結核病診斷技術

第2章實驗室檢驗技術

結核病實驗室檢查，特別是細菌學檢查是結核病確診和治療的主要依據(jù)。結核病細菌學檢驗主要包括4項基本技術，即涂片染色鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)、分枝桿菌藥物敏感性試驗、分枝桿菌菌種鑒定。檢驗人員應依據(jù)臨床醫(yī)師檢驗申請要求并結合實驗室的設備和技術條件，負責對標本進行檢驗，及時、準確地填寫檢驗報告。

近年來，國內、外研究者在分子生物學、分子微生物學及免疫學領域建立了若干快速、敏感、特異的檢測新技術，為可疑結核病患者的早期診斷與合理治療帶來了新的希望。列入“規(guī)范”的結核桿菌臨床基因擴增(PCR)檢驗技術、分枝桿菌快速培養(yǎng)及藥物敏感性試驗技術、免疫學檢測技術，因有多種試劑盒(試劑)及分析儀器可供選擇，目前尚難制定統(tǒng)一的技術操作規(guī)范，故暫定為輔助操作技術。具備開展這些技術項目條件的實驗室(或檢驗科)，須經(jīng)有關主管部門批準后，嚴格按照相應技術所附的說明書與操作規(guī)程實施。

鑒于結核病實驗室檢查，特別是細菌學檢查在結核病控制工作中的重要性，為保障相應檢查項目結果的可靠性，要求相應的檢查項目必須由經(jīng)過培訓并考核合格的專職人員完成，且開展相應檢查的實驗室應具備安全操作設施，制定實驗室內部質量控制措施，同時接受專業(yè)結核病實驗室的質量控制督導和培訓。第一節(jié)結核茵檢驗實驗室安全操作規(guī)則

結核病細菌學實驗室必須具有與其服務級別相應的裝備，其原則是能滿足該級別實驗室的需要，使實驗室工作人員得到充分的防護，并避免造成環(huán)境污染。

1．實驗室應有合理布局及合適的單向(外排)通風體系。

2．實驗室應配備相應的防護設備，以保護工作人員的安全和實驗工作的順利進行。分離培養(yǎng)、藥物敏感性測定、菌種鑒定試驗等操作應設有生物安全操作柜或接種間和通風櫥等。

3．實驗室工作人員應按正確方式進行技術操作，穿戴隔離衣、口罩和帽子等。

4．實驗室所有帶毒廢棄物應滅菌及無害化處理。

5．建立清潔消毒制度，限制非工作人員進入室內，禁止在實驗室飲食和吸煙等。

6．進行下列操作時應嚴格按照技術操作規(guī)范，防止產(chǎn)生細菌氣溶膠：①涂片制作；②培養(yǎng)液的傾倒和轉移；③高速混合含菌液體；④滴加、接種培養(yǎng)物；⑤吸管稀釋和混合菌懸液；⑥取樣器和振蕩器的使用；⑦細菌細胞超聲粉碎；⑧感染動物實驗等。第二節(jié)標本的采集、運送和保存

初診患者應送3份痰標本(夜間痰、清晨痰和即時痰)。如無夜間痰，在留取清晨痰后2～3h再留取1份痰標本，或在送檢時，留取2份即時痰。療程中或復診隨訪患者按期每次送檢2份痰(清晨痰和夜間痰)。一、痰標本的采集

1．即時痰為病人就診時咳出的痰液；清晨痰為就診當天清晨深咳出的痰液；夜間痰為就診前夜咳出的痰液。合格的痰標本應是膿樣、干酪樣或膿性黏液樣痰液，痰量應為3～5ml。

2．痰標本應由檢驗人員或經(jīng)培訓合格的專人驗收，痰液不合格者，要求重新送檢。難以獲得合格標本時，也應進行細菌學檢查，但應注明標本性狀，以便分析結果時參考。

3．留取痰標本的容器應為廣口、直徑4cm、高2cm、有蓋密閉的塑料盒或蠟紙盒，容器上應注明患者姓名、編號(門診序號或患者登記號)及送檢日期。二、痰標本的保存和運送

留取痰標本后，應將容器密封，切勿倒置，嚴防痰液外溢。需外送檢查的標本應認真核對痰盒上的標注是否正確清晰，是否與檢驗單一致，痰容器應采用專用的冰盒，或以紙張和塑料袋封裝、扎牢，順序放置于包裝袋內，注明盒蓋向上的標示，嚴防運送途中倒置。當天不能檢查的痰標本須置4℃冰箱保存。三、其他標本的采集、運送和保存

1．尿液及胸、腹水標本留全量夜尿或胸、腹水，靜置4～5h后，棄上清液，取沉淀部分至少10ml送檢。

2．大便、膿液、病灶組織或干酪塊、腦脊液標本應至少留取或采集2～3ml(g)，采集后立即送檢。

3．標本運送和保存可參考本節(jié)痰標本的保存和運送。第三節(jié)涂片檢查法一、玻片的準備

取經(jīng)95％乙醇擦拭脫脂的干燥、清潔、無油污、無劃痕的新玻片，于玻片背面的左端1／3處用玻璃筆編號。一張玻片只能涂抹一份痰標本，每張玻片只能使用1次，不得清洗后再次用于抗酸染色檢查。六、廢棄標本和污染物的處理

痰盒和廢棄標本等污染物，均須經(jīng)高壓蒸汽滅菌后才能丟棄或清洗，嚴禁不經(jīng)滅菌隨意處理。

痰盒等污染物如采用焚燒處理，須置于焚燒爐內徹底焚化。焚燒不徹底或暴露焚燒是有害的。

痰檢工作面的消毒：可將痰標本置于一搪瓷盤中，在操作櫥內進行痰涂片操作。操作完畢后將盤與廢棄物一并進行高壓蒸汽滅菌，或與操作臺面同時以3％苯酚(石炭酸)或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外線滅菌燈(距離≤1．2m)照射30min。

附錄1：萋-尼氏染色試劑的配制

1．8％苯酚復紅染色劑堿性復紅乙醇貯存液(堿性復紅8g，溶于95％乙醇100m1中)10ml，加5％苯酚水溶液至100ml，混勻。

2．5％鹽酸乙醇脫色劑濃鹽酸5ml加95％乙醇至100ml，混勻。

3．0．3‰亞甲藍復染劑亞甲藍0．3g加95％乙醇50ml待溶解后，加蒸餾水至100ml，混勻，即為貯存母液，使用時10倍稀釋。

附錄2：熒光染色試劑的配制

1．1％金胺“O”染色液金胺“O"0．1g溶于95％乙醇10ml內，加5％苯酚至100ml，混勻。

2．3％鹽酸乙醇脫色液濃鹽酸3ml加95％乙醇至100ml，混勻。

3．0．5％高錳酸鉀復染液0．5g高錳酸鉀加蒸餾水至100ml，混勻。第四節(jié)分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法

分枝桿菌屬(Mycobacterium)迄今報道有100多個種?！恫芟到y(tǒng)細菌學手冊》將分枝桿菌菌種劃分為兩大類：緩慢生長分枝桿菌與快速生長分枝桿菌。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，接種很稀的新鮮培養(yǎng)物，在適宜培養(yǎng)溫度下。7d以上肉眼可見單個菌落，稱為緩慢生長分枝桿菌，其代表菌種是結核分枝桿菌(M．tuberculo—sis)。在上述條件下，7d以內肉眼可見單個菌落，稱為快速生長分枝桿菌。分枝桿菌屬，除結核分枝桿菌復合群(結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)及麻風分枝桿菌外，余者統(tǒng)稱為非結核分枝桿菌(NontuberculosisMyco—bacteria，NTM)。

結核分枝桿菌是專性需氧菌，最適生長溫度為37℃，最適pH為6．5～7．2。對營養(yǎng)要求較高，專嗜甘油作為碳源，天門冬酰胺是最好氮源。

分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法，是結核病確診最可靠的方法。是獲得純培養(yǎng)物進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗以及其他生物學研究的基礎。一、培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基采用酸性改良羅氏培養(yǎng)基。

(一)成分

谷氨酸鈉(純度99％以上)

7．2g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

14．0g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0．24g

檸檬酸鎂

0．6g

丙三醇

12ml

馬鈴薯淀粉

30g

蒸餾水

600ml

新鮮全卵液

1000ml

2％孔雀綠水溶液

20ml

注1：無機鹽試劑應采用化學純(CP)以上等級的試劑。

注2：WHO在“結核病控制實驗室工作手冊(1998)”中建議分離培養(yǎng)使用無淀粉的改良羅氏培養(yǎng)基。

(二)制備方法

1．基礎液制備量取蒸餾水600ml，加入各無機鹽成分、谷氨酸鈉和丙三醇，溶解后加馬鈴薯淀粉，混勻，沸水浴1h使呈糊狀(不時搖動，防凝塊)，冷卻。

2．新鮮雞卵液制備洗凈新鮮雞卵表面，浸泡在70％乙醇或其他稀釋消毒液中20～30min。取出，拭干，開口，收集雞卵液，攪勻。通過消毒的紗布過濾成雞卵液。

3．培養(yǎng)基制備將600ml基礎液和1000ml新鮮雞卵液混勻。加入2％孔雀綠水溶液20ml，混勻，靜置1h后，分裝至標準螺旋蓋培養(yǎng)管或滅菌中試管中，每管7ml。雙層放置于擱架中，經(jīng)培養(yǎng)基蒸汽凝固滅菌器85℃凝固滅菌50min。培養(yǎng)基斜面應占試管的2／3。制成的培養(yǎng)基應斜面鮮艷，表面光滑，有一定韌性和酸堿緩沖能力。

4．培養(yǎng)基保存制成的培養(yǎng)基經(jīng)37℃無菌試驗24h，檢查培養(yǎng)基污染情況后置4℃避光保存，1個月內使用。二、去污染處理

(一)痰標本

視標本性狀，加1～2倍體積4％氫氧化鈉(NaOH)消化液于痰瓶中，擰緊螺旋蓋，渦旋振蕩器上振蕩1min，使痰液充分勻化，室溫放置。自加入氫氧化鈉消化液起，整個處理時間應在15～20min。樣本份數(shù)較多時，應分批處理。

(二)其他標本

1．膿液采用4％硫酸(H2SO4)處理。標本與4％硫酸(H2SO4)以1：3混勻后，靜置25min(其間振蕩數(shù)次)，按無菌手續(xù)接種0．1ml經(jīng)處理的標本至L—J培養(yǎng)基，每份標本接種2支培養(yǎng)基。酸處理去污染時間不超過25min。

2．病理組織或干酪塊標本切碎后置于無菌組織研磨器，加入適量(0．5～1容積)生理鹽水后充分研磨成混懸液；混懸液經(jīng)3000r／min離心30min后，沉淀物進行堿處理[與2～4倍量2％氫氧化鈉(NaOH)混合，處理15min]后接種。

3．尿液留全量夜尿，靜置4～5h，取沉淀部分約10ml，3000r／min離心30min，取沉淀進行堿處理[與等倍量4％硫酸(H2SO4)混合，處理15min]后接種。

4．胸、腹水、支氣管灌洗液標本參照痰標本處理方法。

5．腦脊液無菌操作收集的腦脊液，置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后將薄膜接種到L—J培養(yǎng)基；或將腦脊液在無菌操作環(huán)境中3000r／min離心30min，取沉淀直接接種到L-J培養(yǎng)基。非無菌操作采集的腦脊液標本，離心后的沉淀進行堿處理[與等倍量4％氫氧化鈉(NaOH)混合，處理10～15min]后接種于酸性L-J培養(yǎng)基。

6．糞便標本與生理鹽水混合后，充分振蕩使之成為混懸液；定性濾紙過濾后，濾液經(jīng)3000r／min離心10min；沉淀進行酸處理[與2～4倍量的4％硫酸(H2SO4)混合，處理15～20min)后接種L-J培養(yǎng)基。

7．咽喉棉拭子將棉拭子放入一無菌試管，加入適量生理鹽水浸泡，加入等體積4％氫氧化鈉(NaOH)后強烈振蕩，靜置15min后接種。三、接種和培養(yǎng)

用吸管取去污染后的標本0．1ml，均勻接種在整個培養(yǎng)基斜面，每份標本接種2支酸性羅氏培養(yǎng)基。接種后斜面向上于37℃環(huán)境中平放24h后，檢查培養(yǎng)基污染情況，擰緊瓶蓋，直立放置，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。四、結果報告

1．接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實后，可報告快速生長分枝桿菌陽性。此后每周觀察1次，記錄菌落生長及污染情況。陽性生長物經(jīng)抗酸染色證實后，可報告分枝桿菌生長。滿8周后未見菌落生長者方可報告培養(yǎng)陰性結果。

2．觀察時發(fā)現(xiàn)非分枝桿菌生長時，應報告污染。培養(yǎng)污染率應在2％～5％范圍內。污染率過高，提示培養(yǎng)基滅菌不佳，標本前處理、接種等環(huán)節(jié)有誤，應當分析原因，采取相應措施。

3．培養(yǎng)結果報告方式

(1)分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長，以“培養(yǎng)陰性”報告，不可以“一”表示。

(2)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(1+)：菌落生長占斜面面積的1／4。

(3)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(2+)：菌落生長占斜面面積的1／2。

(4)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(3+)：菌落生長占斜面面積的3／4。

(5)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(4+)：菌落生長布滿整個斜面。

(6)報實際菌落數(shù)：菌落生長不足斜面面積1／4。第五節(jié)分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查

分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查是使用分枝桿菌快速培養(yǎng)儀，通過測定細菌生長代謝檢測分枝桿菌生長情況的方法。由于應用營養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基，并且檢測儀能連續(xù)監(jiān)測，故提高了從標本中分離分枝桿菌的敏感性進而縮短報告結果的時間。為保證檢查方法的可靠性，目前分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查系統(tǒng)除提供相應儀器、試劑以外，均根據(jù)不同系統(tǒng)制定了相應的臨床標本前處理、接種、檢測和報告結果的規(guī)程，故在進行相應的檢查時，結果的可重復性和可比性均能得到認可。

在進行分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查時，標本接種前的去污染處理，必須嚴格按照系統(tǒng)說明書中規(guī)定的方法進行。孵育檢測過程中系統(tǒng)報告陽性時，相應標本的培養(yǎng)液必須首先進行抗酸染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)抗酸菌后方可發(fā)出陽性報告。第六節(jié)分枝桿菌藥物敏感性測定法一、培養(yǎng)基

(一)基礎培養(yǎng)基

無淀粉改良羅氏培養(yǎng)基：

谷氨酸鈉(純度99％以上)

7．2g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

2．4g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0．24g

檸檬酸鎂

0．6g

丙三醇

12ml

蒸餾水

600ml

新鮮全卵液

1000ml

2％孔雀綠水溶液

20ml

注：無機鹽試劑應達到化學純(CP)以上等級。

(二)抗結核藥物溶液的配制和稀釋

1．藥敏試驗用抗結核藥物應從廠家取得純品，并確認純度和效價，在有效期內使用。

2．異煙肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TBl)、乙硫異煙胺(TH)、環(huán)絲氨酸(SC)的生物效價按其重量單位計算，計算用藥量時只需考慮其純度。鏈霉素硫酸鹽(SM—SO4)、乙胺丁醇鹽酸鹽(EMB—C1)、卡那霉素硫酸鹽(KM—SO4)、卷曲霉素硫酸鹽(CPM—SO4)、紫霉素硫酸鹽(VM—SO4)、對氨水楊酸鈉鹽(PAS-Na)等在考慮其純度的同時，應按生產(chǎn)廠家標定的毫克效價計算其鹽型藥用量。

3．加入培養(yǎng)基中實際藥量的計算可參考下列公式：

上述公式中各變量的單位：

實際藥量：mg

效價：％

培養(yǎng)基內藥物終濃度：μg／ml

純度：％

需制備培養(yǎng)基體積：ml

4．絕對濃度法每種藥物按表2-1制成高濃度藥液，再按相應比例稀釋成低濃度藥液。

5．比例法按表2-2所述濃度制備藥物儲存液，分裝至無菌試管，每管5～10ml，封口，一20℃保存，3個月內使用。

6．除RFP、TBl、TH用二甲基甲酰胺溶解，再用滅菌蒸餾水稀釋外，其他藥物可用滅菌蒸餾水溶解、稀釋。

(三)含藥培養(yǎng)基制備

1．每100ml基礎培養(yǎng)基加入1ml配制、稀釋好的抗結核藥液，混勻，無菌分裝每管7ml，85℃凝固50min。

2．制成的培養(yǎng)基37℃無菌試驗24h，檢查培養(yǎng)基污染情況后置4℃避光保存，1個月內使用。二、藥敏試驗方法

(一)絕對濃度法間接法

1．菌懸液制備

(1)臨床分離分枝桿菌的新鮮培養(yǎng)物(初生長2周)無須二次傳代即可做藥敏試驗，初生長2周以后和貯存培養(yǎng)物須在改良羅氏培養(yǎng)基上二次傳代，取2～3周的亞培養(yǎng)物進行試驗。

(2)取上述培養(yǎng)物(須刮取斜面各個部分的培養(yǎng)物)置于玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻動使呈乳酪樣，以0．5％聚山梨醇-80(吐溫-80)生理鹽水磨菌稀釋，與標準麥氏比濁管(MacFarlandNo．1)比濁，即配成1mg／ml的菌懸液。

2．接種將1mg／ml的菌懸液10倍稀釋至0．01mg／ml(10^-2mg／ml)，以滅菌吸管準確吸取菌液0．1m1分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為1O^-3mg。置37℃培養(yǎng)，4周后觀察結果。

3．結果報告按下列方式報告對照及含藥培養(yǎng)基上菌落生長情況。

(1)分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長。

(2)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(1+)：菌落生長占斜面面積的1／4。

(3)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(2+)：菌落生長占斜面面積的1／2。

(4)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(3+)：菌落生長占斜面面積的3／4。

(5)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(4+)：菌落生長布滿整個斜面。

(6)報告菌落數(shù)：培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)少于20個時。

4．質量控制

每批試驗應以結核分枝桿菌參考菌株(H37Rv敏感株)10^-3mg檢測含藥培養(yǎng)基質量。接種10^-3mg要求對照培養(yǎng)基菌落數(shù)在200個以上且無融合，若菌落數(shù)低于50個時，要求重新做藥敏試驗。

(二)比例法

1．茵懸液制備同絕對濃度法。

2．稀釋、接種和培養(yǎng)

(1)菌液稀釋：靜置片刻，使菌液中的顆?；蚓鷫K沉淀后，用刻度吸管或22號標準接種環(huán)將1mg／ml的菌液上清逐步稀釋至0．01mg／ml和0．1mg／ml。

①22號接種環(huán)100倍稀釋法：用22號標準接種環(huán)沾取2滿環(huán)1mg／ml的菌液，移至2ml滅菌生理鹽水中，即稀釋成0．01mg／ml菌液；用同樣方法再進行100倍稀釋，即成10^-4mg／ml菌液(注：22號標準接種環(huán)：金屬絲直徑O．7mm，接種環(huán)內徑3mm，1滿環(huán)移液0．01m1)。

②微量吸管10倍稀釋法：用無菌微量刻度吸管吸取0．5ml上述1mg／ml菌懸液至4．5ml的滅菌生理鹽水[可加入0．5％聚山梨醇-80(吐溫一80)]中，即可得到0.mg／ml菌液。按上述方法連續(xù)進行10倍稀釋，可得到0．01rag／ml和0．1mg／ml的菌液。

(2)接種：用22號標準接種環(huán)分別沾取1環(huán)(即0．01m1)0．01mg／ml和0．1mg／ml的菌液，用劃線法均勻接種至對照及含藥培養(yǎng)基表面，應注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面。最終接種菌量為10^-4mg和10^-6mg。

(3)培養(yǎng)：接種后的培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，4周后報告結果。

3．結果報告及解釋

(1)按以下方式記錄菌落生長情況。

①少于50個菌落：

實際菌落數(shù)

②50～100個菌落：

1+

③100～200個菌落：

2+

④大部分融合(200～500個菌落)：

3+

⑤融合(大于500個菌落)：

4+

(2)計算耐藥百分比：

若耐藥百分比大于1％，則認為受試菌對該抗結核藥耐藥。

4．質量控制

(1)若高稀釋度菌液(10^-4mg／ml)在對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個菌落，則應從對照管傳代培養(yǎng)，重復試驗。

(2)每批試驗以結核分支桿菌參考菌株(H37Rv敏感株)10^-3mg檢測含藥培養(yǎng)基的質量。

附錄3：麥氏1號比濁管的制備

0．1m11％氯化鋇(BaCl3)加入9．9ml1％硫酸(H2SO4)，封口，比濁前搖勻。第七節(jié)分枝桿茵菌種鑒定一、分枝桿菌微生物學概述

目前報道的分枝桿菌種類已有100余種。在微生物分類中，分枝桿菌屬于放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。

在結核病流行病學研究和臨床診斷檢驗中，通常將分枝桿菌分為結核分枝桿菌復合群(TBcomplex)和非結核分枝桿菌(nontuberculosismycobacteria，NTM)。結核分枝桿菌復合群包括四種分枝桿菌：結核分枝桿菌(M．tuberculo—sis)，牛分枝桿菌(M．bovis)，非洲分枝桿菌(M．a(chǎn)fricahum)和田鼠分枝桿菌(M-microti)。臨床上最常見的是結核分枝桿菌和牛分枝桿菌。

根據(jù)“伯杰細菌鑒定手冊”(Bergeymanualofdeterminativebacteriology，9^the-dition)，將分枝桿菌菌種分為兩大類：一是在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基內，在適宜的溫度條件下，接種很少的細菌分離物，孵育7d以內肉眼可見單個菌落者為快速生長分枝桿菌；超過7d的則為緩慢生長分枝桿菌。緩慢生長分枝桿菌根據(jù)其色素產(chǎn)生的情況，又進一步分為光產(chǎn)色、暗產(chǎn)色和不產(chǎn)色三組。二、分枝桿菌菌種鑒定的實驗流程

經(jīng)抗酸染色鏡檢確定為抗酸菌的培養(yǎng)陽性菌株，必須首先接種改良羅氏(L—J)培養(yǎng)基進行增菌傳代。

進行分枝桿菌菌種鑒定，首先經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗、28℃生長試驗、耐熱觸酶試驗、觀察記錄細菌的生長速度、菌落形態(tài)和菌落顏色等來確定該菌株為結核分枝桿菌復合群或非結核分枝桿菌。

經(jīng)菌群鑒定試驗確定屬于結核分枝桿菌復合群的菌株，再進行噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長試驗、硝酸還原試驗和煙酸試驗進行菌種鑒定。

屬于NTM的菌株，首先根據(jù)生長速度確定屬于快速生長還是緩慢生長的分枝桿菌?？焖偕L的分枝桿菌可通過生長特征和生化實驗進行菌種鑒定；緩慢生長的分枝桿菌經(jīng)色素產(chǎn)生試驗確定菌株的產(chǎn)色特征后，再通過生長特征和生化試驗確定菌株的種類。

分枝桿菌菌種(菌群)鑒定試驗流程參見圖2—1。三、分枝桿菌菌群鑒定試驗

分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結核分枝桿菌復合群還是非結核分枝桿菌，也是進行進一步菌種鑒定的基礎。

分枝桿菌菌群主要通過菌株在含對硝基苯甲酸(PNB)的鑒別培養(yǎng)基上的生長情況、28℃生長情況、生長速度、耐熱觸酶試驗及觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色等生物特征來進行區(qū)分。通過上述試驗，可將需要鑒定的菌株劃歸結核分枝桿菌復合群或非結核分枝桿菌菌群。

(一)對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗

結核分枝桿菌復合群在含有PNB的培養(yǎng)基中生長受到抑制；大多數(shù)NTM菌種對一定濃度的PNB有耐受性。

培養(yǎng)基：PNB培養(yǎng)基(含PNB500μg／ml的L-J培養(yǎng)基)1支，L-J培養(yǎng)基1支。

試驗方法：每支培養(yǎng)基接種10^-3mg細菌；37℃孵育，每周觀察1次結果，同時記錄PNB培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基上菌落生長情況直至孵育4周?？焖偕L的非結核分枝桿菌1周左右可見菌落；緩慢生長的分枝桿菌4周報告結果。結核分枝桿菌復合群在．PNB培養(yǎng)基上不生長。

陽性對照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)

陰性對照菌株：H37Rv。

(二)28℃生長試驗

結核分枝桿菌復合群在28℃的孵育環(huán)境中不能生長；而TNM菌群的大部分分枝桿菌可以生長。

培養(yǎng)基：2支L-J培養(yǎng)基。

試驗方法：每支L-J培養(yǎng)基接種10^-3mg細菌；1支置于28℃、1支置于37℃孵育，每周觀察1次結果，同時記錄羅氏培養(yǎng)基上菌落生長情況直至孵育4周。快速生長的非結核分枝桿菌1周左右可見菌落；緩慢生長的分枝桿菌4周報告結果。結核分枝桿菌復合群在28℃不生長。

陽性對照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

陰性對照菌株：H37Rv。

(三)耐熱觸酶試驗

多數(shù)NTM經(jīng)68℃處理一定時間后，其過氧化氫酶仍保持活性，可分解過氧化氫。

試劑：A．pH=7．0、0．0667mol／L(1／15M)PBS(無菌)

B．30％H2O2(過氧化氫)

C．10％聚山梨醇-80(Tween-80)水溶液(121℃滅菌10min，4℃保存，2周內使用)

試驗方法：取在L-J培養(yǎng)基上生長旺盛的細菌約5mg，在裝有1．5ml試劑A的試管中研磨成菌懸液；放于68℃水浴20min，取出后立即冷卻；緩緩加入等量混合的B、C(使用前配制)反應液0．5ml。

結果判定：有持續(xù)小氣泡產(chǎn)生的為陽性；10～20min．仍無氣泡產(chǎn)生的為陰性；空白試劑對照無氣泡產(chǎn)生。

陽性對照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

陰性對照菌株：H37Rv。

空白對照：pH=7．0、0．0667mol／L(1／15M)PBS(無菌)。四、結核分枝桿菌復合群菌種鑒定試驗

結核分枝桿菌和牛分枝桿菌占結核分枝桿菌菌群的絕大多數(shù)。這兩種分枝桿菌，須同時采用下列實驗進行鑒別。

(一)噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長

一定濃度的TCH對牛分枝桿菌和小部分結核分枝桿菌有抑制生長的作用；而對大部分結核分枝桿菌無抑制作用。

培養(yǎng)基：TCH培養(yǎng)基(含5μg／mlTCH的羅氏培養(yǎng)基)1支，羅氏(L-J)培養(yǎng)基1支。

試驗方法：每支培養(yǎng)基接種10^-3mg細菌；37℃孵育4周時觀察結果，同時記錄TCH培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基上菌落生長情況。大部分結核分枝桿菌TCH培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基上菌落的生長情況相同；牛分枝桿菌在羅氏培養(yǎng)基生長良好，在TCH培養(yǎng)基上生長受到抑制。

陽性對照菌株：H37Rv。

陰性對照菌株：牛分枝桿菌(M．bovis)。

(二)硝酸還原試驗

結核分枝桿菌和部分NTM能夠產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；在酸性條件下，亞硝酸鹽與氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二胺鹽酸鹽形成紅色偶氮化合物。牛分枝桿菌和部分NTM因不能產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，故該實驗陰性。因此本實驗可用于結核分枝桿菌與牛分枝桿菌的鑒別。

試劑：A．硝酸鹽溶液[NaNO3(0．085g)]溶100mlPBS[pH7．0、0．0667mol／L(1／15M)]

內，121℃滅菌20min，每管分裝2ml。

B．35％的濃鹽酸等倍稀釋。

C．0．2％氨基苯磺胺水溶液(4℃保存，4周內使用)。

D．0．1％N一甲萘基乙烯二胺鹽酸鹽水溶液(4℃可保存4周)。

E．鋅粉：0．1g。

試驗方法：刮取4周菌齡、L-J培養(yǎng)基上生長旺盛的菌落約5mg，置于裝有2m1試劑A的試管中充分研磨并混勻，37℃水浴2h后取出。加入試劑B1滴、試劑C、D各2滴；混勻。

結果判定：1min內呈紅色為陽性；試劑混勻后1min內顏色無變化，加入0．1g鋅粉混勻觀察5min，顏色仍無變化者為強陽性，出現(xiàn)紅色或淡紅色者為真陰性；空白對照從無色變?yōu)榧t色。

陽性對照菌株：H37Rv。

陰性對照菌株：牛分枝桿菌(M．bovis)。

空白對照：pH一7．0，滅菌的0．0667mol／L(1／15M)PBS。

(三)煙酸試驗

由于結核分枝桿菌缺乏煙酸酶，故不能分解代謝過程中產(chǎn)生的煙酸。在培養(yǎng)基中，結核分枝桿菌生長時的煙酸聚集量較牛分枝桿菌及其他分枝桿菌高。煙酸吡啶核環(huán)的氮與聯(lián)苯胺及溴化氰作用后，呈現(xiàn)桃紅色或紅色沉淀反應。但應注意，對INH高度耐藥的結核分枝桿菌可能此實驗亦為陰性，應結合硝酸還原實驗結果判定。

試劑：A．3％聯(lián)苯胺乙醇溶液。

B．10％溴化氰溶液(劇毒!在通風櫥內配制)。

(注：上述試劑必須存放于褐色試劑瓶中，瓶口密封，4℃可保存2周。溴化氰溶液如發(fā)生沉淀，應在室溫下溶解后使用。)

實驗方法：取在羅氏培養(yǎng)基孵育4周且生長旺盛的一支培養(yǎng)管，將菌落用無菌吸管刮到培養(yǎng)基斜面一邊，在暴露出的培養(yǎng)基斜面上加入2ml沸水，振蕩數(shù)次后，將培養(yǎng)基平放在37℃孵箱中孵育30min(應注意使蒸餾水鋪滿斜面)。取浸提液0．8ml平分到2支試管中，各加入0．1ml試劑A，混勻后向其中一支試管中加入0．1ml試劑B，觀察顏色變化。

結果判定：加人兩種試劑的試管內菌液呈現(xiàn)紅色或桃紅色沉淀為陽性*；白色沉淀為陰性；空白試劑對照不變色。結果觀察完畢后，加入4％NaOH溶液，加塞混勻后放置24小時后方可消除溴化氰的毒性。

陽性對照菌株：H37Rv*。

陰性對照菌株：牛分枝桿菌(M．boris)。

空白對照：生理鹽水。

*由于煙酸含量在2g以上才出現(xiàn)陽性結果，故培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)一般必須在50個以上，否則可能出現(xiàn)假陰性結果。

結核分枝桿菌與NTM的鑒別見表2-3。

由于臨床分離的菌株生物特性不穩(wěn)定，故對結核分枝桿菌菌群的菌株進行菌種鑒定時應至少同時使用上述三種鑒定實驗中的兩種，以便對結果進行綜合判定。五、NTM菌群生長特征鑒定試驗

經(jīng)菌群鑒定試驗被劃歸為NTM菌群的分枝桿菌，如需要進一步進行菌種鑒定，應首先進行生長特征鑒定試驗。相關試驗主要目的是觀察分枝桿菌的生長速度、色素產(chǎn)生情況、菌落形態(tài)特征、在各種鑒別培養(yǎng)基上生長情況等。

(一)生長速度

傳代培養(yǎng)4周菌齡的NTM菌株，制備菌懸液并進行稀釋；接種2支L-J培養(yǎng)基(10^-3mg／支)后，分別置于28℃、37℃孵育；在第3、7天觀察結果，以后每周觀察1次。1周內生長菌落的為快速生長NTM；反之則為緩慢生長NTM。

緩慢生長NTM對照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)。

快速生長NTM對照菌株：草分枝桿菌(M．phlei)。

(二)色素產(chǎn)生

傳代培養(yǎng)4周菌齡的NTM菌株，制備菌懸液并進行稀釋；接種4支L-J培養(yǎng)基(10^-3mg／支)后，2支培養(yǎng)基以錫紙或黑紙包裹密封，另2支不包。將兩支培養(yǎng)基(1支包紙和1支不包紙)置于37℃培養(yǎng)，另2支置于28℃培養(yǎng)。不包紙的培養(yǎng)基長出菌落時，打開2支包紙的培養(yǎng)管觀察：有色素產(chǎn)生為暗產(chǎn)色菌；無色素產(chǎn)生者，放松膠塞進行通氣，同時以100W鎢燈近距離(燈與試管的距離≤50cm)照射3h，放置于原溫度孵育3d，每日觀察1次，產(chǎn)生色素者為光產(chǎn)色菌；不論光照與否，菌落均無色素產(chǎn)生者為不產(chǎn)色菌。

光產(chǎn)色對照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

暗產(chǎn)色對照菌株：戈登分枝桿菌(M．gordonae)。

不產(chǎn)色對照菌株：胞內分枝桿菌(M．intracellulare)。

產(chǎn)色情況隨培養(yǎng)溫度變化的菌株：蘇加分枝桿菌(M．szulgai)。

(三)苦昧酸培養(yǎng)基生長試驗

培養(yǎng)基成分：谷氨酸鈉(0．4g)、枸櫞酸鈉(0．2g)、KH2P04(O．05g)、苦味酸(O．2g)、MgSO4·7H20(0．05g)和丙三醇(3m1)，溶解于97ml蒸餾水；以10％氫氧化鈉(NaOH)調pH至7．0～7．2，加瓊脂3g，121℃20min滅菌，分裝試管制成斜面使用。

試驗方法：接種0．1mg細菌至培養(yǎng)基斜面，37℃孵育2周。有菌落生長者為快速生長菌。龜分枝桿菌不生長；膿腫分枝桿菌生長，二者可依此實驗初步鑒別。

(四)5％氯化鈉(NaCI)培養(yǎng)基生長試驗

培養(yǎng)基成分：羅氏培養(yǎng)基中按5％(W／V)加入氯化鈉(NaCI)。

試驗方法：接種10^-3mg細菌，37℃培養(yǎng)；每周觀察1次至4周。L-J培養(yǎng)基作為對照管。對照管及試驗管均生長則為陽性；反之為陰性?？焖偕L菌不產(chǎn)色菌中龜分枝桿菌為陰性。

(五)谷氨酸鈉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基生長試驗

培養(yǎng)基成分：谷氨酸鈉O．4g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O．05g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0．05g，溶于90ml蒸餾水，以10％氫氧化鈉(NaOH)調pH至7．O～7．2，然后加蒸餾水至100ml，再加瓊脂3g，121℃滅菌20min，按1％比例加入葡萄糖(注意無菌操作)，分裝試管制成斜面。

試驗方法：接種O．1mg細菌(以羅氏培養(yǎng)基為對照)，37℃培養(yǎng)3周，觀察結果；羅氏和瓊脂培養(yǎng)基均生長者為陽性。

陽性對照菌株：胞內分枝桿菌(M．intracellulare)。

陰性對照菌株：鳥分枝桿菌(M．a(chǎn)vium)。

(六)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基生長試驗*

培養(yǎng)基成分：用不含結晶紫的麥康凱培養(yǎng)基制成平板。

試驗方法：接種O．1mg細菌，37℃培養(yǎng)5～11d(為保持平板濕度，可將平板放在鋪有濕紗布的帶蓋容器中)。生長的菌落經(jīng)抗酸染色確認。

陽性對照菌株：偶然分枝桿菌(M．fortuitum)。

陰性對照菌株：恥垢分枝桿菌(M．smegmatis)。

*此試驗主要用于快速生長菌的鑒別。六、NTM菌種鑒定常用生化特征試驗

(一)聚山梨醇-80(吐溫-80)水解試驗

某些分枝桿菌具有一種酯酶，可分解聚山梨醇-80(吐溫-80)成為油酸等物質，使菌懸液的琥珀色變?yōu)樽霞t色。

試劑：O．0667mol／L(1／15M)PBS(pH7．0)100ml，加入0．5ml聚山梨醇-80和0．1％中性紅溶液2ml，121℃滅菌20min后，每管分裝3ml?？?℃保存，限2周內使用。

實驗方法：用吸管挑取在羅氏培養(yǎng)基上生長旺盛的細菌約5mg，置于裝有3ml試劑的試管中，37℃孵育10d。第3、5、10天觀察結果。

結果判定：菌懸液由琥珀色變?yōu)樽霞t色者為陽性；不變者為陰性；空白試劑對照不變色。

陽性對照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

陰性對照菌株：瘰癘分枝桿菌(M．scrofulaceum)。

空白對照：空白試劑。

(二)尿素酶試驗

某些分枝桿菌產(chǎn)生尿素酶，可分解尿素使菌懸液呈紅色。

試劑：A．0．0667mol／L(1／15M)PBS(pH6．7)，121℃滅菌20min，4℃保存。

B取試劑A配制0．12％尿素，以0．22mm濾膜除菌，每支試管分裝3ml。

C．0．1％酚磺酞(酚紅)：取酚磺酞O．1g加O．05mol／L(1／20N)氫氧化鈉(NaOH)

5．7ml溶解后，加水至100ml，113℃滅菌10min。

實驗方法：用吸管挑取在羅氏培養(yǎng)基上生長旺盛的細菌約5mg，移置于裝有3ml試劑B的試管中，每管加入1滴試劑C；37℃孵育3d，觀察結果。

結果判定：菌懸液呈紅色者為陽性；不變色者為陰性；空白試劑對照不變色。

陽性對照菌株：結核分枝桿菌(M．tuberculosis)。

陰性對照菌株：蟾蜍分枝桿菌(M．xenopi)。

空白對照：空白試劑。

(三)芳香硫酸酯酶試驗

某些分枝桿菌產(chǎn)生硫酸芳香酯酶，能分解二硫酸酚酞三鉀鹽，游離出酚酞，在堿性環(huán)境下出現(xiàn)紫紅色。

試劑：A．含二硫酸酚酞三鉀鹽的培養(yǎng)基：二硫酸酚酞三鉀鹽(分子量610．34)61．0mg，加入100ml蘇通液體培養(yǎng)基，混勻后12l℃滅菌15min，每支試

管分裝2m1。

B．10．6％碳酸鈉(NaCO3)水溶液。

實驗方法：取裝有試劑A的試管2支，分別加入生長旺盛的細菌菌懸液(20～40mg／m1)0．5m1；37℃孵育的第3、10天，分別取一支試管加入O．5m1試劑B后，觀察顏色變化。

結果判定：菌懸液呈紫紅色者為陽性；不變者為陰性；空白對照不變色。

陽性對照菌株：偶然分枝桿菌(M．f0rtuitum)。

陰性對照菌株：H37Rv。

空白對照：空白試劑。

(四)鐵離子吸收試驗

某些分枝桿菌具有還原鐵鹽的能力。鐵離子被吸收后，菌落呈鐵銹色。

試劑：4％枸櫞酸鐵胺水溶液，121℃滅菌15min，每支試管分裝1ml，4℃保存，3周內使用。

實驗方法：接種前棄去改良羅氏培養(yǎng)基管內凝固水，接種O．1mg生長旺盛的細菌，加入試劑1ml到培養(yǎng)基底部，37℃孵育3周，每周觀察結果1次。未加試劑的羅氏培養(yǎng)基為對照。

結果判定：菌落呈鐵銹色者為陽性；不變色者為陰性(注意與羅氏培養(yǎng)基上生長的菌落對比)。

陽性對照菌株：偶然分枝桿菌(M．fortuitum)。

陰性對照菌株：龜分枝桿菌(M．chelonae)。

(五)亞碲酸鹽還原試驗

某些分枝桿菌可使碲鹽還原為碲，使培養(yǎng)物呈黑色或深棕色沉淀物。

試劑：A．0．2％亞碲酸鉀水溶液，121℃滅菌15min。

B．0．5％蘇通瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，每管分裝3ml，制成斜面。

實驗方法：接種O．1mg細菌到試劑B培養(yǎng)基表面，37℃孵育7d時加入2滴試劑A，再孵育3d觀察結果。

結果判定：有黑色或深棕色沉淀物為陽性；無沉淀物者為陰性；空白試劑對照無變化。

陽性對照菌株：胞內分枝桿菌(M．intracellulare)。

陰性對照菌株：次要分枝桿菌(M．triviale)。七、分枝桿菌菌種鑒定試驗的質量控制

所有進行菌種(菌群)鑒定的臨床分離株，必須經(jīng)過傳代增菌，菌齡為3～4周且生長良好；所有實驗涉及的培養(yǎng)基、試劑必須符合規(guī)定的使用期限；所有標明有對照的鑒別實驗，在實施時參照系的結果符合相應標準后方可判定待測菌株的結果；進行相應實驗時，應采取必要措施，注意防止菌株對操作人員、實驗室和社會環(huán)境造成危害和污染。

NTM菌株經(jīng)過生長特性和生化特性鑒別實驗后，結合菌種鑒定流程圖和菌種鑒定實驗對照表(表2-3和表2-4)綜合判定菌種鑒定結果。第八節(jié)結核分枝桿菌聚合酶鏈反應技術

聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)或稱DNA體外擴增技術是一種選擇性的體外擴增DNA或RNA片段的方法，作為分子生物學實驗手段之一，由于其敏感性高、特異性強和反應迅速等特點，已廣泛應用于生物和醫(yī)學研究領域；近年來隨著該技術的不斷完善和改進，已用于對多種病原微生物的臨床檢測。一、PCR技術在結核病臨床診斷中的作用

目前臨床標本結核分枝桿菌的PCR檢測結果，在結核病的臨床診治中，只能作為輔助參考，不能作為結核病診斷的主要指標。因為目前的結核分枝桿菌PCR檢測商業(yè)試劑盒，基本上僅針對一個(或幾個)結核分枝桿菌特異性基因靶序列進行擴增檢測；而影響PCR檢測結果的諸多因素，在檢測體系中不能完全被消除；另外，結核分枝桿菌PCR檢測結果與結核病臨床診治及流行病學的吻合程度尚待進一步證實。因此，臨床醫(yī)師在參考結核分枝桿菌PCR檢查的同時，必須同時參照結核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學檢查(包括抗酸染色鏡檢、特別是分枝桿菌培養(yǎng)檢查)的結果并參考其他臨床檢查手段所得到的結果進行綜合判斷。二、臨床標本結核分枝桿菌PCR檢測試劑盒概述

根據(jù)我國臨床生物診斷試劑有關規(guī)定，用于臨床標本結核分枝桿菌PCR檢測的試劑盒，必須具有國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的生產(chǎn)文號。

目前，我國的結核分枝桿菌PCR檢測試劑盒，按照其擴增和檢測原理，可分為兩大類：一類是擴增產(chǎn)物經(jīng)雜交后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkimmunesorbentassay，ELISA)進行檢測，該技術原理是將引物5’端進行生物素標記以獲得帶有生物素標記的PCR擴增產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物變性后與包被于微孔板的捕獲探針進行雜交，然后與酶標親和素結合，進行生物素一親和素一辣根過氧化物酶顯色，使用酶標儀進行半定量測定。此類試劑盒中都應具有防止擴增產(chǎn)物污染的試劑和相關操作步驟；另一類采用熒光物質標記的引物或探針在擴增管中直接進行擴增和檢測，對于熒光定量PCR技術，操作與標準PCR操作基本相同，只是在PCR反應體系中添加一個熒光雙標記的寡核甘酸探針，該探針能與擴增片段中的特定區(qū)域結合。5’端帶有報告熒光基因，3’端帶有熒光淬滅基因。當引物延伸至探針結合處時，探針被分割切下，報告基因釋放熒光。隨著模板量的增加，報告基因釋放熒光量也增加，且與模板量成正相關。其特點是閉管、實時、防污染、既能定性也能定量。由于此類試劑盒一般要求使用特定的擴增儀、在相對封閉的環(huán)境中連續(xù)完成擴增和檢測過程，故此類試劑盒中可能沒有防止擴增產(chǎn)物污染的試劑和相應操作步驟。三、臨床標本結核分枝桿菌PCR檢測步驟

由于目前獲得批準生產(chǎn)并上市的臨床標本結核分枝桿菌PCR檢測試劑盒的種類較多，故檢測實驗必須嚴格按照試劑盒生產(chǎn)廠家提供的使用說明和操作步驟完成相應檢測并判斷結果。四、PCR操作注意事項

1．應在專門的PCR超凈臺內吸加PCR試劑，不工作時應以紫外線燈消毒。所有吸頭、離心管使用前必須經(jīng)高壓處理，防止DNA污染。

2．在另一超凈臺內吸加DNA樣品，并勤于更換手套。

3．設立陽性和陰性對照。

4．反應模板的用量應適當，防止非特異性擴增。五、結核分枝桿菌PCR檢測的質量控制

PCR檢測實驗室必須建立相應質量控制規(guī)章制度。

1．PCR檢測實驗操作人員必須經(jīng)過專門培訓。

2．PCR檢測實驗室必須制定處理有害試劑和預防污染的規(guī)定，并根據(jù)實驗過程劃出工作內容相對單一的操作區(qū)域。

3．必須選用具備國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)生產(chǎn)文號的檢測試劑盒，同時生產(chǎn)廠商應提供操作的技術培訓和指導。

4．使用的試劑盒必須在有效期內，檢測實驗記錄中必須包括試劑盒的生產(chǎn)批號。

5．進行檢測的相應標本必須符合試劑盒說明書中列舉的種類和質量標準。

6．每次實驗必須設立陰性、陽性和空白對照，嚴格按照試劑盒說明書提供的操作步驟完成檢測實驗，如果相應對照樣本檢測結果出現(xiàn)問題，必須進行重新實驗并分析記錄引起問題的可能原因。

7．對于結果檢測值處于無效區(qū)和灰區(qū)的樣本必須進行全過程的重復檢測并根據(jù)重復檢測值報告結果。

8．檢測實驗使用后的廢棄物、廢棄試劑必須按照操作區(qū)域分別集中，并經(jīng)12l℃30min高壓蒸汽滅菌后方可丟棄。

9．實驗使用的各種儀器必須符合相應規(guī)定。第九節(jié)結核病免疫學檢查

結核病作為因病原微生物感染所造成的人體疾病之一，在臨床上利用免疫學實驗技術檢查機體對分枝桿菌、特別是結核分枝桿菌感染造成的免疫反應，從而幫助臨床醫(yī)師進行鑒別診斷，有一定的實際意義。但由于結核分枝桿菌的生物特性及其引起的人體免疫反應較為特殊和復雜，目前結核病免疫學的檢測結果，在結核病的臨床診治中，只能作為輔助參考，不能作為結核病診斷和評價治療效果的指標。臨床醫(yī)師在參考免疫學檢查結果的同時，必須同時參照結核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學檢查(包括抗酸染色鏡檢、特別是分枝桿菌培養(yǎng))的結果并參考其他臨床檢查手段所得到的結果進行綜合判斷。一、結核病免疫學檢查試劑盒概述

根據(jù)我國臨床生物診斷試劑的有關規(guī)定，用于結核病免疫學檢查的試劑盒，必須具有國家有關部門頒發(fā)的生產(chǎn)文號。

目前，我國結核病免疫學檢測試劑盒，按照相應的實驗步驟，可分為兩大類：一類試劑盒檢測的標本一般為血清，利用ELISA實驗原理進行檢測，此類試劑盒中都應具有相應的陰性、陽性和空白對照試劑；另一類試劑盒采用快速金標法(免疫膠體金標記法)進行檢測實驗，檢測的標本有血清和全血，此類試劑盒均應具備顯示反應正常的質控線或斑點。

由于結核病免疫學檢查的試劑盒種類及相應實驗步驟差別較大，故開展此項檢查工作應嚴格按照選用試劑盒廠家提供的說明書進行實驗、判斷和報告結果。二、結核病免疫學檢查試劑盒實驗的質量控制

1．完成結核病免疫學檢查實驗的操作人員必須經(jīng)過專門培訓。

2．必須選用具備國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)生產(chǎn)文號的檢測試劑盒，同時生產(chǎn)廠商應提供操作的技術培訓和指導。

3．使用的試劑盒必須在有效期內，檢測實驗記錄中必須包括試劑盒的生產(chǎn)批號。

4．進行檢測的相應標本必須符合試劑盒說明書中列舉的種類和質量標準。

5．采用ELISA技術完成檢測的試劑盒，每次實驗必須設立陰性、陽性和空白對照。嚴格按照試劑盒說明書提供的操作步驟完成檢測實驗，如果相應對照樣本檢測結果出現(xiàn)問題，必須進行重新實驗并分析記錄引起問題的可能原因。

6．采用快速金標方法完成檢測實驗的試劑盒，每批試劑盒投入正常使用前，相應實驗室應使用檢測結果已知為陽性、陰性的標本或使用生產(chǎn)廠家提供的對照預先進行檢測，檢測結果相符后方可投入正常使用。

7．對于檢測值處于無效區(qū)和灰區(qū)的樣本必須進行全過程的重復檢測并根據(jù)重復檢測值報告結果。結核病免疫學輔助診斷檢查利用免疫學原理檢查機體對分枝桿菌、特別是結核分枝桿菌感染造成的免疫反應，從而幫助臨床醫(yī)師進行鑒別診斷；但由于結核分枝桿菌的生物特性及此類病原菌引起的人體免疫反應較為特殊和復雜，截止到目前為止，結核病的免疫學檢查在臨床診斷中的作用尚存有較大爭議。因此，目前結核病免疫學的檢測結果，在結核病的臨床診治中，只能夠作為輔助參考，不能作為結核病診斷和評價治療效果的指標。臨床醫(yī)師在參考免疫學檢查結果的同時，必須同時參照結核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學檢查(包括抗酸染色鏡檢、特別是分枝桿菌培養(yǎng)檢查)的結果并參考其它臨床檢查手段所得到的結果進行綜合判斷。（一）結核病免疫學檢查試劑盒概述根據(jù)我國臨床生物診斷試劑的規(guī)定，用于結核病免疫學檢查的試劑盒，必須具有國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的生產(chǎn)文號。目前，我國已頒發(fā)生產(chǎn)文號的結核病免疫學檢測試劑盒，按照相應的實驗步驟，可分為兩大類：一類試劑盒檢測的標本一般為血清，是利用ELISA實驗原理進行檢測，此類試劑盒中都應具有相應的陰性、陽性和空白對照試劑；另一類試劑盒采用快速金標法進行檢測實驗，檢測的標本有血清和全血，此類試劑盒均應具備顯示反應正常的質控線或斑點。由于結核病免疫學檢查的試劑盒種類及相應實驗步驟區(qū)別較大，故請開展此項檢查工作的實驗室嚴格按照選用試劑盒廠家提供的說明書進行實驗、判斷和報告結果。（二）結核病免疫學檢查試劑盒實驗的質量控制1、完成結核病免疫學檢查實驗的操作人員必須經(jīng)過專門培訓。2、必須選用具備國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)生產(chǎn)文號的檢測試劑盒；同時生產(chǎn)廠商提供操作的技術培訓和指導。3、使用的試劑盒必須在有效期內；檢測實驗記錄中必須包括試劑盒的生產(chǎn)批號。4、進行檢測的相應標本必須符合試劑盒說明書中列舉的種類和質量標準。5、采用ELISA技術完成檢測的試劑盒，每次實驗必須設立陰性、陽性和空白對照；嚴格按照試劑盒說明書提供的操作步驟完成檢測實驗，如果相應對照樣本檢測結果出現(xiàn)問題，必須進行重新實驗并分析記錄引起問題的可能原因。6、采用快速金標方法完成檢測實驗的試劑盒，每批試劑盒投入正常使用前，相應實驗室應使用檢測結果已知為陽性、陰性的標本或使用生產(chǎn)廠家提供的對照預先進行檢測，檢測結果相符后方可投入正常使用。7、對于結果檢測值處于無效區(qū)和灰區(qū)的樣本必須進行全過程的重復檢測并根據(jù)重復檢測值報告結果。本文歸納了結核病細菌學檢驗所包括的4項基本技術（涂片染色鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)、分枝桿菌藥物敏感性試驗、分枝桿菌菌種鑒定）以及結核桿菌臨床基因擴增（PCR）檢驗技術、分枝桿菌快速培養(yǎng)及藥物敏感性試驗技術、免疫學有關檢測技術的國家規(guī)范。結核病實驗室檢查，特別是細菌學檢查是結核病確診和治療的主要依據(jù)。雖然這些常規(guī)檢查方法在技術上比較成熟，但筆者認為尚存在以下幾個問題：1、結核病診斷方法，目前只是在結核病防治系統(tǒng)內初步得到規(guī)范和質量控制，但結核病最初的診斷約85%是在綜合性醫(yī)院里，而恰恰是在綜合性醫(yī)院里結核病的細菌學診斷尚不夠規(guī)范且水平參差不齊，所以加強和提高綜合性醫(yī)院的結核病細菌學診斷水平是我們今后工作的重點之一。2、結核病的診斷技術目前還處在較低的水平，國際推薦的涂片和培養(yǎng)方法也還分別存在著特異性差、敏感性低和結果報出時間太長的不足，因此不斷加強結核病診斷新技術的研究和開發(fā)仍然是十分必須的。結核菌的快速培養(yǎng)系統(tǒng)是一項得到國際認可的結核菌檢測技術，大大提高了培養(yǎng)結果的報出時間，但由于儀器設備昂貴，檢測成本太高而較難推廣普及。敏感、特異、快速、經(jīng)濟、個體化是今后結核病實驗室診斷的發(fā)展方向。鑒于結核病實驗室檢查、特別是細菌學檢查在結核病控制工作中的重要性，為保障相應檢查項目結果的可靠性，要求相應的檢查項目必須由經(jīng)過培訓并考核合格的專職人員完成，且開展相應檢查的實驗室應具備安全操作設施并制定實驗室內部質量控制措施，同時接受專業(yè)結核病參比實驗室的質量控制督導和培訓。結核病的免疫學診斷十幾年來國內外學者一直從MT培養(yǎng)濾液中提純蛋白質抗原，由于該方法制備蛋白抗原較煩瑣、費時。因此，近年來，筆者研究室應用基因工程技術克隆、表達MT基因，簡便地獲得了大量MT單一的蛋白抗原(如CFPl0、ESAT6、MPT63、MPT64、Ag85A、Ag85B、KatG、16ku、3Sku、65ku等蛋白)，研究其診斷應用價值。(1)血清學診斷20世紀70年代應用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測患者血清中結核特異性抗體，成為結核病常用的輔助診斷手段之一，尤其是近十幾年來金標免疫斑點法檢測抗原抗體反應已成為無需