精液冷凍技術(shù)

關(guān)于精液冷凍技術(shù)精液冷凍的歷史（一）探索

1776年，Spallanzani發(fā)現(xiàn)精液在自然冰雪中冷凍后復(fù)溫部分精子恢復(fù)活力

1938年，Jahnelv發(fā)現(xiàn)精液儲(chǔ)存于-79℃

的玻璃管40天后復(fù)溫部分恢復(fù)活力

1940年，Shettles置精液于毛細(xì)玻璃管內(nèi)-196℃

儲(chǔ)存，存活率不超過10%突破

1949年，Polge等發(fā)現(xiàn)用甘油作為冷凍精子的保護(hù)劑第2頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的歷史（二）奠基

1954年后的十年中，Sherman發(fā)明了使用10%甘油作保護(hù)劑，用-196℃

液氮蒸氣作制冷劑的方法，獲得76%的冷凍生存率，得到普遍認(rèn)可發(fā)展在Sherman發(fā)明的方法基礎(chǔ)上，從冷凍方法、保護(hù)劑種類等方面的研究發(fā)展迅速穩(wěn)定經(jīng)過多年的發(fā)展，精子冷凍技術(shù)相對(duì)穩(wěn)定，探索不止

第3頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（一）一、冷凍精液長(zhǎng)期儲(chǔ)存的原理一定的低溫條件下細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)速度減慢甚至停止細(xì)胞代謝降低，處于休眠狀態(tài)一般認(rèn)為-196℃

的液氮是安全的

第4頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（二）二、冷凍對(duì)精子的損傷機(jī)理

1、溶質(zhì)損傷效應(yīng)：（慢速冷凍損傷）

溫度降低至冰點(diǎn)細(xì)胞外液中的水分先形成冰晶細(xì)胞外液電解質(zhì)濃度增加，滲透壓增高水分從細(xì)胞內(nèi)流向細(xì)胞外，細(xì)胞發(fā)生收縮胞外冰晶的不斷形成使高滲狀態(tài)和細(xì)胞收縮持續(xù)進(jìn)行過度暴露在高濃度溶質(zhì)環(huán)境或過度收縮，引起損傷第5頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（三）2、冰晶的機(jī)械損傷效應(yīng)：（快速冷凍損傷）溫度降低達(dá)到細(xì)胞內(nèi)冰點(diǎn)未能轉(zhuǎn)移至胞外的水分形成冰晶破壞胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，引起死亡Wolley等人的研究顯示，超微結(jié)構(gòu)的變化是發(fā)生在融化期間或融化之后第6頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍的原理（四）三、精液冷凍的基本原理冷凍損傷是肯定的在兩種損傷之間尋找平衡點(diǎn)，即最佳的降溫速率使兩種損傷的總和達(dá)到最小，得到最大的冷凍生存率實(shí)現(xiàn)起來非常困難冷凍保護(hù)劑的出現(xiàn)是一大突破第7頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理（一）一、冷凍保護(hù)劑的分類1.根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類：醇類、酰胺類、高分子多糖類、單糖類、蛋白質(zhì)類、無機(jī)鹽類等2.根據(jù)作用機(jī)理分類：（1）滲透性冷凍保護(hù)劑：丙三醇、DMSO、乙二醇等（2）非滲透性冷凍保護(hù)劑：右旋糖酐、羥乙基淀粉、卵黃等第8頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理（二）二、滲透性冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理1、滲入細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差距。當(dāng)細(xì)胞外凍結(jié)時(shí)，減輕細(xì)胞皺縮的程度和速度2、細(xì)胞外保護(hù)劑的存在，可以降低細(xì)胞外液中溶質(zhì)的濃度，減少高濃度溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損壞3、能與細(xì)胞內(nèi)水分及電解質(zhì)結(jié)合的特性，導(dǎo)致水合結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定，發(fā)揮抗凍作用4、僅對(duì)慢速冷凍有保護(hù)作用第9頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理（三）三、非滲透性冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理此類物質(zhì)不能進(jìn)入細(xì)胞，冷凍時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水分外溢，細(xì)胞發(fā)生皺縮，從而減少了細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成

對(duì)快速冷凍和慢速冷凍都有保護(hù)作用

卵黃的作用：卵磷脂能穩(wěn)定精子的細(xì)胞膜，阻止頂體膜破裂，抵抗“溫度休克”第10頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理（四）四、冷凍保護(hù)劑的聯(lián)合作用1.冷凍保護(hù)劑劑量增加，其低溫保護(hù)作用增強(qiáng)2、冷凍保護(hù)劑的毒性作用3、兩種毒性機(jī)理不同的冷凍保護(hù)劑合用，可以達(dá)到相同的效果，而減少毒性作用4.滲透性冷凍保護(hù)劑與非滲透性冷凍保護(hù)劑聯(lián)合使用第11頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（一）一、冷凍過程中精子通過的溫度階段溫度休克階段室溫~+5℃

冰晶的潛熱階段+5℃~-5℃

冰晶的形成階段-5℃~-15℃

再結(jié)晶階段-15℃~-80℃

儲(chǔ)存階段-80℃~-196℃

第12頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（二）1、溫度休克階段溫度休克：指細(xì)胞不是由于直接的冷卻作用，而是由于溫度急劇變化而造成的損害。許多種屬的細(xì)胞比較明顯，如牛精子在2℃/分的降溫速率下，就可能死亡人類精子對(duì)溫度休克有相當(dāng)?shù)牡挚沽Γ?℃/分的降溫速率比較合適2、冰晶的潛熱階段在通過+5℃~-5℃

的溫度階段時(shí)，由于冰晶形成放出熱量，溫度突升高。為了減少潛熱釋放、溫度升高對(duì)精子的損傷，應(yīng)快速通過。第13頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（三）3、冰晶形成階段精液作為一個(gè)整體從液相轉(zhuǎn)變成固體相，伴隨冰晶形成及由此產(chǎn)生的急驟溫度變化。在添加冷凍保護(hù)劑后，以5-7℃/分的速率通過，能獲得理想的生存率4、再結(jié)晶階段溫度低于-30℃

時(shí)，由于冰晶的生長(zhǎng)和相互結(jié)合，產(chǎn)生溫度波動(dòng)，再結(jié)晶改變了細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)平衡，造成了進(jìn)一步損傷，這種現(xiàn)象稱為遷移性再結(jié)冰。一般認(rèn)為，這種現(xiàn)象一直維持至-80℃?？焖偻ㄟ^能避免這種損傷。第14頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（四）5.儲(chǔ)存階段雖然低于-80℃細(xì)胞內(nèi)已無結(jié)冰現(xiàn)象，但經(jīng)研究證實(shí)，即使在-100℃下儲(chǔ)存，精子生存率仍會(huì)逐步的下降，因?yàn)槟承┟割愡€具備一定的活性，使細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單、緩慢的代謝。一般認(rèn)為，在-196℃液氮中保存是安全的。第15頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（五）二、冷凍的程序和方法根據(jù)精子冷凍時(shí)需要通過的溫度階段，冷凍程序設(shè)計(jì)的原理基本相同，但在實(shí)現(xiàn)的方法上卻有很多種，主要有以下幾種：1、二步法將精液置于液氮水平面上一個(gè)固定距離一定時(shí)間，然后浸入液氮中儲(chǔ)存。第16頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（六）2、三步法將精液分別置于液氮水平面上兩個(gè)不同的距離一定時(shí)間，然后浸入液氮中儲(chǔ)存。3、多步法利用程序降溫儀來實(shí)現(xiàn)4、其它方法顆粒法、一步法、冰箱預(yù)冷等第17頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍的程序和方法（七）三、精液的凍貯方式顆粒法：設(shè)備簡(jiǎn)單，易污染，難標(biāo)記安瓿法：易標(biāo)記，封口后不易污染，火焰熔封較繁瑣，易爆炸或破裂麥管法：易標(biāo)記，降溫均勻，可直接授精，封口較繁瑣，儲(chǔ)存管理不便塑料凍存管法：易標(biāo)記，易封口，易儲(chǔ)存管理，復(fù)溫偶有爆炸注射器法：可直接授精，儲(chǔ)存管理不便，不宜大量?jī)鲑A第18頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護(hù)劑的種類與配制（一）一、冷凍保護(hù)劑的種類1、單純甘油型2、甘油復(fù)合型甘油-卵黃-枸櫞酸鈉型（G-Y-C型）甘油-Tyrode液型TEST-Tris-甘油-卵黃-枸櫞酸鈉型甘油-蔗糖-HEPES-HTF型3、無甘油復(fù)合型第19頁,共23頁，2024年2月25日，星期天冷凍保護(hù)劑的種類與配制（二）二、甘油-卵黃-枸櫞酸鈉型冷凍保護(hù)劑的配制冷凍保護(hù)劑配方(總量=20ml)CPM：SEMEN甘油(ml)卵黃(ml)枸椽酸鈉(mg)葡萄糖(mg)純水(ml)

1：1

2.8

4.0

377

169

13.2

1：2

4.2

6.0

565

250

9.8

1：3

5.6

8.0

754

338

6.4第20頁,共23頁，2024年2月25日，星期天影響精液冷凍質(zhì)量的因素關(guān)鍵因素：冷凍程序、冷凍保護(hù)劑其他因素：禁欲時(shí)間：３-５天精液取出至冷凍時(shí)間：１小時(shí)之內(nèi)冷凍保護(hù)劑的添加方式：室溫，緩慢添加復(fù)溫方式與時(shí)間：３７℃水浴１０分鐘精液分析的標(biāo)準(zhǔn)化第21頁,共23頁，2024年2月25日，星期天精液冷凍技術(shù)的新進(jìn)展

---玻璃化