干細胞的標志。但是，NIPs是否確實是胰腺干細胞，能否用于細胞治療必須進一步證實。2001年起，我們?yōu)榇俗隽艘稽c實驗。

第103頁,共134頁，2024年2月25日，星期天我們的實驗:人胎胰腺

nestin陽性細胞的分離、體外培養(yǎng)和生物學特性檢測（目的是確認NIPs是胰腺干細胞）；體外誘導分化NIPs形成能產(chǎn)生胰島素的β細胞；類胰島細胞團(ICCs)異種體內(nèi)移植—糖尿病的干細胞治療實驗研究。第104頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

第一個實驗：人胎胰腺nestin陽性細胞(NIPs)的分離、體外培養(yǎng)和生物學特性檢測第105頁,共134頁，2024年2月25日，星期天人胎胰腺的nestin陽性細胞的分布

免疫組化技術(shù)顯示nestin陽性細胞

nestin陽性細胞位于胰腺小導管壁及其相連的原始細胞團第106頁,共134頁，2024年2月25日，星期天分離胎胰導管和細胞團

在EHAA培養(yǎng)液（含2%FBS）中進行原代培養(yǎng)

在EHAA培養(yǎng)液中的胎胰導管和細胞團

培養(yǎng)48小時后細胞貼壁并開始鋪開第107頁,共134頁，2024年2月25日，星期天CK19

insulinnestin貼壁細胞鑒別：是否存在NIPs

免疫熒光染色檢測CK19、胰島素、nestin陽性細胞

呈CK19陽性的胰腺上皮細胞（細胞較大)

呈胰島素陽性的

β細胞（細胞較小）

nestin陽性細胞(NIPs)（梭形）第108頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

NIPs的篩選培養(yǎng)和體外擴增

貼壁細胞在無糖低血清條件培養(yǎng)液中篩選培養(yǎng)NIPs

4周后大部分細胞死亡、僅存少量梭形細胞(NIPs)

DMEM/F12培養(yǎng)液中加生長因子bFGF促進梭形細胞(NIPs)體外擴增。亞克隆純化、傳代培養(yǎng)圖為由單個梭形細胞(NIPs)形成的細胞集落梭形細胞(NIPs)可在體外長期傳代培養(yǎng)第109頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

NIPs的干細胞表型確定

免疫組化在蛋白質(zhì)水平檢測nestin表達

半定量RT-PCR在mRNA水平檢測nestin和干細胞標志基因ABCG2表達

nestin

semiquantitativeRT-PCR篩選培養(yǎng)的梭形細胞(NIPs)集落免疫組化顯示篩選培養(yǎng)的細胞均呈nestin陽性反應半定量RT-PCR顯示篩選培養(yǎng)的細胞表達nestin和ABCG2第110頁,共134頁，2024年2月25日，星期天nestin

NIPs達到80%鋪滿時可自發(fā)形成小的ICCsNIPs能自發(fā)形成類胰島細胞團(ICCs).NIPs在DMEM培養(yǎng)液(含11.1mM葡萄糖、10%FBS和20ng/mlbFGF)中培養(yǎng)免疫組化顯示這種ICCs主要由nestin陽性細胞組成RT-PCR顯示這種ICCs高水平表達ABCG2和nestin

RT-PCRanalysis第111頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)2周后形成的ICCs大而致密glucagon

NIPs具有多向分化潛能培養(yǎng)液中撤去bFGF使NIPs分化RT-PCRanalysis免疫組化顯示此時ICCs表達glucagonRT-PCR顯示此時ICCs有多種譜系基因的表達，具有向胰腺多種類型細胞分化的能力第112頁,共134頁，2024年2月25日，星期天這一實驗結(jié)果表明：NIPs表達干細胞標志ABCG2，能長期培養(yǎng)，有多向分化潛能，在細胞形態(tài)、生長行為和分化潛能上具有干細胞特征，因此可以認為是胰腺干細胞.

ABCG2是ABC運輸?shù)鞍祝ˋTPbindingcassettetransporter）家族成員，其功能是將細胞內(nèi)的促分化因子泵出細胞以維持干細胞的未分化狀態(tài)，現(xiàn)在認為它是干細胞狀態(tài)決定因子。已有報道ES細胞、造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、肌干細胞等均表達ABCG2。第113頁,共134頁，2024年2月25日，星期天第二個實驗：

體外誘導分化NIPs形成產(chǎn)生胰島素的β細胞；第114頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)10天后形成很多大而致密的ICCsinsulin誘導NIPs形成β細胞

NIPs在含高濃度葡萄糖(16.5mM)和多種誘導因子(IGF,HGF,betacellulinandnicotinamide)的DMEM

培養(yǎng)液中培養(yǎng)

RT-PCRanalysis免疫組化顯示ICCs中有胰島素陽性的β

細胞此時ICCs表達β

細胞的標志，但仍少量表達NIPs和其他細胞的標志第115頁,共134頁，2024年2月25日，星期天ICCs的細胞內(nèi)胰島素含量

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測定ICCs的細胞內(nèi)胰島素含量β細胞誘導分化后的ICCs(ICC3)細胞內(nèi)胰島素含量明顯高于多向分化的ICCs(ICC2)，但仍低于胎胰胰島(islet)的胰島素含量第116頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

insulinsecretioninresponsetoglucose

葡萄糖或促分泌素對ICCs分泌胰島素的作用

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測定ICCs分泌胰島素量

T:tolbutamideC:carbacholG:GLP-1

insulinsecretioninresponsetosecretagogues在不同濃度葡萄糖刺激下ICCs中β細胞胰島素分泌量與萄葡糖濃度呈正相關(guān)各種分泌刺激因子刺激ICCs釋放胰島素。T--甲苯磺丁脲C--碳酰膽堿G--胰高血糖素樣肽第117頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

這一實驗結(jié)果表明：NIPs具有多向分化潛能，在一定條件下能定向分化為功能性β細胞.

尚待解決的問題：

1、誘導分化不徹底，在產(chǎn)生β細胞同時，還存在其他類型細胞；

2、體外分泌胰島素水平遠低于正常胰島。第118頁,共134頁，2024年2月25日，星期天

第三個實驗：

類胰島細胞團(ICCs)異種體內(nèi)移植—

糖尿病的干細胞治療實驗研究。

（將定向誘導人NIPs形成含β細胞的ICCs

移植到嚴重聯(lián)合免疫缺失小鼠體內(nèi)）第119頁,共134頁，2024年2月25日，星期天糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射鏈脲佐菌素STZ)

腎膜下移植ICCs治療糖尿病NOD-Scid小鼠腹腔內(nèi)注射streptozotocin腎膜下移植含類β細胞的ICCs高血糖

注射STZ前注射STZ后

移植ICCS后

302010

血糖水平(mmol/l)

注射后3天小鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的高血