山羊胚胎生產(chǎn)及冷凍保存技術(shù)規(guī)范

1山羊胚胎生產(chǎn)及冷凍保存技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了山羊胚胎生產(chǎn)及冷凍保存的技術(shù)要求。本文件適用山羊胚胎生產(chǎn)及冷凍保存。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1674牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1超數(shù)排卵Superovulation利用外源性促性腺激素誘發(fā)雌性動物卵巢多個卵泡發(fā)育，并排出多個具有受精能力的卵子的方法。3.2體外受精I(xiàn)nvitrofertilization哺乳動物的精子和卵子在人工控制的體外環(huán)境中完成受精過程。3.3玻璃化冷凍Vitrification利用含有高濃度的滲透性抗凍保護(hù)劑溶液處理胚胎，然后將胚胎裝入冷凍載體并直接投入液氮快速降溫，使液體形成玻璃態(tài)，可有效減少冷凍過程中有害冰晶的形成，使胚胎所受物理性傷害大大降低的一種胚胎冷凍方法。3.4慢速冷凍Slow-freezing利用含有低濃度的滲透性抗凍保護(hù)劑溶液處理胚胎，然后將胚胎裝入冷凍載體并按照一定程序于程序冷凍儀中植冰和降溫，最后置于液氮中保存的一種冷凍方法。3.5體外受精胚invitro-fertilizedembryo通過體外受精獲得的胚胎。4胚胎生產(chǎn)4.1超數(shù)排卵胚生產(chǎn)4.1.1藥品與器械孕酮陰道栓（CIDR）、氯前列烯醇（PGF2α)、促卵泡素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）（或促黃體素（LH），或促排3號）、青霉素、鏈霉素、復(fù)合麻醉劑、PBS液（附錄A1）、沖配液（附錄A2）、胚胎操作液（附錄A3）、生理鹽水、75%酒精、碘酊；手術(shù)臺、植栓槍、羊用沖胚管、滯留針（18G）、手術(shù)剪、手術(shù)刀、止血鉗、縫針（圓針、三棱針）、外科手術(shù)縫線、注射器、連續(xù)變倍實體顯微鏡、恒溫臺、檢胚皿、培養(yǎng)皿。4.1.2供體母羊選擇2所選用供體母羊必須符合品種要求或標(biāo)準(zhǔn)（有國標(biāo)或地標(biāo)的品種，參照品種標(biāo)準(zhǔn)），連續(xù)三代內(nèi)系譜清楚、健康無病，發(fā)育到性成熟后，繁殖機(jī)能正常的個體。4.1.3飼養(yǎng)管理保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度穩(wěn)定、適宜、衛(wèi)生，避免應(yīng)激；制定合理的供體羊飼糧配方，保證蛋白質(zhì)、能量、維生素和微量元素等營養(yǎng)平衡，保持中等膘情；供給清潔飲水，適當(dāng)運動。4.1.4超數(shù)排卵用植栓槍將CIDR（含孕酮300～500mg）放入供體母羊陰道內(nèi)，放置CIDR之日為0d，第9d第二次補(bǔ)栓，第15d起早晚間隔12h肌肉注射FSH，注射總量100～200IU（或10～15mg），每天按照總量的5:3:2遞減連續(xù)注射3d，第16d上午注射完FSH后立即撤CIDR，同時注射氯前列烯醇2mL。4.1.5發(fā)情鑒定與誘導(dǎo)排卵注射完FSH后，觀察母羊發(fā)情情況。對有發(fā)情征兆的母羊，采用公羊試情，以供體母羊愿意接受試情公羊爬跨，判斷為發(fā)情。做好發(fā)情時間記錄，同時靜脈注射hCG500～800IU，或肌注LH50~100IU，或肌注促排3號10～20μg。4.1.6配種可采用自然交配或人工授精進(jìn)行發(fā)情母羊的配種。自然交配配種2次，人工授精輸精3次。發(fā)情時立即配種1次，每間隔12h再配第2或第3次。人工授精，可使用鮮精或凍精，鮮精活力≥0.7以上，凍精解凍后活力≥0.3，每次輸精有效精子數(shù)3×107個，輸精容積0.5mL～1mL。4.1.7手術(shù)沖胚采用羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程（NY/T1571-2007）中5.1部分。4.2體外受精胚生產(chǎn)4.2.1藥品和器械超數(shù)排卵藥品、消毒藥品、外科手術(shù)器械和常用器械見4.4.1。肝素、卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液、體外受精液、早期胚胎體外培養(yǎng)液；CO2培養(yǎng)箱、CO2鋼瓶、超凈工作臺。4.2.2卵母細(xì)胞收集4.2.1.1活體取卵按照4.1.2選擇供體母羊，按照4.1.4對供體母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。在第6次注射FSH前12h禁食，最后1次FSH注射12h，參見羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程（NY/T1571-2007）中5.1中外科手術(shù)方法暴露卵巢，用生理鹽水浸潤的紗布包裹卵巢，用預(yù)吸有抽卵液（附錄A4），用帶12號針頭的5mL注射器抽吸卵巢上所有直徑3～6mm的有腔卵泡中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）和卵泡液，抽吸完后將抽吸物盛在60mm的培養(yǎng)皿中。4.2.1.2屠宰場收集卵巢選擇符合品種要求、系譜清楚的淘汰母羊，屠宰后收集卵巢，放入含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素的生理鹽水或PBS液的保溫瓶中，2h～4h送回實驗室，然后參見4.2.1.1.中的方法抽吸卵母細(xì)胞。4.2.3卵母細(xì)胞體外成熟用卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液（附錄A5）于35mm培養(yǎng)皿中制作60μl-80μl微滴，覆蓋礦物油將，在CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2h。將收集的COCs用卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液洗滌2次后移入微滴，每個微滴放15枚～20枚COCs，然后轉(zhuǎn)入38.5℃、100%濕度和5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理脫去卵丘細(xì)胞，于體視顯微鏡下觀察，排出第一極體者為成熟卵母細(xì)胞。34.2.4精液收集與準(zhǔn)備在體外受精前30min收集新鮮精液或冷凍精液，精液來源公畜系譜清楚，且精子活力必須達(dá)到4.1.6中的要求。將精子洗滌液（附錄A6）與精液按照1:1的比例緩慢加入精液，混勻后1000rpm×5min離心洗滌2次，然后將精子的密度用精子獲能與體外受精液（附錄A7）調(diào)至4×106個/mL～6×106個/mL。4.2.5獲能與體外受精將20個～30個成熟的卵母細(xì)胞移入用50μl精子獲能與體外受精液（附錄A7）制成的受精液滴中，然后加入2μl調(diào)節(jié)好密度的精液到每個液滴，在38.5℃、100%濕度和5%的CO2的條件下精卵孵育18h～22h。4.2.6早期胚胎培養(yǎng)將與精子孵育后的卵子（假定的受精卵）在SOF液中洗滌2次后，移入預(yù)先在培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)先平衡了2h的早期胚胎培養(yǎng)液（A8）制成的滴內(nèi)。將20枚～25枚受精卵分別移入100μl的發(fā)育培養(yǎng)液，在38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～8d至桑椹胚或囊胚階段。5胚胎質(zhì)量檢測按照NY/T1674-2008的規(guī)定執(zhí)行。6胚胎冷凍保存將質(zhì)量檢測為A級的胚胎進(jìn)行冷凍保存,低于A級的作為鮮胚進(jìn)行移植。6.1慢速降溫冷凍保存6.1.1藥品與器械0.5mol/L的蔗糖溶液（附錄A9）、1.6mol/L的乙二醇冷凍保存液（慢速冷凍保存液附錄A10）；細(xì)管、細(xì)管塞、檢胚針、裝管器、液氮罐、程控降溫儀，以及4.4.1中胚胎觀察器械。6.1.2裝管將胚胎移入慢速冷凍保存液制成的液滴中，平衡10min后，用0.25mL細(xì)管采用三段或五段裝管法（附錄B）裝管，胚胎裝在中間段的冷凍保存液中，兩邊的液體是0.5mol/L的蔗糖溶液。6.1.3冷凍將裝有胚胎的細(xì)管從室溫（20℃)經(jīng)10min降溫到0℃,經(jīng)過15min降到-8℃,然后平衡10min，經(jīng)過45min從-8℃緩慢降溫到-30℃,然后平衡10min，最后從-30℃經(jīng)10min降溫到-35℃,平衡5min后直接投入液氮中保存。6.2玻璃化冷凍保存6.2.1藥品與器械0.5mol/L的蔗糖溶液（附錄A9）、10%乙二醇PBS液（附錄11）、EFS30冷凍保存液（附錄12），細(xì)管、細(xì)管塞、檢胚針、裝管器、液氮罐、程控降溫儀，以及4.4.1中胚胎觀察器械。6.2.2細(xì)管玻璃化冷凍將胚胎移入10%乙二醇冷凍液平衡5min，然后移入EFS30冷凍保存液中平衡1min后，迅速按照附錄B2示意圖裝管、封口后，迅速直接投入液氮中。6.3包裝要求將冷凍胚胎裝塑料指形管，在塑料指形管上標(biāo)記供體母畜號、數(shù)量、與配公畜號（或凍精號）及生產(chǎn)日期。47解凍7.1慢速冷凍保存胚胎的解凍將冷凍胚胎細(xì)管在空氣中停留10s，放入35℃水浴鍋解凍10s，拔去細(xì)管塞在解凍后1min～5min內(nèi)完成移植。7.2玻璃化冷凍解凍將細(xì)管從液氮罐取出，在空氣中停留5s，放入30℃水浴鍋中直至蔗糖溶液段由白色變?yōu)闊o色時取出細(xì)管用力一甩，使細(xì)管中液體充分混合，然后拔去細(xì)管塞，將胚胎在1min～5min內(nèi)完成移植。5（資料性附錄）各種液體配制A1PBS液（磷酸鹽緩沖液）8mg/mLNaCl,0.20mg/mLKCl,1.14mg/mLNa2HPO4,0.2mg/mLKH2PO4，配制好后0.22μm濾膜過濾4℃保存。A2沖胚液0.1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+0.025mg/mL卡拉霉素的PBS溶液，配制好后0.22μm濾膜過濾4℃保存。臨用時維持在35～37℃。A3胚胎操作液M199*+5mg/mL4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+5%（v/v）胎牛血清(FBS)+100IU/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素,然后0.22μm濾膜過濾4℃保存。臨用時維持在35～37℃。*M199：通用型商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液Medium199。A4卵母細(xì)胞抽吸液M199+10%（v/v）FBS+25IU/mL肝素+50μg/mL硫酸慶大霉素。A5卵母細(xì)胞成熟液M199+0.12mg/mL丙酮酸鈉+10μg/mL促卵泡素(FSH)+20μg/mL促黃體生成素(LH)+1μg/mL雌二醇(E2)+10ng/mL表皮生長因子(EGF)+10%發(fā)情山羊血清(EGS)+100IU/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素，然后0.22μm濾膜過濾4℃保存。制成培養(yǎng)液滴臨用前培養(yǎng)箱中平衡2h。A6精子洗滌液（SOF液）6.30mg/mLNaCl+0.53mg/mLKCl+0.16mg/mLKH2PO4+2.11mg/mLNaHCO3+0.25mg/mLCaCl2·2H2O+0.1mg/mLMgCl2·6H2O+0.642mL60%(w/v)的乳酸鈉+0.036mg/mL丙酮酸鈉+0.27mg/mL葡萄糖+3mg/mL牛血清白蛋白(BSA)+100IU/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素，然后0.22μm濾膜過濾4℃保存。A7獲能與體外受精液SOF+10%發(fā)情山羊血清（EGS）+5μg/mL肝素+4μg/mL慶大霉素A8早期胚胎培養(yǎng)液SOF+0.2mM丙酮酸鈉+8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)+20μL/mLMEM*+10μL/mLBME*+100IU/mL青霉素+100ug/mL鏈霉素，然后用0.22μm濾膜過濾4℃保存。*商品化培養(yǎng)液：MEM：MinimumEssentialMedium液；BME：BasalMediumEagle’s液。A90.5mol/L的蔗糖溶液將17.15g蔗糖溶解于100mL的PBS液中，4℃保存，臨用前平衡到室溫。A101.6mol/L的乙二醇冷凍保存液（慢速冷凍保存液）6A1110%乙二醇PBS液按照體積比配制10%的乙二醇PBS液，然后用0.22μm濾膜過濾4℃保存，臨用前平衡到室溫。A12EFS30液（玻璃化冷凍保存液）首先用0.5mol/L的蔗糖溶液，配制30%（w/v）Ficoll70000(聚蔗糖)溶液作為FS液，然后在取70mL的FS液中加入30mL乙二醇,制成EFS30液，4℃保存，臨用前平衡到室溫。7（資料性附錄）胚胎裝管示意圖B1慢速冷凍裝管示意圖①棉線，②聚乙烯粉末，③0.5mol/L的蔗糖溶液，④空氣，⑤帶胚胎的冷凍保存液，⑥細(xì)管塞B2玻璃化冷凍裝管示意圖①棉線，②聚乙烯粉末，③空氣（長度0.5cm），④帶胚胎的EFS30液（長度：0.6cm），⑤EFS30液（長度：0.4cm），⑥0.5mol/L的蔗糖溶液（長度：7.5cm）,⑦細(xì)管塞8