植物脫毒技術

關于植物脫毒技術一.病毒在植物體內的分布及危害；二.植物脫毒的意義三.植物脫毒的原理和方法；四.植物脫毒苗的鑒定；五.植物脫毒苗保存、應用與繁殖教學內容

第2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天目的與要求：了解：1、病毒在植物體內的分布及危害。理解：1、脫毒苗的意義；2、植物脫毒苗的鑒定、保存、應用與繁殖。掌握：1、無病毒苗概念；2、植物脫毒的原理和方法。。第3頁,共50頁，2024年2月25日，星期天病毒對寄主植物可造成毀滅性危害，導致大幅度減產(chǎn)，甚至全株死亡。潛隱性病毒侵染植物造成癥狀不明顯的慢性危害，不易被發(fā)現(xiàn)，尤其危險。國內外解決作物病蟲害的有效途徑是培育無病毒苗，實施農(nóng)作物無病毒化栽培。第4頁,共50頁，2024年2月25日，星期天無病毒苗

是指不含該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測主要病毒在植物內的存在表現(xiàn)陰性反應的苗木。脫毒后的馬鈴薯苗第5頁,共50頁，2024年2月25日，星期天一.病毒在植物體內的危害及分布1.危害:

絕大多數(shù)植物都可以無性繁殖的,容易受到多種病原菌的侵染,體內積累濃度相當高的病毒。在無性繁殖的種類中，由于病毒通過營養(yǎng)體進行傳遞，在母株內逐代積累，危害日趨嚴重。病原菌的侵染不一定會造成植物的死亡,卻會大大降低植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量和質量,從而影響其栽培的經(jīng)濟效益。因此,脫除病毒及其他病原菌對植物栽培生產(chǎn)是非常必要的。第6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天一.病毒在植物體內的危害及分布2.分布在植物體內的分布具有不均勻性，隨植株不同部位和年齡而異。老葉和成熟組織及器官中病毒含量較高根尖、莖尖生長點約0.1~1mm區(qū)域內，幾乎不含病毒。（原因？）(原因：分生組織細胞分裂和生長速度快，而病毒在植物體細胞內繁殖速度相對較慢；另外，病毒是通過篩管組織或胞間聯(lián)絲傳播至其他組織細胞的，而莖尖分生組織無分化，沒有維管組織。)第7頁,共50頁，2024年2月25日，星期天二、植物脫毒的意義

任何一種優(yōu)良品種均需有一個穩(wěn)定地保存其遺傳性狀的繁殖方法。

離體無性繁殖可以很好地保持品種的優(yōu)良特性，是無性繁殖品種繁育的理想途徑。1、能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性第8頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2、快速繁殖品種，使優(yōu)良品種迅速應用

◆離體繁殖周期短◆不受季節(jié)限制◆繁殖系數(shù)高◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的

又稱之為快繁第9頁,共50頁，2024年2月25日，星期天3、生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化受病毒危害嚴重的作物：大田作物：馬鈴薯、甘薯、甘蔗、煙草蔬菜：白菜、大蒜、蔥、番茄、籮卜果樹：柑橘、蘋果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各種菊花、天竺葵、紫羅蘭第10頁,共50頁，2024年2月25日，星期天4、節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率塊根、塊莖、鱗莖為繁殖器官的作物，每年產(chǎn)品用留作種的比例：

◆大蒜：留種量占產(chǎn)量的五到八分之一

◆馬鈴薯：留種量占產(chǎn)量的十分之一

◆貝母：留種量占產(chǎn)量的三分之一(貝母：多年生草本植物,其鱗莖供藥用,有止咳化痰、清熱散結之功。產(chǎn)于四川、云南、陜西秦巴山區(qū)，甘肅等地)第11頁,共50頁，2024年2月25日，星期天5、便于運輸

常規(guī)的塊根、塊莖等，體細胞大、含水量高，包裝、運輸十分不便。離體繁殖的種苗體積小，易攜帶，運輸十分方便。第12頁,共50頁，2024年2月25日，星期天以馬鈴薯為例：按一畝地4000株計算，常規(guī)薯4000個重200kg（每個50g），若用試管薯4000個則只有2kg（每個0.5g）。第13頁,共50頁，2024年2月25日，星期天三、植物脫毒的原理和方法（一）植物脫毒原理：1）植物病毒本身不具有主動轉移的能力。

在一個植物體內，病毒易于通過維管系統(tǒng)而移動，但在分生組織中不存在維管系統(tǒng)。病毒在細胞間移動只能通過胞間連絲，速度很慢，難趕上活躍生長的莖尖；

第14頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2）在旺盛分裂的分生細胞中，代謝活性高，競爭抑制了病毒的復制；

3）在植物體內，可能存在著病毒鈍化系統(tǒng)，它在分生組織中比其他任何區(qū)域具有更高的活性。4）在莖尖存在高水平內源生長素，也可能抑制病毒的增殖。第15頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（二）植物脫病毒方法物理方法化學方法生物方法高溫處理莖尖培養(yǎng)微體嫁接珠心培養(yǎng)愈傷脫毒熱處理脫毒第16頁,共50頁，2024年2月25日，星期天1.熱處理脫毒法熱處理脫毒原理病毒DNA分子進入細胞后隨植物細胞DNA一起復制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒活性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，失去傳染能力。

作為一種物理效應可以加速植物細胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。第17頁,共50頁，2024年2月25日，星期天熱處理方法（1）愈傷組織熱處理

離體培養(yǎng)愈傷組織熱處理繼代分化培養(yǎng)。

常用溫度及時間：低溫37—38℃處理2周、4周或8周；高溫50℃處理3—5min。第18頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（2）熱空氣處理脫毒法試驗母株在高溫生長室中生長一段時間，其頂端分生組織比次生分生組織生長迅速，后切取其莖尖分生組織進行離體培養(yǎng)。生長室溫度35-40℃光照3000—10000lx第19頁,共50頁，2024年2月25日，星期天熱處理的優(yōu)缺點優(yōu)點:

方法簡單，效果明顯。缺點:

1)具有局限性，不能去除所有病毒。只對圓形病毒（蘋果花葉病毒），或對線狀病毒（馬鈴薯卷葉病毒）有效；而對桿狀病毒（千日紅病毒）無效。2)熱處理后只有小部分植株能夠存活。極易使植物材料受熱枯死，造成損失3）延長熱處理時間，病毒鈍化效果好，同時也可能會鈍化植物組織中的抗性因子而降低處理效果。第20頁,共50頁，2024年2月25日，星期天其它效果香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下經(jīng)兩個月處理可除去全部病毒。第21頁,共50頁，2024年2月25日，星期天馬鈴薯在37℃下處理10～20天能除去卷葉病毒。第22頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2.組織培養(yǎng)脫毒法包括微莖尖培養(yǎng)脫毒、愈傷組織培養(yǎng)脫毒、珠心組織培養(yǎng)脫毒。（1）微莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒效果好后代遺傳穩(wěn)定使用最廣泛的一種方法第23頁,共50頁，2024年2月25日，星期天1）原理及依據(jù)病毒在植物體內分布不均，莖尖處含量最少病毒DNA分子與細胞分裂蛋白質合成競爭2）操作程序外植體經(jīng)表面消毒滅菌后，在解剖鏡下，經(jīng)無菌操作切取小莖尖，接種到備用培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室內進行培養(yǎng)，并及時觀察和記錄培養(yǎng)結果。第24頁,共50頁，2024年2月25日，星期天莖尖培養(yǎng)1）莖尖大?。阂话阋詭?-2片葉原基為好，大小為0.2-0.3毫米為宜，超過0.5毫米時，脫毒效果差。（外植體過小莖尖存活率低）2）培養(yǎng)基：能使莖尖快速生長、分化的培養(yǎng)基均適于脫毒。3）前處理：切取莖尖之前，植物材料如經(jīng)過預處理，如熱水或熱空氣處理、低溫處理、藥物處理，均可大大提高脫毒效率。4）培養(yǎng)條件：同一般莖尖培養(yǎng)5）外植體生理狀態(tài)：由活躍生長的芽上切取第25頁,共50頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)缺點：

莖尖越小，去病毒機會越大，脫毒效果就越好，但同時因為其含營養(yǎng)及水量太低，故培養(yǎng)時對培養(yǎng)基的要求就越高，對剝離技術要求也越高。第26頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2、愈傷組織培養(yǎng)脫毒法（1）原理及依據(jù)

a、病毒在植物體內分布不均勻

b、病毒復制的能力衰退或丟失

c、繼代培養(yǎng)的愈傷組織產(chǎn)生抗性變異第29頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（2）技術關鍵誘導再生植株的愈傷組織（3）操作程序植物各種器官或組織誘導產(chǎn)生出愈傷組織，愈傷組織多次繼代，然后從愈傷組織再誘導分化芽，長成植株。愈傷組織培養(yǎng)脫毒法脫毒效果不定，常出現(xiàn)一些變異。第30頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（3）珠心組織培養(yǎng)脫毒法病毒是通過維管組織傳播，而珠心組織和維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，故可以通過珠心組織離體培養(yǎng)獲得無病毒植株。

目前已用該方法去除了柑橘銀屑病、葉脈突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。缺點：會有20%~30%左右的變異率，同時無毒苗苗期較長。柑橘要6~8年才能結果。第31頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共50頁，2024年2月25日，星期天3.微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法

應用微體嫁接的原因： 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根形成植株。具體做法：將極小的莖尖（0.14mm~1.0mm）作為接穗嫁接到不帶病毒的種子實生苗砧木上，然后將砧木、接穗一起在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。優(yōu)點：接穗在砧木上易成活，故可用很小的莖尖來培養(yǎng)，去除病毒幾率大，獲得無病毒苗的可能性大。微嫁接要求的剝離技術高，嫁接成活率與接穗大小呈正相關，而脫毒率與接穗大小呈負相關第33頁,共50頁，2024年2月25日，星期天微體嫁接法(micrografting)脫除病毒的關鍵：①要求剝離技術很高②需要考慮砧木和接穗對營養(yǎng)組成的不同要求；③與接穗的取材季節(jié)有密切關系（蘋果4~6月取材嫁接成活率較高。）第34頁,共50頁，2024年2月25日，星期天四、植物脫毒苗的鑒定1、視覺觀察法(直接檢測法)

看植株的莖葉是否有該病毒所有可見癥狀。番茄無菌小苗厚葉蓮花掌第35頁,共50頁，2024年2月25日，星期天植物病毒的癥狀植物病毒引起植株的癥狀是各異的，在觀賞植物上由病毒引起外部癥狀主要有以下幾種：（1）變色：褪綠、黃化、花葉、斑駁、紅葉等，常見病毒有；香石竹斑駁病毒、黃瓜花葉病毒、芋花葉病毒等。（2）壞死：常見的壞死是病斑或斑點。有輪斑、環(huán)斑、條斑‘條紋等。如香石竹壞死斑點病毒、，鳳仙花壞死斑點病毒草等。（3）畸形：植株可出現(xiàn)矮縮、矮化或葉片皺縮、卷葉、蕨葉等病狀。（4）萎蔫：主要是指植物根或莖的維管束組織受到破壞而發(fā)生供水不足所出現(xiàn)的凋萎現(xiàn)象。第36頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2、生物鑒定法(指示植物indicatingPlant法)

由于采用汁液接種法比較困難，所以通常采用嫁接接種的方法,

利用嫁接法接種，把待測的植物接種在敏感植物上，然后視其有無病斑，來判斷是否脫除了病毒。指示植物接穗嫁接后的植物第37頁,共50頁，2024年2月25日，星期天指示植物indicatingPlant法定義:將一些對病毒敏感、癥狀特征顯著的植物作為指示植物(又叫鑒別寄主),利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法.優(yōu)點:方法簡單\靈敏\準確\擦方便,仍為一種經(jīng)濟有效的方法缺點:枯斑法不能測出病毒總的核蛋白濃度,而只能測出相對的感染力第38頁,共50頁，2024年2月25日，星期天3、電子顯微鏡鑒定法

小于0.1mm的病毒顆粒用電子顯微鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有的病毒粒子存在，還可測量病毒顆粒的大小、形狀和結構。較為先進的方法，但需一定的設備和技術第39頁,共50頁，2024年2月25日，星期天4、抗血清鑒定法

利用抗原與抗體特異反應的特性，用已知病毒的抗血清來鑒定未知病毒的種類，常用的有沉淀反應法、瓊脂擴散法、酶聯(lián)免疫吸附法。其中酶聯(lián)免役吸附反應（ELISA）是常用的一種方法。第40頁,共50頁，2024年2月25日，星期天特點:特異性高\測定速度快很常用抗血清的基本原理是通過植物病毒的抗原與抗體的專化結合,形成可見反應而加以判斷。由于植物病毒抗血清具有高度的?；?受體植物無論顯、隱癥,無論是何種傳播介質,均可通過抗血清反應法準確判斷病毒的存在與否,進行病毒的快速診斷。第41頁,共50頁，2024年2月25日，星期天五、無病毒種苗的保存、應用及繁殖（一）無病毒原種的保存

獲得無毒原種不易，若保存不好會很快重新感染病毒。為防止再度感染，應在隔離條件下保存。若原種保存得好，無毒原種可以利用5-10年，在生產(chǎn)上可以創(chuàng)造更多的經(jīng)濟效益。第42頁,共50頁，2024年2月25日，星期天1、隔離種植保存

通過無毒原種要在隔離區(qū)或隔蟲網(wǎng)室內種植保存。植物病毒的傳播媒介主要是昆蟲如蚜蟲、葉蟬2、離體保存

脫毒苗經(jīng)鑒定后，選擇無病原種株系，回接于試管內，可長期保存，是最理想的保存方法。第