(90)-第十一章 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) -第1.2.3節(jié)

第十一章分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

TechniquesofMolecularBiology

111.1

基因組DNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionofgenomicDNA11.2總RNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionoftotalRNA11.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）Polymerasechainreaction11.4DNA重組技術(shù)DNARecombinanttechnology311.5重組質(zhì)粒DNA的提取與酶切鑒定ExtractionandenzymaticidentificationofrecombinantplasmidDNA11.6外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定InducedexpressionandidentificationofexogenousgenesinE.coli11.1

基因組DNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionofgenomicDNA一、基本原理和應(yīng)用真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組DNA真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)的，因此制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類分離，又要保持DNA分子的完整性制備基因組DNA是開展基因結(jié)構(gòu)和功能研究的基礎(chǔ)5DNA抽提方法酚抽提法CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法異硫氰酸胍法Chelex-100法……6二、主要儀器7三、主要試劑及其作用8試劑作用原理功能SDS(十二烷基磺酸鈉)破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白變性釋放DNA

(fromnucleusandproteins)蛋白酶K降解細(xì)胞膜及核小體中的蛋白R(shí)Nase消化RNA去除組織中的RNAEDTA螯合DNase所需輔助因子的Ca2+保持DNA分子的完整酚/氯仿/異戊醇使蛋白質(zhì)變性去除蛋白質(zhì)乙醇沉淀DNA使DNA從溶液中析出三、實(shí)驗(yàn)步驟（以動(dòng)物組織為例）制備組織勻漿細(xì)胞裂解與蛋白消化酚抽提沉淀DNA洗脫、干燥溶解9核酸電泳檢測樣品制備提取DNA檢測微量分光光度計(jì)測定DNA濃度四、DNA的檢測

定性檢測：核酸電泳檢測10四、DNA的檢測定量檢測：微量核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度11Q1.核酸電泳檢測不到DNAA：1）實(shí)驗(yàn)材料不新鮮，導(dǎo)致DNA降解2）試劑失效3）DNA沉淀洗脫等步驟操作不當(dāng)4）核酸染料未添加Q2.核酸電泳條帶彌散A：1）實(shí)驗(yàn)材料不新鮮，導(dǎo)致DNA降解2）實(shí)驗(yàn)操作動(dòng)作較大，DNA斷裂

3）電泳時(shí)電壓不穩(wěn)12五、常見問題及注意事項(xiàng)Q3.OD260/OD280

比值＜1.8A：提取的過程中發(fā)生蛋白質(zhì)污染Q4.

OD260/OD280

比值>2.0A：提取的過程中發(fā)生有機(jī)溶劑污染13五、常見問題及注意事項(xiàng)傾斜吸取DNA溶液1411.2總RNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionoftotalRNA15一、RNA提取方法及原理

異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）胍鹽/β-巰基乙醇法以及一些其他方法一、提取方法及原理異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）Trizol是一種總RNA抽提試劑，能夠直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍(

Guanidinethiocyante)等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，使RNA與蛋白質(zhì)分離，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA進(jìn)入水相，離心后RNA保留在水相中，DNA和蛋白質(zhì)則在有機(jī)相中，轉(zhuǎn)移水相，加入異丙醇沉淀RNA，得到純化的總RNA。提取RNA是進(jìn)行基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)二、主要試劑17試劑作用原理功能Trizol使蛋白質(zhì)變性，裂解細(xì)胞釋放細(xì)胞中的核酸物質(zhì)氯仿抽提酸性苯酚分離有機(jī)相和無機(jī)相異丙醇通過-OH的疏水作用使得RNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù)沉淀RNA75%乙醇去除鹽分DEPCH2O（diethylpyrocarbonate），焦碳酸二乙酯處理的一級水通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性抑制RNA酶的活性三、實(shí)驗(yàn)步驟（以動(dòng)物組織為例）18組織勻漿化分離階段RNA的沉淀RNA的漂洗RNA的溶解電泳分析總RNAOD值分析總RNA19檢測OD值電泳高質(zhì)量RNA定義:濃度，純度完整度四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析濃度測定樣品在260nm和280nm處的光吸收值，確定RNA的濃度純度OD260/OD280在1.8~2.0視為抽提的RNA純度很高OD260/OD280小于1.8，說明有蛋白或者苯酚污染OD260/OD280大于2.0，可能被異硫氰酸胍污染20四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析RNA電泳普通瓊脂糖凝膠電泳：可分開不同的RNA條帶，能快速檢測所提RNA的完整度，但是無法判定其分子量變性瓊脂糖凝膠電泳:可判定RNA的完整度，也能測定RNA的分子量21五、注意事項(xiàng)及有效措施RNA易降解、RNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在1）、嚴(yán)格戴好口罩，手套

2）、實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。

3）、實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，必須確保RNase-Free4）、實(shí)驗(yàn)全過程在低溫環(huán)境下操作

222311.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）Polymerasechainreaction24

1985年KaryMullis創(chuàng)立了PCR技術(shù)1987年完成了自動(dòng)化操作裝置1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

一、PCR技術(shù)的來源聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTPs為底物，按照半保留復(fù)制原理，通過變性、退火、延伸三個(gè)步驟不斷重復(fù)完成新DNA合成。25二、PCR技術(shù)的原理26科學(xué)研究Scientificresearch疾病診斷Diseasediagnosis人類基因組工程HumanGenomeProject法醫(yī)Forensic腫瘤Thetumor檢疫Quarantine其他……

other...27三、PCR技術(shù)的應(yīng)用四、PCR反應(yīng)系統(tǒng)DNA模板DNATemplate引物primer脫氧核糖核苷三磷酸

deoxy-ribonucleosidetriphosphateTaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase緩沖液buffer28DNA模板DNATemplate單、雙鏈DNA模板RNA模板，需先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA質(zhì)粒模板高分子量的DNA（如基因組DNA）模板DNA模板的用量，應(yīng)用ng級的DNA樣本29引物primer兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段決定PCR擴(kuò)增片段長度、位置和結(jié)果30堿基互補(bǔ)配對原則引物的最佳長度為20～24個(gè)核苷酸兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，避免產(chǎn)生“引物二聚體”兩條引物的(G+C）%含量組成應(yīng)均勻引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級結(jié)構(gòu)31引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)是指引物和模板結(jié)合時(shí)候的溫度參數(shù)引物的退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量合理的退火溫度從55℃到70℃32引物退火溫度Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)引物設(shè)計(jì)常用軟件33單機(jī)版軟件：PrimerPremier系列、Oligo系列、Omiga、DNastar在線軟件：Primer-Blast、Primer3脫氧核糖核苷三磷酸

deoxy-ribonucleosidetriphosphatedNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率密切相關(guān)常用的濃度為50～200μM，不能低于10～15μM四種dNTP的濃度應(yīng)相同34TaqDNA聚合酶

TaqDNApolymerase最早來自于嗜熱水生菌催化PCR反應(yīng)常用的分為rTaq酶和LTaq酶兩類35PCR緩沖液PCRbuffer10～50mM的Tris–HCl緩沖液（pH8.3）+1.5mMMgCl二價(jià)陽離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量Mg2+過量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Mg2+不足易使產(chǎn)量降低Mg2+其濃度變化范圍為1～10mmol/L36PCR循環(huán)次數(shù)37一般為25～40個(gè)循環(huán)循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重循環(huán)次數(shù)太少，產(chǎn)率偏低38五、PCR反應(yīng)體系及步驟PCRMixtur：TemplateDNA1

l(10ng)Primer11

l(10M)Primer21

l(10M)dNTPs2

l(10mMeach)TaqDNApolymerase0.5

l(5U/l)10×buffer2.5

lddH2O17

lTotal25

l將PCR反應(yīng)