基因工程制胰島素專家講座

2024/4/18用基因工程方法取得胰島素第四組1基因工程制胰島素專家講座第1頁(yè)2024/4/18胰島素是由胰島B細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等刺激而分泌一個(gè)蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來(lái)糖尿病治療。胰島素這類活性蛋白多肽和細(xì)胞因子含有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，體外難以人工合成。所以過(guò)去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取胰島素來(lái)治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差異，如與豬胰島素B鏈第30個(gè)氨基酸殘基不一樣，長(zhǎng)久服用會(huì)引發(fā)腎和眼疾病，故必需要用基因工程方法取得重組人胰島素進(jìn)行治療。2基因工程制胰島素專家講座第2頁(yè)2024/4/183基因工程制胰島素三種方法一、A鏈和B鏈分別表示法化學(xué)合成A鏈和B鏈編碼序列基因工程制胰島素專家講座第3頁(yè)2024/4/184基因工程制胰島素三種方法一、A鏈和B鏈分別表示法表示產(chǎn)物后期處理路線：基因工程制胰島素專家講座第4頁(yè)2024/4/185基因工程制胰島素三種方法二、人胰島素原表示法基因工程菌構(gòu)建戰(zhàn)略：基因工程制胰島素專家講座第5頁(yè)2024/4/186基因工程制胰島素三種方法二、人胰島素原表示法表示產(chǎn)物后期處理路線：基因工程制胰島素專家講座第6頁(yè)2024/4/187基因工程制胰島素三種方法三、A鏈和B鏈同時(shí)表示法基因工程制胰島素專家講座第7頁(yè)2024/4/188方法一：

因?yàn)锳鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵正確配對(duì)率較低，通常只有10%-20%，所以成本高。

方法二：

胰島素原能形成良好空間構(gòu)象，三對(duì)二硫鍵正確配對(duì)率提升，折疊率高。工藝路線依然繁瑣。

方法三：

需體外折疊?；蚬こ讨埔葝u素三種方法三種方法比較：基因工程制胰島素專家講座第8頁(yè)2024/4/18基因工程獲取胰島素步驟一、獲取外源目標(biāo)基因片段二、選擇與獲取表示載體三、重組目標(biāo)DNA片段與表示載體四、選擇與獲取表示細(xì)胞五、重組體導(dǎo)入表示細(xì)胞六、對(duì)重組體細(xì)胞進(jìn)行篩選純化判定七、工程菌產(chǎn)物判定和保留八、發(fā)酵培養(yǎng)9基因工程制胰島素專家講座第9頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段1．選擇試驗(yàn)材料2．提取RNA，分離RNA3．逆轉(zhuǎn)錄mRNA,得cDNA第一鏈4．得雙鏈DNA5．DNA序列糾錯(cuò)6.目標(biāo)基因經(jīng)過(guò)細(xì)胞克隆擴(kuò)增7.目標(biāo)基因回收及DNA測(cè)序，最終目標(biāo)基因獲取10基因工程制胰島素專家講座第10頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段1．選擇試驗(yàn)材料胰島素是一個(gè)蛋白質(zhì)類激素，體內(nèi)胰島素是胰島B細(xì)胞（即胰島β細(xì)胞）受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等刺激而分泌。胰島素基因只有在胰島B細(xì)胞中才能轉(zhuǎn)錄出信使RNA，所以用基因工程方法生產(chǎn)胰島素時(shí)，選取胰島B細(xì)胞為獲取目標(biāo)基因試驗(yàn)材料。11基因工程制胰島素專家講座第11頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．提取RNA，分離RNA2．1總RNA提取

2．2

mRNA純化

2．3

mRNA保留12基因工程制胰島素專家講座第12頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．1總RNA提取總RNA抽提方法有各種，TRIzol試劑是使用組廣泛RNA抽提試劑，主要由苯酚和異硫氰酸胍組成，能夠快速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)RNA釋放出來(lái)，并使核糖體蛋白與RNA分子分離。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，所以TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。TRIzol是從細(xì)胞和組織中提取總RNA即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過(guò)程中，TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA時(shí)，首先用液氮研磨材料，勻漿，加入TRIzol試劑，深入破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成份。然后加入氯仿抽提，離心，分離水相和有機(jī)相，搜集含有RNA水相，經(jīng)過(guò)異丙醇沉淀，可取得比較純總RNA，用于下一步mRNA純化。

13基因工程制胰島素專家講座第13頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．1．1TRIzol法提取流程（1）樣品處理①培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5*10^7，移入1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol，混勻，室溫靜置5min。②組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保留組織均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol充分勻漿，室溫靜置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。（3）4℃離心，1g*15min，取上清液。（4）加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。（5）4℃離心，1g*10min，棄上清液。（6）加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g*5min，棄上清液。（7）晾干，加入適量DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。14基因工程制胰島素專家講座第14頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．1．1TRIzol法提取流程圖15基因工程制胰島素專家講座第15頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．2

mRNA純化該方法利用mRNA

3＇端含有PolyA（多聚腺苷酸）特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異性結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過(guò)兩次寡聚纖維柱后可得到較高純度mRNA。16基因工程制胰島素專家講座第16頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．2．1寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（1）試劑準(zhǔn)備：①3M醋酸鈉（pH5.2）；②0.1MNaOH；③上樣緩沖液：20mMTris-HCl（pH7.6）,0.5MNaCl,1MEDTA(pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉)。配制時(shí)可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）母液，經(jīng)高壓消毒后按各成份確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃，加入經(jīng)65℃溫育（30min）10%SLS至終濃度為0.1%；④洗脫緩沖液：10mMTris-HCl（pH7.6），1mMEDTA（pH8.0），0.05%SDS；⑤無(wú)水乙醇、70%乙醇；⑥D(zhuǎn)EPC（0.1%焦炭酸二乙酯）17基因工程制胰島素專家講座第17頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．2．1寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（2）操作步驟：①將0.5-1.0g寡聚（dT）纖維懸浮于0.1MNaOH溶液中。②用DEPC處理1ml注射器或適當(dāng)細(xì)管，將寡聚（dT）纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積DEPCH2O洗柱。③使用1*上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。④將RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2*上樣緩沖液，混勻后上柱，馬上搜集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1*上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)搜集流出液。⑤將全部流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，搜集流出液。⑥用5-10倍柱床體積1*上樣緩沖液洗柱，每管1ml分步搜集，OD260測(cè)定RNA含量。前部分搜集管中流出液OD260值很高，其內(nèi)含物為無(wú)polyA尾RNA。后部分搜集管中流出液OD260值很低或無(wú)吸收。⑦用2-3倍柱容積洗脫緩沖液洗脫poly（A+）RNA，分步搜集，每部分為1/3-1/2柱體積。⑧OD260測(cè)定poly（A+）RNA分布，合并含poly（A+）RNA搜集管，加入1/10體積3MNaAc（pH5.2）、2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置30min。⑨4℃離心，10000g*15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。4℃離心，10000g*5min，棄上清，室溫晾干。⑩用適量DEPCH2O溶解RNA。18基因工程制胰島素專家講座第18頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．2．1寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（3）注意事項(xiàng)①整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程必須預(yù)防Rnase污染。②步驟④中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣目標(biāo)有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNApoly（A+）尾處二級(jí)結(jié)構(gòu)，使poly（A+）尾充分暴露，從而提升poly（A+）RNA回收率；另一個(gè)目標(biāo)是能解離mRNA與rRNA結(jié)合，不然會(huì)造成rRNA污染。所以此步驟不能省略。③十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會(huì)妨礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于18℃最好用LiCl替換NaCl。④寡聚（dT）纖維素柱可在4℃貯存，重復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌ddH2O、上樣緩沖液洗柱。⑤普通而言，107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μgpoly（A+）RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量1%-2%。19基因工程制胰島素專家講座第19頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段2．3

mRNA保留用少許水溶解mRNA，即可用于cDNA合成或保留在70%乙醇中并于-70℃下貯存。20基因工程制胰島素專家講座第20頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段胰島素基因mRNA序列21基因工程制胰島素專家講座第21頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段胰島素基因mRNA序列NCBI中搜索得22基因工程制胰島素專家講座第22頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段3．逆轉(zhuǎn)錄mRNA,得cDNA第一鏈mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下由引物引導(dǎo)合成cDNA。加入高濃度

Oligo（dT）引物，

，Oligo（dT）引物與

mRNA

3'

末端

poly（A）配對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以

mRNA

為模板合成第一鏈

cDNA

。這種

cDNA

合成方法在

cDNA

文庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)主要是因?yàn)?/p>

cDNA

末端存在較長(zhǎng)

poly（A）而影響

cDNA

測(cè)序。（原因：oligo（dT）結(jié)合在mRNA

3‘端，所以合成全長(zhǎng)cDNA需要反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA分子一端移動(dòng)到另一端，有時(shí)這種全合成難以到達(dá)）23基因工程制胰島素專家講座第23頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段4．得雙鏈DNA

4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA

4.2將DNA雙鏈經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增24基因工程制胰島素專家講座第24頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNAmRNA－cDNA

雜合雙鏈中

mRNA

鏈在

RNA

酶

H

作用下先形成很多切口，

mRNA

鏈就被切割成很多小片段，這些小片段為大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

提供了合成第二鏈引物。大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

以第一鏈

cDNA

為模板合成一段段互補(bǔ)

cDNA

片段。這些

cDNA

片段進(jìn)而在

DNA

連接酶作用下連接成一條鏈，即

cDNA

第二鏈。遺留在

5'-末端一段很小

mRNA

也被大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

5'3'

核酸外切酶和

RNA

酶

H

降解，暴露出與第一鏈

cDNA

對(duì)應(yīng)

3'-端部分序列。同時(shí)，大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

3'--5'

核酸外切酶活性可將暴露出第一鏈

cDNA

3'-端部分消化掉，形成平端或差不多平端優(yōu)點(diǎn):a)合成cDNA效率高

b)直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物,不需純化

c)防止使用S1核酸酶來(lái)切割雙鏈cDNA25基因工程制胰島素專家講座第25頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA26基因工程制胰島素專家講座第26頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段4.2將DNA雙鏈經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增

4.2.1模板DNA變性向離心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液（500mm01／LKCl；100mmol／LTris一HCl(pH8.4)，150mmol／LMgCl2，lmg／m1明膠）、5mmo1／LdNTP貯備液，然后加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，方便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備27基因工程制胰島素專家講座第27頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段4.2將DNA雙鏈經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增

4.2.2模板DNA與引物退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；28基因工程制胰島素專家講座第28頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段4.2將DNA雙鏈經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增

4.2.3引物延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新與模板DNA鏈互補(bǔ)半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可取得更多“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目標(biāo)基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。29基因工程制胰島素專家講座第29頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段5.目標(biāo)基因回收純化及DNA測(cè)序糾錯(cuò)

5.1將目標(biāo)基因進(jìn)行回收純化

5.2對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序

5.3DNA序列糾錯(cuò)30基因工程制胰島素專家講座第30頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段5.1將目標(biāo)基因進(jìn)行回收純化1)在PCR試管中加入凝膠緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳電泳到適當(dāng)位置后在目標(biāo)DNA條帶前端挖一長(zhǎng)方形槽，向槽中加入融化低熔點(diǎn)膠，待凝固后進(jìn)行電泳。2）當(dāng)DNA進(jìn)入低熔點(diǎn)膠中心時(shí)停頓電泳。紫外燈下切下目標(biāo)條帶低熔點(diǎn)膠。3)將切下膠放到離心管中，加入200μｌＴＥ緩沖液，65℃溫浴3分鐘以融化低熔點(diǎn)膠。4)然后分別用酚/氯仿，氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃沉淀DNA2h以上，12000rpm離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌，吹干后溶于10μl無(wú)菌水中。注意事項(xiàng)：在紫外燈下切出含有目標(biāo)DNA片段瓊脂糖凝膠時(shí)應(yīng)注意要快速操作，以免損傷ＤＮＡ。31基因工程制胰島素專家講座第31頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段5.2對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)置四種相互獨(dú)立測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不一樣ddNTP作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一引物延伸鏈，經(jīng)過(guò)高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按5’至3’方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈序列。32基因工程制胰島素專家講座第32頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段5.2對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序33基因工程制胰島素專家講座第33頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段5.3DNA序列糾錯(cuò)1、將待突變基因克隆到突變載體上；2、制備含突變基因單鏈模板；3、人工合成一段改變了堿基次序寡核苷酸片段，以此作為引物，在體外合成互補(bǔ)鏈，取得含有錯(cuò)配堿基完整雙鏈M13DNA4、轉(zhuǎn)化和初步篩選異源雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，產(chǎn)生野生型、突變型同源雙鏈DNA分子。5、用誘變寡核苷酸引物作為探針，經(jīng)過(guò)雜交即可判定出突變體34基因工程制胰島素專家講座第34頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段6、目標(biāo)基因經(jīng)過(guò)細(xì)胞克隆擴(kuò)增6.1目標(biāo)基因與運(yùn)載體結(jié)合6.2將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增6.3篩選取得了重組DNA分子受體細(xì)胞克隆35基因工程制胰島素專家講座第35頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段6.1目標(biāo)基因與運(yùn)載體結(jié)合用與提取目標(biāo)基因相同限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口；將目標(biāo)基因插入切口處，讓目標(biāo)基因黏性末端與切口上黏性末端互補(bǔ)配對(duì)；在連接酶作用下連接形成重組DNA分子。36基因工程制胰島素專家講座第36頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段6.2將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增要讓目標(biāo)基因表示，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增。為取得目標(biāo)基因表示產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌等無(wú)害易得細(xì)菌為受體。注意：為改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改進(jìn)生物細(xì)胞為受體。為使重組DNA分子更輕易進(jìn)入受體細(xì)胞，通常還要用一些物質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理，使受體細(xì)胞含有更大通透性，比如改變PH值，加入氯化鈣等。37基因工程制胰島素專家講座第37頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段6.3篩選取得重組DNA分子受體細(xì)胞克隆前幾步處理十分繁鎖，為確保目標(biāo)基因得到有效利用，通慣用大量受體細(xì)胞來(lái)接收不多目標(biāo)基因。這么，處理受體細(xì)胞中真正攝入了目標(biāo)基因極少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。細(xì)菌檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目標(biāo)基因表示產(chǎn)物。淘汰無(wú)表示產(chǎn)物菌落，保留有表示產(chǎn)物深入培養(yǎng)、研究。多細(xì)胞生物檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目標(biāo)基因，攝入基因是否表示（是否表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)性狀）。38基因工程制胰島素專家講座第38頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段7、目標(biāo)基因回收及DNA測(cè)序，最終目標(biāo)基因獲取7.1內(nèi)容物釋放將培養(yǎng)物加入試管，加入EDTA及去污劑（ＳＤＳ），用堿處理細(xì)菌，使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（在強(qiáng)堿環(huán)境下，宿主菌線性雙鏈DNA片段中氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNA共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈并不完全分離）。39基因工程制胰島素專家講座第39頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段7、目標(biāo)基因回收及DNA測(cè)序，最終目標(biāo)基因獲取7.2加酸、離心然后加入高濃度酸性鹽，PH恢復(fù)至中性（變性染色體DNA與變性蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物，而質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中），經(jīng)過(guò)離心把染色體DNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。40基因工程制胰島素專家講座第40頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段7、目標(biāo)基因回收及DNA測(cè)序，最終目標(biāo)基因獲取7.3切割、電泳利用限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別DNA特異核苷酸序列，并切割DNA，產(chǎn)生一定長(zhǎng)度DNA片段，經(jīng)過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析能夠判別目標(biāo)基因41基因工程制胰島素專家講座第41頁(yè)2024/4/18一、獲取外源目標(biāo)基因片段7、目標(biāo)基因回收及DNA測(cè)序，最終目標(biāo)基因獲取7.4回收純化、測(cè)序?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行回收純化，再測(cè)序42基因工程制胰島素專家講座第42頁(yè)2024/4/18二.表示載體構(gòu)建pET28a（含有T7噬菌體開(kāi)啟子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、His6標(biāo)簽序列、凝血酶切割位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、T7噬菌體終止子、乳糖阻遏序列、pBR322復(fù)制子ori、fl噬菌體復(fù)制子、卡那霉素篩選標(biāo)識(shí)序列等。）43基因工程制胰島素專家講座第43頁(yè)2024/4/18二.表示載體構(gòu)建44基因工程制胰島素專家講座第44頁(yè)原因：1.T7噬菌體開(kāi)啟子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等引導(dǎo)目標(biāo)基因高效轉(zhuǎn)錄和翻譯。2.乳糖操縱子和乳糖阻遏序列存在意義主要在于，當(dāng)目標(biāo)蛋白對(duì)大腸桿菌有毒性時(shí)候，能夠經(jīng)過(guò)添加阻遏物，控制目標(biāo)蛋白以較低水平表示。3.His6標(biāo)簽序列、凝血酶切割位點(diǎn)存在意義主要在于方便利用針對(duì)His6整合層析分離純化蛋白、然后利用凝血酶去除切割標(biāo)簽蛋白。4.卡那霉素抗性基因編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。2024/4/18二.表示載體構(gòu)建45基因工程制胰島素專家講座第45頁(yè)2024/4/18三.重組目標(biāo)DNA片段和表示載體用T7噬菌體DNA連接酶將質(zhì)粒載體pET28a經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切片段與目標(biāo)基因經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切片段連接起來(lái)，組成重組DNA分子。使用雙酶切：DNA分子重組時(shí)為了確保目標(biāo)片段以正確方向連接進(jìn)入載體，往往盡可能選擇兩種含有不一樣黏性末端酶分別酶切目標(biāo)DNA分子和載體，這種雙酶切即使使載體和目標(biāo)DNA都產(chǎn)生兩種不一樣黏性末端，不過(guò)連接酶會(huì)選擇把相同黏性末端連接起來(lái)，從而確保目標(biāo)基因只以一個(gè)方向連接入載體。46基因工程制胰島素專家講座第46頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞1、選擇大腸桿菌2、培養(yǎng)大腸桿菌2024/4/1847基因工程制胰島素專家講座第47頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞1、選擇大腸桿菌原因：1）繁殖快速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定2）基因克隆及表示系統(tǒng)成熟完善3）全基因組測(cè)序完成，共有4405個(gè)開(kāi)放性閱讀框架4）被美國(guó)FDA同意為安全基因工程受體生物2024/4/1848基因工程制胰島素專家講座第48頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞開(kāi)放閱讀框（ORF）是生物個(gè)體基因組中，可能是蛋白質(zhì)編碼序列部分。基因中ORF包含并位于開(kāi)始編碼與終止編碼之間。因?yàn)橐欢蜠NA或RNA序列有各種不一樣讀取方式，所以可能同時(shí)存在許多不一樣開(kāi)放閱讀框架。開(kāi)放閱讀框包含一段能夠編碼蛋白堿基序列，不能被終止子打斷。2024/4/1849基因工程制胰島素專家講座第49頁(yè)2、大腸桿菌培養(yǎng)（1）LB（Luria-Bertain)液體培養(yǎng)基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%氯化鈉1.0%攪拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培養(yǎng)基）調(diào)pH至7.0，如用進(jìn)口試劑可無(wú)須調(diào)，高壓滅菌20min(120℃0.1Mpa)

四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1850基因工程制胰島素專家講座第50頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1851（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組成成份：牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,瓊脂15～20g,水1000mL,PH7.4～7.6。詳細(xì)配置步驟：1.稱藥品按實(shí)際用量計(jì)算后,按配方稱取各種藥品放入大燒杯中.牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯;也可放在稱量紙上稱量,隨即放入熱水中,牛肉膏使與稱量紙分離,馬上取出紙片.蛋白胨極易吸潮,故稱量時(shí)要快速。基因工程制胰島素專家講座第51頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1852詳細(xì)配置步驟：2.加熱溶解在燒杯中加入少于所需要水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量.若配制固體培養(yǎng)基,則將稱好瓊脂放入己溶解藥品中,再加熱融化,此過(guò)程中,需不停攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最終補(bǔ)足所失水分。

3.調(diào)pH檢測(cè)培養(yǎng)基pH,若pH偏酸,可滴加lmol/LNaOH,邊加邊攪拌,并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè),直至到達(dá)所需pH范圍.若偏堿,則用lmol/LHCl進(jìn)行調(diào)整.pH調(diào)整通常放在加瓊脂之前.應(yīng)注意pH值不要調(diào)過(guò)頭,以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子濃度?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第52頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1853詳細(xì)配置步驟：4.過(guò)濾液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾,固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾,以利培養(yǎng)觀察.不過(guò)供普通使用培養(yǎng)基,這步可省略。5.分裝按試驗(yàn)要求,可將配制培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi).分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染.分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度l/5,滅菌后制成斜面.分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超出其容積二分之一為宜.半固體培養(yǎng)基以試管高度1/3為宜,滅菌后垂直待凝?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第53頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1854詳細(xì)配置步驟：6.加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作棉塞.棉塞形狀,大小和松緊度要適當(dāng),四面緊貼管壁,不留縫隙,才能起到預(yù)防雜菌侵入和有利通氣作用.要使棉塞總長(zhǎng)約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi),以防棉塞脫落.有些微生物需要更加好通氣,則可用8層紗布制成通氣塞.有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。

7.包扎加塞后,將三角瓶棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙,以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞.若培養(yǎng)基分裝于試管中,則應(yīng)以5支或7支在一起,再于棉塞外包一層牛皮紙,用繩扎好.然后用記號(hào)筆注明,培養(yǎng)基名稱,組別,日期。

基因工程制胰島素專家講座第54頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1855詳細(xì)配置步驟：8.滅菌將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min.如因特殊情況不能及時(shí)滅菌,則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。

9.無(wú)菌檢驗(yàn)將滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h,無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用,或貯存于冰箱或清潔櫥內(nèi),備用。

基因工程制胰島素專家講座第55頁(yè)四、選擇與獲取表示細(xì)胞2024/4/1856大腸桿菌培養(yǎng)：采取劃痕接種法。用接種環(huán)從菌種中沾取少許菌液，劃線。37攝氏度，恒溫培養(yǎng)48到72小時(shí)，因?yàn)榻臃N時(shí)和詳細(xì)培養(yǎng)條件不一樣，其生長(zhǎng)普通都在2天外才能長(zhǎng)出顯著菌落。菌落特征：乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和后面顏色一致?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第56頁(yè)五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞氯化鈣轉(zhuǎn)化法

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久大腸桿菌經(jīng)冰浴氯化鈣低滲溶液處理，其細(xì)胞膜通透性增加，成為感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于輕易吸收外源DNA一個(gè)生理狀態(tài)），加入重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒與鈣離子形成復(fù)合物并粘附于細(xì)菌細(xì)胞膜表面，經(jīng)42℃熱休克處理，細(xì)胞膜通透性增加，重組質(zhì)粒DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞（導(dǎo)入重組體）。細(xì)菌在不含抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，使含有重組質(zhì)粒細(xì)胞復(fù)原并表示抗生素抗性基因，涂布于含有抗生素培養(yǎng)板上，生長(zhǎng)得到轉(zhuǎn)化子。2024/4/1857基因工程制胰島素專家講座第57頁(yè)氯化鈣法轉(zhuǎn)化原理機(jī)制：在0℃CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，Ca2+

使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中部分核酸酶解離，誘導(dǎo)形成感受態(tài)。另外，Ca2+能與加入DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶羥基－磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜外表面；42℃熱激處理，細(xì)胞膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動(dòng)，出現(xiàn)間隙。五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1858基因工程制胰島素專家講座第58頁(yè)氯化鈣轉(zhuǎn)化法關(guān)鍵點(diǎn)：1.氯化鈣（二價(jià)鈣離子）作用：提升細(xì)胞壁（膜）通透性；2.熱激后快速轉(zhuǎn)移到冰上：促使質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入胞內(nèi)；3.這種轉(zhuǎn)化方法適合用于雙鏈環(huán)狀DNA（質(zhì)粒），線型DNA不能采取此法。（在自然界自然發(fā)生轉(zhuǎn)化過(guò)程中，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中為單鏈DNA。）五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1859基因工程制胰島素專家講座第59頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA、重組質(zhì)粒DNA、大腸桿菌JM109、離心機(jī)、0.1mol/LCaCl2

、LB培養(yǎng)基、微量移液器、微量離心管、抗生素、20mmol/LMgSO4、微孔濾膜及濾器、培養(yǎng)皿、三角瓶、恒溫水浴箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、玻璃涂布棒、95%乙醇試驗(yàn)材料：五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1860基因工程制胰島素專家講座第60頁(yè)注意事項(xiàng)：①質(zhì)粒質(zhì)量和濃度。用于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。②試劑質(zhì)量。所用試劑均需要最高純度，并用超純水新鮮配制，滅菌備用。③預(yù)防雜菌和雜DNA污染。五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1861基因工程制胰島素專家講座第61頁(yè)二價(jià)鈣離子對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響熱激溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1862基因工程制胰島素專家講座第62頁(yè)感受態(tài)細(xì)胞制備：1、從新活化E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久(12h左右)；2、將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測(cè)一次OD600，至OD600為0.3～0.5時(shí)停頓培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5mL離心管中；3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；4、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰涼0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞,冰浴20分鐘；五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1863基因工程制胰島素專家講座第63頁(yè)5、0～4℃，4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0mL冰涼0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min；6、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入100μL冰涼0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；制備好感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，假如在4℃放置12～24h，其轉(zhuǎn)化效率能夠增高4～6倍；也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過(guò)甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保留六個(gè)月至一年。五、重組DNA導(dǎo)入表示細(xì)胞2024/4/1864基因工程制胰島素專家講座第64頁(yè)2024/4/18六、重組體細(xì)胞篩選純化判定在重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞試驗(yàn)中，因?yàn)橹亟M率很低，所以需要從這些細(xì)胞中篩選出期望重組子，將轉(zhuǎn)化后細(xì)胞涂布于特定固體培養(yǎng)板，生長(zhǎng)出單菌落或噬菌斑深入篩選和判定。65基因工程制胰島素專家講座第65頁(yè)2024/4/181、載體遺傳標(biāo)識(shí)法（抗生素抗性篩選法、營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型篩選法、噬菌斑篩選法、互補(bǔ)篩選法）2、核酸分子雜交法菌落原位雜交：制備與目標(biāo)基因某一區(qū)域同源探針序列，依據(jù)核酸雜交原理，探針序列特異性雜交目標(biāo)基因，并經(jīng)過(guò)放射性同位素或熒光基團(tuán)進(jìn)行定位檢測(cè)。六、重組體細(xì)胞篩選純化判定66基因工程制胰島素專家講座第66頁(yè)2024/4/183、目標(biāo)基因表示產(chǎn)物測(cè)定法假如重組DNA目標(biāo)基因能在宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)，且宿主細(xì)胞本身不含該蛋白質(zhì)，那么能夠經(jīng)過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)生物功效或結(jié)構(gòu)來(lái)篩選和判定重組子。六、重組體細(xì)胞篩選純化判定67基因工程制胰島素專家講座第67頁(yè)用熒光原位標(biāo)識(shí)篩選重組體1、制備核酸探針，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢所需寡核苷酸探針資料，用ＤＮＡ合成儀合成，然后用熒光素進(jìn)行標(biāo)識(shí)。２、將樣品進(jìn)行打壞、離心、清洗等步驟，使微生物細(xì)胞與雜質(zhì)進(jìn)行分離，同時(shí)增大細(xì)胞壁通透性，確保探針?biāo)憷M(jìn)入與ＤＮＡ雜交。３、配置雜交液，其中雜交液中甲酰胺濃度直接影響雜交特異性，將雜交液與樣品之一雜交爐（避光、密封），雜交完成后用洗脫液（ＳＥＴ或ＳＳＣ）將多出探針除去。４、加少許苯二胺－甘油溶液覆蓋樣品，預(yù)防熒光淬滅，再封片，用熒光顯微鏡觀察、攝影進(jìn)行分析。六、重組體細(xì)胞篩選純化判定2024/4/1868基因工程制胰島素專家講座第68頁(yè)熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交是一個(gè)非放射性原位雜交方法，將熒光標(biāo)識(shí)探針與待測(cè)序列進(jìn)行雜交，依據(jù)雜交信號(hào)有沒(méi)有及類型到達(dá)診療目標(biāo)。原理：基于堿基互補(bǔ)配正確標(biāo)準(zhǔn)，用熒光素標(biāo)識(shí)已知外源DNA或RNA作探針，與載玻片上組織切片等雜交，與待測(cè)核酸靶序列專一性結(jié)合，經(jīng)過(guò)檢測(cè)雜交位點(diǎn)熒光來(lái)顯示特定核苷酸序列存在、數(shù)目和定位。六、重組體細(xì)胞篩選純化判定2024/4/1869基因工程制胰島素專家講座第69頁(yè)2024/4/18產(chǎn)物1.菌種RRhPIZpQE-40E．coliM15菌株70七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第70頁(yè)2024/4/182.材料與試劑

DEAE-SepharoseFF(瓊脂糖快流速陰離子交換劑)為杭州爭(zhēng)光樹(shù)脂有限企業(yè)產(chǎn)品,SephadexG-25為Sigma企業(yè)產(chǎn)品，Superdex75為GE企業(yè)產(chǎn)品,溶菌酶、脫氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均為Sigma企業(yè)產(chǎn)品,谷胱甘肽[氧化型(GSSG)和還原型(GSH)]為上海博奧生物科技有限企業(yè)產(chǎn)品，二硫蘇糖醇(DTY)為OrganicsInc產(chǎn)品,13-巰基乙醇和異丙基-13-D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG)為BB1分裝,胰蛋白胨、酵母粉（英國(guó)Oxiod企業(yè)）,氨芐青霉素（美國(guó)Sigma企業(yè)）,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。71七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第71頁(yè)2024/4/18培養(yǎng)基：（１）LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl10.0,pH7.0;（２）發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4,甘油15,酵母粉30,蛋白胨30,Na2HPO412,KH2PO46,NH4Cl1,NaCl2,MgSO40.48,pH7.0;（３）甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):甘油300,酵母汁150,MgSO410,pH7.0。全部培養(yǎng)基使用前均加入氨芐青霉素至終濃度50mg/L。水平恒溫?fù)u床（德國(guó)Therma企業(yè)）；BiostatB發(fā)酵系統(tǒng)（德國(guó)Braun企業(yè)）；蛋白質(zhì)電泳凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene企業(yè)）。72七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第72頁(yè)2024/4/183.細(xì)菌培養(yǎng)和RRhPI表示采取二級(jí)發(fā)酵方式，用正交法優(yōu)化培養(yǎng)條件，并將優(yōu)化條件用于發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，收獲濕菌體。RRhPIZpQE-40E．coliM15發(fā)酵罐培養(yǎng)：將lOlId經(jīng)過(guò)活化RRhPI／pQE-40E．coliM15轉(zhuǎn)移至100ml培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將其轉(zhuǎn)移至含有1.5L培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，培養(yǎng)一段時(shí)間(轉(zhuǎn)速為300r/min，通氣量為1:1.5-1:1.8)，過(guò)程中加人一定量新鮮培養(yǎng)基并用NaOH調(diào)整pH，之后加入IPTG并升溫誘導(dǎo)RRhPI表示，轉(zhuǎn)速隨即調(diào)為400-500r／min，增大通氣量至1:1.8-1：2.0，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，搜集菌體。73七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第73頁(yè)2024/4/184.包涵體搜集和洗滌將搜集濕菌體凍存于-2O℃，然后懸浮于緩沖液A(50mmol/Lrifs-HC1，0.5mmol/LEDTA，50mmol/LNaC1，5％甘油，0.1-0.5mmol/LDTY，pH7.9)(5-6ml/g濕菌)中，加入溶菌酶(5mg/g濕菌體)，室溫或37℃振蕩2h。冰浴超聲10S×30次，其間每次間隔20S，功率為200W。10℃條件下1000g離心5min去除細(xì)胞碎片。上清液中包涵體(Inclusionbody,IB)在4℃條件下27000g離心15min搜集，然后用含2mol/L尿素緩沖液A充分懸浮，室溫靜置30min后4℃條件下17000g離心15min，搜集沉淀。沉淀再用含2％脫氧膽酸鈉緩沖液A充分懸浮，4℃條件下17000g離心l5min，搜集沉淀。最終沉淀用10mmol/Lrifs-HC1,pH7.3洗滌兩次(4℃,17000g離心15min)。74七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第74頁(yè)2024/4/18注意事項(xiàng)：細(xì)胞內(nèi)表示最大問(wèn)題就是輕易形成不溶性包涵體,它形成對(duì)表示產(chǎn)物活性不利。75七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第75頁(yè)2024/4/18包涵體(inclusionbody)是細(xì)菌表示蛋白質(zhì)在胞內(nèi)相互凝集而形成無(wú)活性固體顆粒。含有很強(qiáng)折光性。正常大腸桿菌基因以重組方法使其在大腸桿菌內(nèi)表示也會(huì)形成包涵體。說(shuō)明不但僅是外源蛋白才能形成包涵體,同時(shí)也發(fā)覺(jué)有表示量較低基因產(chǎn)物也是以不可溶形式存在。包涵體形成不但僅與宿主細(xì)胞、表示基因相關(guān),還與培養(yǎng)外環(huán)境相關(guān)系。其形成原因多數(shù)認(rèn)為:目標(biāo)基因過(guò)分表示使蛋白質(zhì)無(wú)足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊,產(chǎn)生凝集。重組蛋白所處環(huán)境條件對(duì)包涵體也有較大影響,如當(dāng)溫度超出某一個(gè)蛋白質(zhì)變性溫度時(shí),伴隨溫度增加凝集量也增加。當(dāng)環(huán)境PH靠近某一個(gè)蛋白等電點(diǎn)時(shí),蛋白凝集增加,包涵體形成也增多,另外,離子組成和強(qiáng)度、輔助因子、氧化還原電位等均可影響包涵體形成。76七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第76頁(yè)2024/4/18應(yīng)對(duì)方案：

改變發(fā)酵條件,如發(fā)酵溫度、培養(yǎng)PH值等來(lái)降低重組蛋白凝集,進(jìn)而有效控制包涵體形成,給下游純化工作創(chuàng)造有利條件。77七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第77頁(yè)2024/4/185.RRhPI初步純化將搜集IB用含有0.1％-0.3％13-巰基乙醇緩沖液B(30mmol/L

HC1,8mol/L尿素,pH8.0)溶解,上于已用緩沖液B平衡DEAE-SepharoseFF柱,用適當(dāng)氯化鈉梯度洗脫,搜集含RRhPI洗脫液。6.RRhPI重組復(fù)性將初步純化后RRhPI經(jīng)過(guò)SephadexG-25脫尿素,轉(zhuǎn)換緩沖液為不一樣pH50mmol/LGly-NaOH重組液,或含有適量GSSGGly-NaOH緩沖液中,使蛋白終濃度為0.1-0.6mg/mL，搜集趨于正確折疊RRhPI單體組分,加人適量GSH和GSSG，4℃放置24h。78七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第78頁(yè)2024/4/187.酶切轉(zhuǎn)化向RRhPI復(fù)性液中加入一定量胰蛋白酶和羧肽酶B，37℃酶切一段時(shí)間,然后用0.1mol/LZnC1終止反應(yīng)并沉淀生成hI。8.hI純化將hI粗品用30mmol/LTris2HCl,8mol/L尿素,pH8.0溶解,在Superdex75上進(jìn)行分離純化。79七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第79頁(yè)2024/4/18分離純化層析柱平衡液和洗脫液均為0.2mol/L乙酸鈉二乙酸,pH4.0用0.1mol/LZnCl2沉淀hI粗產(chǎn)品可經(jīng)過(guò)Superdex75進(jìn)行純層析圖譜見(jiàn)圖1,hI主要集中在峰3。搜集峰3進(jìn)行SDS2PAGE分析,結(jié)果顯示,見(jiàn)圖2,所得hI組份在SDS2PAGE分析中是均一,只有一條蛋白帶。將峰3組分透析,濃縮并凍干,即可最終制得hI。圖1：Superdex75純化hI

圖2十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)80七、工程菌產(chǎn)物判定和保留基因工程制胰島素專家講座第80頁(yè)產(chǎn)物深入判定：（1）氨基酸組成測(cè)定取純化胰島素,經(jīng)5.7mol/L鹽酸水解,用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸組成。（2）與人胎盤細(xì)胞膜胰島素受體結(jié)合（3）胰島素生物活力測(cè)定體內(nèi)活力用半定量小白鼠驚厥方法測(cè)定。七、工程菌產(chǎn)物判定和保留2024/4/1881基因工程制胰島素專家講座第81頁(yè)常見(jiàn)保藏方法有以下幾個(gè)：（1）短期保留能夠用瓊脂穿刺進(jìn)行（2）長(zhǎng)久保留大多采取低溫保留，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，離心后加一定菌種保藏液（含甘油），在-20℃下保藏。（3）用液氮快速冷卻，減壓升華去除水之后在-80℃下保留七、工程菌產(chǎn)物判定和保留2024/4/1882基因工程制胰島素專家講座第82頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)流程設(shè)計(jì)83基因工程制胰島素專家講座第83頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)流程設(shè)計(jì)84基因工程制胰島素專家講座第84頁(yè)2024/4/18生產(chǎn)工藝流程功效間分布八、發(fā)酵培養(yǎng)85基因工程制胰島素專家講座第85頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程功效間分布86基因工程制胰島素專家講座第86頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)87搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)搖瓶培養(yǎng)水平下,用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和比濁法測(cè)RRhPI-pQE40E.coliM15生長(zhǎng)曲線?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第87頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)88搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)挑取斜面保留RRhPI-pQE40E.coliM15一環(huán)接種于3mlLB/AK培養(yǎng)基中，37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間。取100μl菌液接種于5mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間即可?；罨N子可在4℃下保留數(shù)周待用?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第88頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)89搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)將5ml活化種子轉(zhuǎn)接到50ml優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間。取50ml經(jīng)一級(jí)發(fā)酵擴(kuò)培后菌液轉(zhuǎn)接到500ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間后加入IPTG誘導(dǎo)人胰島素原表示,繼續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間后結(jié)束發(fā)酵。3×103r·min-1離心15min,沉淀即得RRh2PI-pQE40E.coliM15濕菌體,于-20℃保留?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第89頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)90搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)采取正交法,結(jié)合搖瓶發(fā)酵工藝前期研究,選取搖瓶培養(yǎng)條件中7個(gè)主要原因進(jìn)行兩水平正交優(yōu)化,7個(gè)原因?yàn)榉N子活化方式、搖床轉(zhuǎn)速(通風(fēng)量)、IPTG誘導(dǎo)溫度、接種量、IPTG添加量、誘導(dǎo)時(shí)間和補(bǔ)料方式。以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體量及發(fā)酵液A600為目標(biāo)量考查條件優(yōu)化效果。基因工程制胰島素專家講座第90頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)91搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行8次試驗(yàn),對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,優(yōu)化出最正確試驗(yàn)條件,并做3次水平重復(fù)試驗(yàn),分別測(cè)定每升培養(yǎng)基收獲濕菌體量、發(fā)酵液A600及每升培養(yǎng)基收獲包涵體量。IPTG誘導(dǎo)基因工程大腸桿菌表示RRhPI。對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間影響深入做了分析,基因工程菌在三角搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI表示情況?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第91頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)92搖瓶發(fā)酵結(jié)果在搖瓶培養(yǎng)水平下,采取優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵RRhPI-pQE40E.coliM15,培養(yǎng)4h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久,而且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久可延至17h。基因工程制胰島素專家講座第92頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)93搖瓶發(fā)酵結(jié)果采取優(yōu)化出最正確試驗(yàn)條件做3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表。

基因工程制胰島素專家講座第93頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)94搖瓶發(fā)酵結(jié)果綜合每升培養(yǎng)基所收獲濕菌體量(wetweight/g·L-1)和發(fā)酵液A600兩個(gè)指標(biāo),選取關(guān)鍵原因最優(yōu)條件,結(jié)果表明搖床轉(zhuǎn)速(即通風(fēng)量)與補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大,IPTG誘導(dǎo)時(shí)間和添加量次之。

基因工程制胰島素專家講座第94頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)95搖瓶發(fā)酵結(jié)果正交試驗(yàn)所得菌體經(jīng)溶菌酶或/聲破碎細(xì)胞后得到包涵體SDS結(jié)果見(jiàn)圖?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第95頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)96搖瓶發(fā)酵結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15表示外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在,其分子大小約為13kD,由圖可知,在哪種正交試驗(yàn)條件下包涵體表示量較高?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第96頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)97搖瓶發(fā)酵結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15在搖瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI表示情況(如圖)?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第97頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)98搖瓶發(fā)酵結(jié)果結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15在IPTG誘導(dǎo)4～5h時(shí),富含包涵體濕菌體(約24kD)收率較高,對(duì)應(yīng)目標(biāo)蛋白表示量較高,繼續(xù)誘導(dǎo)并未使?jié)窬w表示量有所提升。所以,誘導(dǎo)3.5～4h現(xiàn)有利于富含包涵體濕菌體及目標(biāo)蛋白表示,又可縮短發(fā)酵時(shí)間,簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第98頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)99細(xì)胞兩種破碎方法其一是溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞。發(fā)酵所得RRhPI-pQE40E.coliM15濕菌體,懸浮于適量緩沖液A(50mmol·L-1Tris-HCl、0.5mmol·L-1EDTA、50mmol·L-1NaCl、5%甘油、0.1～0.5mmol·L-1DTT、pH7.90)中,加入溶菌酶(5mg·g-1濕菌體),室溫或37℃振蕩2h。在冰浴中超聲(10s×30),每次間隔20s,功率200W?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第99頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)100細(xì)胞兩種破碎方法其二是超聲破碎細(xì)胞。大腸桿菌濕菌體懸浮于適量緩沖液A中,充分溶解,冰浴超聲(40s×10),每次間隔30s,功率200W?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第100頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)101細(xì)胞兩種破碎方法兩種破碎方法所得包涵體洗滌后作SDS。洗滌時(shí)均先后用含2mol·L-1尿素緩沖液和含2%脫氧膽酸鈉(DOC)緩沖液各洗滌1次,最終用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第101頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)102包涵體三種洗滌方法溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞裂解液于4℃、114×104r·min-1離心15min,搜集沉淀。洗滌方法一是將此沉淀用2mol·L-1尿素緩沖液充分溶解,離心搜集沉淀;沉淀再用2%DOC緩沖液洗滌,離心,所得沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵體,于-20℃保留?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第102頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)103包涵體三種洗滌方法方法二則用緩沖液充分洗滌沉淀兩次,搜集沉淀保留。方法三用2%DOC緩沖液洗滌1次。再用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次,離心搜集沉淀保留。取上述不一樣方法洗滌沉淀,用SDS檢測(cè)洗滌效果?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第103頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)104結(jié)果說(shuō)明“1.2.3”項(xiàng)中破碎方法一很好,即用溶菌酶和超聲破碎結(jié)合可徹底破碎細(xì)胞,并使表示產(chǎn)物包涵體充分溶出?！?.2.4”項(xiàng)中方法一洗滌效果優(yōu)于方法二和三,即采取變性劑2mol·L-1尿素及離子型去污劑2%DOC洗滌效果很好?；蚬こ讨埔葝u素專家講座第104頁(yè)2024/4/18菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

將凍存工程菌復(fù)蘇后接種于LB平板培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h,挑取單菌落接種于5mLLB液體培養(yǎng)基,37℃250r/min振蕩12h后,按1:100百分比轉(zhuǎn)種于LB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)振蕩10h作為發(fā)酵種子液。八、發(fā)酵培養(yǎng)105發(fā)酵步驟基因工程制胰島素專家講座第105頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)106發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐選取培養(yǎng)設(shè)備以及設(shè)備控制應(yīng)滿足取得高濃度受體細(xì)胞和高表示基因表示產(chǎn)物。發(fā)酵罐組成部分：發(fā)酵罐體、確保高傳質(zhì)作用攪拌器、精細(xì)溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)（如pH、O2、CO2等）、培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。

發(fā)酵步驟基因工程制胰島素專家講座第106頁(yè)2024/4/18八、發(fā)酵培養(yǎng)107發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵步驟基因工程制胰島素專家講座第107頁(yè)2024/4/18發(fā)酵罐發(fā)酵采取自控5L發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn),初始工作體積為3.0L。設(shè)置指標(biāo)為:發(fā)酵溫度37℃,初始攪拌速度400r/min,初始通氣量1.5L/min,不停提升攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量最大分別至650r/min和3.5L/min以維持溶解氧一直在30%以上,pH值誘導(dǎo)前為7.2,誘導(dǎo)后為7.4。培養(yǎng)分分批培養(yǎng)和分批補(bǔ)料兩個(gè)階段,每隔1h取樣測(cè)定A650nm、細(xì)胞干重和葡萄糖濃度等參數(shù)。當(dāng)檢測(cè)到培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡時(shí)開(kāi)始采取pH-stat反饋流加方式補(bǔ)料,即當(dāng)發(fā)酵液pH到達(dá)7.4時(shí)設(shè)定pH反饋,高于設(shè)定pH即開(kāi)始補(bǔ)加發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基,直至到達(dá)設(shè)定pH時(shí)停頓流加;補(bǔ)料總量為發(fā)酵液總體積20%。誘導(dǎo)后培養(yǎng)5-7h,放罐,SDS檢測(cè)表示情況。八、發(fā)酵培養(yǎng)108發(fā)酵步驟基因工程制胰島素專家講座第108頁(yè)2024/4/18高密度發(fā)酵補(bǔ)料控制工藝

以甘油作為限制性基質(zhì)進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵,分別考查不一樣補(bǔ)料模式對(duì)工程菌生長(zhǎng)和重組蛋白表示影響:(1)恒速補(bǔ)料法在開(kāi)始誘導(dǎo)后,分別依照恒定速度(10,20,30,40mL/h)流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)流加氨水和稀鹽酸控制pH值。(2)分階段變速補(bǔ)料法在開(kāi)始誘導(dǎo)后,以20mL/h初速度流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基,并以5mL/h增加速度,逐步提升補(bǔ)料速度。(3)恒定pH反饋補(bǔ)料法在發(fā)酵不一樣階段設(shè)定培養(yǎng)環(huán)境pH(初始培養(yǎng)期以發(fā)酵培養(yǎng)基pH7.0為設(shè)定值,誘導(dǎo)期pH依據(jù)分批培養(yǎng)結(jié)果設(shè)定為其最正確值),用甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基維持不一樣時(shí)期系統(tǒng)pH相對(duì)恒定。八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵步驟109基因工程制胰島素專家講座第109頁(yè)2024/4/18高密度發(fā)酵影響條件1.培養(yǎng)基組成：（1）碳源大腸桿菌高密度高表示發(fā)酵控制中優(yōu)化碳源是關(guān)鍵原因。慣用碳源有糖類、低碳醇、油脂和有機(jī)酸等。因?yàn)榇竽c桿菌利用葡萄糖生長(zhǎng)速度快,而且測(cè)定方便,葡萄糖是當(dāng)前大腸桿菌發(fā)酵中最慣用碳源物質(zhì)。但葡萄糖添