核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用

關(guān)于核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用15.04.20242核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的建立人員場(chǎng)地檢測(cè)方法選擇實(shí)施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)）第2頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20243核酸實(shí)驗(yàn)室人員要求資質(zhì):經(jīng)過(guò)臨檢中心PCR培訓(xùn)班培訓(xùn)并取得上崗證；通過(guò)血站核酸實(shí)驗(yàn)室崗前培訓(xùn)考試合格。培訓(xùn):①無(wú)”核酸”的概念形成,②防污染的概念③良好工作習(xí)慣的培養(yǎng).④報(bào)告的正確發(fā)放.后備人員的培養(yǎng).第3頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20244試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)樣本離心交接區(qū)報(bào)告發(fā)放區(qū)核酸實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地第4頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20245

方法選擇:TMA與PCRTMAPCR擴(kuò)增原理模擬自然DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的過(guò)程模擬自然DNA復(fù)制的過(guò)程靶目標(biāo)RNADNA酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反應(yīng)體系兩種酶，兩條引物，dNTP,NTP一種酶，一對(duì)引物，dNTP溫度條件恒溫（41.5℃）循環(huán)導(dǎo)熱（變性，退火，延伸）擴(kuò)增儀器水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀擴(kuò)增產(chǎn)物RNADNA擴(kuò)增速度每個(gè)循環(huán)可以生成100-1000個(gè)復(fù)制物，在15-30分鐘內(nèi)可增加10億倍復(fù)制物以2n擴(kuò)增，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大10億倍第5頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20246TMA的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)自動(dòng)化程度高靈敏度高擴(kuò)增效率高：10n

不能絕對(duì)定量第6頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20247PCR的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)易于自動(dòng)化靈敏度高

擴(kuò)增效率高匯集拆分過(guò)程繁瑣

拆分可減低非反應(yīng)性比率第7頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20248核酸試劑質(zhì)控試劑的確認(rèn)試劑運(yùn)輸過(guò)程的控制(溫度\條件\時(shí)限)

靈敏度的要求內(nèi)標(biāo)的要求試劑涵蓋的基因型

第8頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.20249檢測(cè)流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標(biāo)本檢測(cè)流程第9頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202410檢測(cè)流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標(biāo)本檢測(cè)流程第10頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202411檢測(cè)流程(3):平行檢測(cè)流程樣本清點(diǎn)交接核酸單份檢測(cè)常規(guī)檢測(cè)合格標(biāo)本不合格標(biāo)本陰性標(biāo)本反應(yīng)性標(biāo)本合格標(biāo)本發(fā)布結(jié)果單項(xiàng)目反應(yīng)性無(wú)反應(yīng)性

陽(yáng)性或可疑結(jié)果淘汰

陽(yáng)性或可疑結(jié)果淘汰第11頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202412標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫(xiě)核酸實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測(cè)流程核酸實(shí)驗(yàn)室崗位職責(zé)核酸實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)本管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評(píng)價(jià)規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室記錄管理制度核酸實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)規(guī)范核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者追蹤規(guī)程核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)急措施第12頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202413標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫(xiě)核酸標(biāo)本離心交接操作規(guī)程核酸標(biāo)本提取及匯集操作規(guī)程(科華)核酸標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)操作規(guī)程（科華）核酸標(biāo)本全自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）核酸標(biāo)本檢測(cè)報(bào)告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）核酸標(biāo)本檢測(cè)復(fù)檢操作規(guī)程生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程可移動(dòng)紫外線燈標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程低溫高速離心機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程ABI7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程第13頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202414

核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施主要的污染源擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)本之間產(chǎn)生的氣溶膠操作人員手衣服第14頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202415核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施要有獨(dú)立的空氣處理系統(tǒng).各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通實(shí)驗(yàn)室保持合理的通風(fēng)對(duì)各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進(jìn)行標(biāo)示，專(zhuān)區(qū)專(zhuān)用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）空氣：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)試劑陽(yáng)性對(duì)照儲(chǔ)存在標(biāo)本制備區(qū)使用帶濾芯的吸頭第15頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202416核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施使用外排式的生物安全柜自配試劑應(yīng)分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應(yīng)廢棄使用次氯酸鈉溶液消毒（臺(tái)面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）使用紫外線照射（空氣和臺(tái)面）使用無(wú)水乙醇溶液（空氣噴霧）第16頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202417核酸實(shí)驗(yàn)室污染后措施實(shí)驗(yàn)室污染后，如何處理？通風(fēng)次氯酸鈉溶液（擴(kuò)增區(qū)不宜使用）HCL溶液（吸頭）紫外線（固定、移動(dòng)）酒精噴灑（空氣）應(yīng)設(shè)計(jì)有備用實(shí)驗(yàn)室

:如開(kāi)設(shè)獨(dú)立的報(bào)告發(fā)放區(qū)作為備用第17頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202418中心理念：監(jiān)測(cè)全程的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過(guò)程的效率。血篩核酸檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)的作用內(nèi)標(biāo)的作用質(zhì)控整個(gè)反應(yīng)。提示假陰性檢測(cè)結(jié)果。監(jiān)控反應(yīng)的外部條件內(nèi)標(biāo)濃度要合適保持適度的內(nèi)標(biāo)失控.(<0.2%)第18頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202419核酸試劑靈敏度評(píng)估概率單位回歸分析(PROBIT）用于描述劑量-反應(yīng)或不同因素間的劑量-反應(yīng)比較，反應(yīng)結(jié)果應(yīng)該是以二分類(lèi)形式表達(dá)的。概率單位的回歸方程為：

PROBITPi=A+BXi第19頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202420

用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度評(píng)估血液HBV核酸篩查方法，結(jié)果如下。請(qǐng)計(jì)算95%的檢出限量及可信范圍CI

序號(hào)濃度（IU/ml）陽(yáng)性數(shù)/重復(fù)數(shù)

概率15003/310021006/61003508/81004307/887.55104/850652/825710/50第20頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202421

AnalysisofParameterEstimates

Standard95%ConfidenceChi-

ParameterDFEstimateErrorLimitsSquarePr>ChiSq

Intercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028

log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011

應(yīng)用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果第21頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202422

ProbitAnalysisonDoseProbabilityDose95%FiducialLimits0.509.570175.1203815.551100.5510.631756.0286917.840470.6011.831137.0273720.773340.6513.213168.1239224.640980.7014.844679.3358129.907500.7516.8320510.6994437.369630.8019.3597312.2864148.541110.8522.7890014.2417966.740000.9027.9795316.90417101.074790.9129.4011617.58727111.931570.9231.0275518.34915125.130150.9332.9198819.21204141.541650.9435.1700620.20878162.548510.9537.9247421.39086190.49822第22頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202423第23頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202424陽(yáng)性獻(xiàn)血者的追蹤溝通原則:專(zhuān)業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。溝通方式：電話、面談溝通技巧：表?yè)P(yáng)和鼓勵(lì)、合理解釋、知情、適當(dāng)?shù)膯?wèn)候第24頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202425獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)不合格解釋由于核酸檢測(cè)方法目前尚不能排除假陽(yáng)性，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進(jìn)入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測(cè)不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不作為獻(xiàn)血者健康體檢指標(biāo)。更不宜作為疾病診療指標(biāo)。獻(xiàn)血者獻(xiàn)血權(quán)利仍保留。第25頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202426關(guān)于核酸檢測(cè)的解釋匯集結(jié)果成反應(yīng)性,拆分結(jié)果為陰性.內(nèi)標(biāo)失敗.ELISA(+),核酸結(jié)果為(-)ELISA(-),核酸結(jié)果為(+)核酸單檢結(jié)果反應(yīng)性與血液發(fā)放.化學(xué)發(fā)光法與核酸檢測(cè).第26頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.2024271.靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻(xiàn)血者漏檢。HBVDNA靈敏度宜50拷貝/ml.2.引物是否有效性,能否檢測(cè)亞型和突變株感染。3.假陽(yáng)性，防污染措施（血篩主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率與自動(dòng)化.5.需要規(guī)范化場(chǎng)地和高素質(zhì)的操作人員.6.參加國(guó)際間室間質(zhì)控,提高檢測(cè)水準(zhǔn).血液核酸篩查注意的問(wèn)題第27頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202428深圳血液中心核酸檢測(cè)概況對(duì)161228人份酶免疫檢測(cè)結(jié)果陰性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，共檢出33例不相同HBVDNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者，總比率為1：4885。檢出anti-HCV陰性、HCVRNA陽(yáng)性1例，定量結(jié)果為1.2×105IU/ml。3個(gè)月后追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。第28頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202429項(xiàng)目科華（自動(dòng)化）科華（半自動(dòng)化）美國(guó)羅氏上海浩源凱榮（CHIRON）方法學(xué)全自動(dòng)提取+實(shí)時(shí)熒光PCR病毒離心富集+半自動(dòng)提取+實(shí)時(shí)熒光PCR全自動(dòng)提取+PCR-ELISA半自動(dòng)提取+PCR+毛細(xì)管電泳分離TMA匯集量8×45ul8×150ul24×45ul5×200ul500ul單人份檢測(cè)數(shù)6849637041315121412514603HBVDNA陽(yáng)性數(shù)122838HBV陽(yáng)性比率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸檢測(cè)概況第29頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202430HBVDNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤情況

對(duì)17位HBVDNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤，9位獻(xiàn)血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。4例呈窗口期特征（或部分），2例獻(xiàn)血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象1例獻(xiàn)血者原為乙肝大三陽(yáng)患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻(xiàn)血，常規(guī)檢測(cè)為合格，核酸檢測(cè)HBVDNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛?yáng)性第30頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202431第31頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202432第32頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202433第33頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202434第34頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202435第35頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.202436

HBVDNA檢測(cè)陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤概況追蹤時(shí)間(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18－－－＋－＋+2124－－－＋－＋1504528＋－－＋－＋未檢出9126＋－－＋－＋未檢出15631＋－－＋－＋未檢出21429＋－－＋－＋未檢出第36頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.04.2024371號(hào)獻(xiàn)血者在追蹤時(shí)表明曾經(jīng)是大三陽(yáng),治療轉(zhuǎn)陰后獻(xiàn)血,被核酸檢出陽(yáng)性,7天后HBsAg檢測(cè)(+).