儀器分析：第八章 分子發(fā)光分析法 分子熒光法

2024/4/15第八章

分子發(fā)光分析法8.1.1熒光與磷光的產(chǎn)生過(guò)程8.1.2

熒光光譜8.1.3熒光光譜的基本特征8.1.4熒光的產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系8.1.5影響熒光強(qiáng)度的因素8.1.6儀器與結(jié)構(gòu)流程8.1.7熒光分析方法與應(yīng)用第一節(jié)

分子熒光法Molecularluminescenceanalysis

molecularfluorescence2024/4/158.1.1

分子熒光與磷光產(chǎn)生過(guò)程

由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1.分子能級(jí)與躍遷

分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜。在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)?；鶓B(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位。激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見(jiàn)能級(jí)圖)；速度最快激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1，S2，…

。第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1，T2，…

。2024/4/152.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過(guò)其他途徑進(jìn)入(見(jiàn)能級(jí)圖)；進(jìn)入的概率小。2024/4/153.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短，返回速度快的途徑，發(fā)生的概率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。熒光：10-7～10-9

s，第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s，第一激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)。2024/4/15非輻射能量傳遞過(guò)程：

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12

s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重態(tài)電子能級(jí)中，等能級(jí)間無(wú)輻射能級(jí)交換。通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài)有重疊轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋-軌道偶合進(jìn)行。2024/4/15S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫2024/4/15輻射能量傳遞過(guò)程：

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(多為S1→S0躍遷)，發(fā)射波長(zhǎng)為

2的熒光；10-7～10-9

s。發(fā)射熒光的能量比分子吸收的小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；

2>

2>

1；

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(T1→S0躍遷)

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。2024/4/158.1.2

熒光光譜

兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。同步熒光光譜和三維熒光光譜。

1.熒光光譜類(lèi)型（1）發(fā)射光譜（熒光光譜）

固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),

化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(xiàn)。2024/4/15（2）激發(fā)光譜

固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線(xiàn)(圖中曲線(xiàn)Ⅰ)。激發(fā)光譜曲線(xiàn)的最高處，激發(fā)態(tài)分子最多，熒光強(qiáng)度最大。2024/4/152024/4/15（3）同步熒光光譜采用同步掃描技術(shù)（兩個(gè)單色器同步轉(zhuǎn)動(dòng)），同時(shí)記錄所獲得的譜圖，稱(chēng)為同步熒光光譜。

2024/4/15同步掃描可采取三種方式進(jìn)行：

（1）固定波長(zhǎng)差同步掃描法。保持激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差固定（

=

em–

ex=常數(shù)）。（2）固定能量差同步掃描法。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差（波數(shù)差=常數(shù)）。（3）可變波長(zhǎng)（可變角）同步掃描法。使兩單色器分別以不同速率進(jìn)行掃描，即掃描過(guò)程中激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差是不固定的。2024/4/15同步熒光光譜的特點(diǎn)：（1）同步掃描至激發(fā)光譜與發(fā)射光譜重疊波長(zhǎng)處，才同時(shí)產(chǎn)生信號(hào)。（2）

的選擇直接影響所得到的同步光譜的形狀、帶寬和信號(hào)強(qiáng)度。（3）譜圖簡(jiǎn)單，譜帶窄，減小了譜圖重疊現(xiàn)象和散射光的影響，提高了分析測(cè)定的選擇性。（4）損失了其他光譜帶，提供的信息量減少。

2024/4/15(4)三維熒光光譜

以熒光強(qiáng)度、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜為坐標(biāo)；可表現(xiàn)出激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化時(shí)熒光強(qiáng)度的變化信息，提供了更加完整的熒光光譜信息。

2024/4/158.1.3熒光光譜的基本特征1.

Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。2.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如

2)。3.鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。

2024/4/15鏡像規(guī)則的解釋:

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷概率最大，相反躍遷亦然。2024/4/15200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜λ/nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜相對(duì)強(qiáng)度2024/4/158.1.4

熒光的產(chǎn)率與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（Φ）：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2024/4/152.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光

熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)相似，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。為什么？（1）躍遷類(lèi)型：*→熒光效率高，系間跨越過(guò)程速率常數(shù)小，有利熒光的產(chǎn)生。（2）共軛效應(yīng)：共軛度高，熒光效率高并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，有很強(qiáng)的熒光。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。2024/4/152024/4/158.1.5

影響熒光強(qiáng)度的因素

影響熒光強(qiáng)度的外部因素如下。1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的概率增加。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。2024/4/154.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色氨酸中的重鉻酸鉀。2024/4/155.溶液熒光的猝滅

熒光猝滅：熒光分子與溶劑分子或其他分子間相互作用,使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。

猝滅劑：能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。

原因：碰撞猝滅（動(dòng)態(tài)猝滅，主要原因）、靜態(tài)猝滅（熒光分子與猝滅劑生成不產(chǎn)生熒光的配合物）、轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅、自吸收猝滅等

氧（O2

）：最常見(jiàn)的猝滅劑，測(cè)定時(shí)除氧。

高濃度時(shí)：熒光分子發(fā)生自吸收現(xiàn)象。

2024/4/158.1.6儀器與結(jié)構(gòu)流程測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、試樣池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。

基本流程圖：?jiǎn)紊鳎哼x擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器。光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見(jiàn)與紫外區(qū))。檢測(cè)器：光電倍增管。2024/4/15儀

器

光

路

圖2024/4/15儀器框圖該型儀器可進(jìn)行熒光、磷光和發(fā)光分析。2024/4/15同步掃描技術(shù)根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差(

)和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種。

同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜。譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。

合適的

可減少光譜重疊。酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但

<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；

>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。2024/4/15可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖。2024/4/158.1.7

熒光分析方法與應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見(jiàn)分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？檢出限：0.1～0.01g/mL

相對(duì)靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。2024/4/152.定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子產(chǎn)率Φ：

If

=Φ

Ia

由朗伯-比爾定律：Ia

=I0(1-10-κ

lc)

If

=Φ

I0(1-10-

κ

lc)=Φ

I0(1-e-2.3κ

lc)

濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3Φ

I0

lc=kc2024/4/15（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣，測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出濃度。比較法：在線(xiàn)性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較。2024/4/153.熒光分析法的應(yīng)用(1)無(wú)機(jī)化合物的分析

與