DNA測序技術(shù)及其應(yīng)用課件

DNA測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用指導(dǎo)老師：張椿雨小組成員：胡娜娜，武巧，姚淼，賈明明1精選課件ppt1234引言第三代測序技術(shù)測序技術(shù)的應(yīng)用與展望第一代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)52精選課件ppt1引言

DNA序列測定的意義DNA的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNA一級結(jié)構(gòu)的詳細了解。3精選課件ppt造福人類的HGP

人類基因組計劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于2003年完成。人類基因組計劃是當代生命科學(xué)一項偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。4精選課件ppt

DNA測序技術(shù)的歷史與發(fā)展測序技術(shù)最早可以追溯到20世紀50年代。早在1945年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測序技術(shù)的報導(dǎo)，即Whitfeld等用化學(xué)降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標志著第一代測序技術(shù)的誕生。

此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測序技術(shù)，包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。5精選課件pptDNA測序技術(shù)的歷史與發(fā)展

最近，Helicos公司的單分子測序技術(shù)、PacificBiosciences公司的單分子實時(SingleMoleculeRealTime,SMRT)測序技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術(shù)被認為是第三代測序技術(shù)。

測序技術(shù)正在向著高通量、低成本、長讀取長度的方向發(fā)展。6精選課件ppt2.第一代測序技術(shù)7精選課件ppt

化學(xué)降解法

基本原理：利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機斷裂DNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測出DNA的序列。8精選課件ppt技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序9精選課件ppt10精選課件ppt化學(xué)降解法剛問世時，準確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡便快速的Sanger法所代替。11精選課件ppt雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。原理：利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨立的測序反應(yīng)體系，在每個反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。12精選課件ppt雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖13精選課件pptPOHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH14精選課件ppt

Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動測序技術(shù)。15精選課件ppt熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標記代替同位素標記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術(shù)的DNA測序儀。16精選課件ppt17精選課件ppt3730

全自動測序儀18精選課件ppt雜交測序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。19精選課件ppt雜交測序檢測速度快，采用標準化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術(shù)的特點。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測定。通過幾十年的逐步改進,第1代測序儀的讀長可以超過1000bp,原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%,測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達到600000堿基。20精選課件ppt第一代測序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用,如人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA測序技術(shù)。目前基于熒光標記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀仍被廣泛地應(yīng)用。21精選課件ppt2.第二代測序技術(shù)盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代，即功能基因組時代已向我們走來。第一代測序方法已經(jīng)不能滿足深度測序和重復(fù)測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求，這促使了第二代測序，又稱下一代測序(next—generationsequencing)的誕生。第二代測序技術(shù)包括：454測序技術(shù)、Solexa測序技術(shù)和SOLiD測序技術(shù)。22精選課件ppt過程概述基因組DNA

DNA片段（cDNA）構(gòu)建ssDNA文庫測序（聚合酶合成測序，連接酶合成測序）

由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進行，每個延伸反應(yīng)所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，從而獲得測序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測不斷重復(fù)，最后經(jīng)過計算機分析就可以獲得完整的DNA序列信息。

限制性內(nèi)切酶酶切片段兩端加上不同的接頭固定，并進行PCR擴增23精選課件ppt2.1

454測序技術(shù)原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。24精選課件ppt原理圖：構(gòu)建文庫DNA磁珠捕獲與PCR擴增測序焦磷酸測序聚合酶硫化酶熒光素酶25精選課件ppt測序數(shù)據(jù)輸出：26精選課件ppt指示器相機PTP盒27精選課件ppt454測序法的突出優(yōu)勢是較長的讀長，目前GSFLX測序系統(tǒng)的序列讀長已超過400bp。雖然454平臺的測序成本比其他新一代測序平臺要高很多，但對于那些需要長讀長的應(yīng)用，如從頭測序，它仍是最理想的選擇。缺點是無法準確測量同聚物的長度。小結(jié)28精選課件ppt2.2Solexa測序技術(shù)

Illumina公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測序(SequencingbySynthesis)的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。原理：

將基因組DNA的隨機片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億Cluster，每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。29精選課件ppt原理圖構(gòu)建ssDNA文庫單鏈DNA與流動槽附著BridgePCRDNA簇線性化測序30精選課件ppt測序過程：dNTP的3‘羥基被化學(xué)方法保護每輪合成反應(yīng)只能添加一個堿基31精選課件ppt測序過程：32精選課件ppt

GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到2×50bp，每次運行后可獲得超過20GB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術(shù)。小結(jié)33精選課件ppt2.3SOLiD技術(shù)

SOLID通過連接反應(yīng)進行測序。其基本原理是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫準備擴增微珠與玻片連接連接測序與454測序類似34精選課件ppt

SOLiD系統(tǒng)與454測序系統(tǒng)相比，每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。35精選課件ppt測序過程：連接酶八聚核苷酸模板通用測序引物n36精選課件ppt37精選課件ppt

超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLID3單次運行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍人類基因組覆蓋度。小結(jié)38精選課件ppt表1三種二代測序技術(shù)對比39精選課件ppt4.第三代DNA測序技術(shù)第二代的高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用,但是由于其測序速度、成本、準確度等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測序解決方案。單分子測序也就應(yīng)運而生。

2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實驗室”40精選課件ppt三代測序技術(shù)是以單分子測序為特點的測序技術(shù)單分子即時DNA測序技術(shù)(SMRT)

HeliScope單分子測序

基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時DNA測序納米孔單分子測序技術(shù)41精選課件ppt第三代測序技術(shù)1、目前一期的讀取速度為3bp/s2、它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。3、它的精度非常高，達到99.9999%。42精選課件ppt標記熒光基因DNA聚合酶作用

顯微鏡下進行熒光探測

零級波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)即時觀察和背景熒光干擾4.1

單分子即時DNA測序技術(shù)43精選課件ppt零級波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)小孔的尺寸低于光的波長，小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造很小體積的檢測空間DNA鏈周圍游離的熒光標記dNTP有限，非?？焖龠M出于小孔，穩(wěn)定的背景熒光信號熒光標記dNTP被摻入到DNA合成鏈，其攜帶的特定熒光會持續(xù)一小段時間(熒光光曝)DNA聚合酶44精選課件ppt

4.2

HeliScope單分子測序

優(yōu)點：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)，能夠直接記錄到單個堿基的熒光，從而克服了第二代測序必須用PCR擴增出數(shù)千個拷貝以增加信號亮度的缺陷。DNA聚合酶熒光標記的dNTP產(chǎn)生熒光CCD記錄發(fā)生了堿基延伸反應(yīng)平面基板模擬圖45精選課件ppt4.3基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時DNA測序

熒光供體

DNA聚合酶

熒光受體

4種dNTP

熒光共振能量轉(zhuǎn)移具體過程優(yōu)點：游離的dNTP不發(fā)光，只有其摻入到新合成的DNA鏈時才會發(fā)光，極大地降低了背景熒光干擾此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少DNA聚合酶的光損傷作用，進一步延長了測序長度。能量46精選課件ppt

DNA分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔,利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNA堿基

優(yōu)點：納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對DNA進行標記，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCD照相機。4.4

納米孔單分子測序技術(shù)內(nèi)部：核酸外切酶和環(huán)式糊精由生物分子組成的納米孔47精選課件ppt優(yōu)點：

直接測RNA序列。

既然DNA聚合酶能夠即時觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以應(yīng)用于第三代測序平臺。直接測甲基化的DNA序列。

SMRT技術(shù)也可利用甲基化堿基特有的熒光信號來識別模板DNA中的甲基化修飾，如N6·甲基腺苷、5．甲基胞嘧啶或5一羥甲基胞嘧啶48精選課件ppt表2各種測序技術(shù)比較49精選課件ppt5.基因測序的應(yīng)用未知基因組的測序全基因組重測序深度擴增子測序轉(zhuǎn)錄組測序關(guān)聯(lián)突變的檢測病毒抗藥性和傳染病源快速檢測疾病相關(guān)區(qū)域、目標區(qū)域測定環(huán)境基因組學(xué)和微生物多樣性DNA甲基化模式研究全基因組小分子RNA（miRNA)分析染色質(zhì)免疫沉淀表觀遺傳學(xué)考古學(xué)……50精選課件ppt全基因組重測序全基因組重測序是對已有參考序列（ReferenceSequence）的物種的不同個體進行基因組測序，并以此為基礎(chǔ)進行個體或群體水平的差異性分析。通過全基因組重測序，研究者可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）、拷貝數(shù)變異（CopyNumberVariation，CNV）、插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）、結(jié)構(gòu)變異（StructureVariation，SV）等變異位點。這在人類疾病及動植物育種研究等方面具有重大的指導(dǎo)意義。51精選課件ppt全基因組重測序完成全基因組測序的部分的物種52精選課件ppt全基因組重測序53精選課件ppt全基因組重測序54精選課件ppt轉(zhuǎn)錄組測序（Transcriptomesequencing）

轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測序是指用新一代高通量測序技術(shù)對物種或者組織的轉(zhuǎn)錄本進行測序并得到相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本信息。55精選課件ppt轉(zhuǎn)錄組測序（Transcriptomesequencing）56精選課件ppt新型病源體的快速鑒定57精選課件ppt艾滋病毒抗藥性HIVsequencing

58精選課件ppt外顯子&目標區(qū)域測序外顯子