細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)

主要內(nèi)容7.1花藥培養(yǎng)7.2花粉培養(yǎng)7.3花藥和花粉培養(yǎng)中白化苗問題7.4操作實例細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第1頁植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史

Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）

Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生基因頻率較低，效率極低）

80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)快速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。

90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第2頁花粉和花藥區(qū)分二者異同點1.培養(yǎng)目標相同，均取得小孢子植株。2.花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培3.花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；能觀察雄核發(fā)育全過程，單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復雜。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第3頁花粉和花藥培養(yǎng)作用1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年取得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。供體植株小孢子（n）花粉植株（n）加倍純合植株DH（2n）花培雄核發(fā)育自然加倍人工一年內(nèi)取得純系細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第4頁（2）提升了目標基因型選擇效率

例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)概率為1/16，而且不能將AAbb與Aabb區(qū)分開。ABAbaBabABAABBAABbAaBBAaBbAbAABbAAbbAaBbAabbaBAaBBAaBbaaBbaaBbabAaBbAabbaaBbaabb細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第5頁（3）誘變育種中作用植株不受顯隱性影響，在誘變育種中能在當代及時取得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定純系。

細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第6頁花藥離體培養(yǎng)過程：

細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第7頁7.1花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)：是指把發(fā)育到一定階段花藥接種在適宜培養(yǎng)基上，使其中花粉發(fā)育成單倍體植株過程?；ㄋ幣囵B(yǎng)過程主要步驟：1、選取花粉單核期花蕾和幼穗；2、進行適當預(yù)處理；3、對外植體進行表面消毒；4、無菌條件下取出花藥接種到適當培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)；5、花粉胚或花粉愈傷組織發(fā)育到適宜階段后，轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基形成花粉植株；6、在試管苗階段或移栽成活以后進行花粉植株染色體加倍；7、煉苗，移入土壤栽培。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第8頁一、材料選擇花藥外植體選擇是否適當，直接關(guān)系到培養(yǎng)能否功。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第9頁1.供體植株基因型材料遺傳背景對花藥培養(yǎng)影響很大，不一樣植物甚至不一樣品種之間對花藥培養(yǎng)反應(yīng)都有差異，所以選擇適當品種常是培養(yǎng)能否成功關(guān)鍵原因。如水稻中粳稻比秈稻輕易培養(yǎng)。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第10頁2.供體植株生理狀態(tài)供體植物生理對誘導頻率有直接影響。如多年生植物中，幼年植物比老齡植物花藥誘導頻率高；草本植物中生長健壯花藥誘導頻率較高；煙草開花早期花藥比后期更輕易產(chǎn)生花粉植株；供體植株生長條件對花粉發(fā)育及其對離體培養(yǎng)反應(yīng)也有主要影響。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第11頁3.花粉發(fā)育時期不一樣植物花粉對離體培養(yǎng)有其特定最敏感發(fā)育時期，所以，選擇發(fā)育到適當時期花粉是提升花粉植株誘導頻率主要原因。比如煙草和水稻花粉從單核早期至雙核期都可接收誘導；小麥和玉米處于單核期花粉培養(yǎng)效果最好；而天竺葵則從四分體花粉得到最正確效果。對于大多數(shù)植物來說，單核期花粉比較輕易培養(yǎng)。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第12頁發(fā)育時期物種減數(shù)分裂時期草莓、番茄種四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米不一樣物種誘導胚胎發(fā)生最正確小孢子發(fā)育時期細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第13頁檢驗花粉發(fā)育時期方法：染色法：如用醋酸洋紅等染色制片，然后在顯微鏡下觀察。水稻單核靠邊期判定細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第14頁二、預(yù)處理在花藥接種之前，先對其進行預(yù)處理能夠提升誘導率。預(yù)處理方法：1.低溫預(yù)處理：普通可將帶有葉鞘穗子（如稻、麥類）或花蕾（如煙草、油菜等）用紗布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中預(yù)處理。2.高溫預(yù)培養(yǎng)：在花藥分離后，把培養(yǎng)物放置在較高溫度條件下培養(yǎng)一段時間，然后再轉(zhuǎn)移到常溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3.甘露醇預(yù)處理將大麥花藥用過濾除菌0.3mol/L甘露醇溶液預(yù)培養(yǎng)3-5天，然后轉(zhuǎn)移到過濾除菌FHG液體培養(yǎng)基上漂浮培養(yǎng)，其中小孢子散落到培養(yǎng)液中形成大量花粉胚。4.其它方法：離心預(yù)處理、乙烯利預(yù)處理、PEG預(yù)處理及磁場預(yù)處理細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第15頁三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成對花藥培養(yǎng)成功率有顯著影響。1.植物生長物質(zhì)：不一樣植物甚至不一樣品種之間對生長物質(zhì)需求都有可能不一樣。2.碳源：大部分培養(yǎng)基中使用碳源都是以蔗糖來提供，同時它還起著調(diào)整培養(yǎng)基滲透勢作用，不一樣植物及不一樣培養(yǎng)階段對蔗糖濃度要求不一樣。3.其它成份：基本培養(yǎng)基中各無機成份對花藥離體培養(yǎng)中愈傷組織產(chǎn)生有較大影響。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第16頁四、培養(yǎng)方式1.液體培養(yǎng)優(yōu)點：能夠用過濾法除菌，其中生物活性物質(zhì)不會因常規(guī)高壓滅菌而破壞，所以比在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果更加好。缺點:液體培養(yǎng)輕易造成培養(yǎng)物通氣不良，尤其是伴隨愈傷組織重量增加，輕易沉到培養(yǎng)基底部，因為供養(yǎng)較差，可能會對愈傷組織分化能力產(chǎn)生嚴重影響。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第17頁2.雙層培養(yǎng)：固體-液體雙層培養(yǎng)基制作方法是先在35mm×10mm小培養(yǎng)皿中鋪1-1.5mL瓊脂培養(yǎng)基，待固化后在其表面再加0.5mL液體培養(yǎng)基，然后將花藥接種在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。雙層培養(yǎng)優(yōu)點是花藥在培養(yǎng)早期能夠從活性高液體培養(yǎng)基汲取營養(yǎng)，花粉胚長大后不會淹沒。能夠在通氣良好條件下分化成植株。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第18頁3.花藥-花粉分步培養(yǎng)：先將花藥接種在液體培養(yǎng)基（含F(xiàn)icoll）上進行漂浮培養(yǎng)，花粉能夠從花藥中自然釋放出來，散落在液體培養(yǎng)基中。及時用吸管將花粉從液體培養(yǎng)基中取出，植板于瓊脂培養(yǎng)基上，使其處于良好通氣環(huán)境中，可使花粉植株誘導率大大提升。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第19頁4.條件培養(yǎng)利用條件培養(yǎng)基，即預(yù)先培養(yǎng)過花藥液體培養(yǎng)基進行花藥培養(yǎng)，可使花藥培養(yǎng)效率大大提升。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第20頁五、培養(yǎng)條件1.溫度：離體花藥對溫度敏感性比較高。2光照：不一樣植物對光照要求不一樣。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第21頁六、花粉植株倍性及染色加倍花藥植株倍性：花藥培養(yǎng)中，由花粉發(fā)育成花粉植株并不像所期望那樣全是單倍體，其中不但有二倍體還有多倍體和非整倍體?；ǚ壑仓曛谐霈F(xiàn)自然加倍主要是因為核內(nèi)有絲分裂造成，核內(nèi)有絲分裂與接種花粉時期、培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)種類和水平、花粉植株發(fā)生方式及愈傷組織繼代培養(yǎng)時間長短有直接關(guān)系。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第22頁倍性判定方法有：1、染色體直接計數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。

2、間接判定（1）掃描細胞光度儀判定（流式細胞儀）主要測定葉片單個細胞中DNA含量確定細胞倍性，材料使用量可少到1cm2。（2）細胞形態(tài)學判定法單位面積上氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體大小和數(shù)目與倍性含有高度相關(guān)性。（3）植株形態(tài)學判定法葉片保衛(wèi)細胞大小、單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不堅固。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第23頁（4）雜交判定法自交或測交判定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。（5）分子標識判定包含生化標識（如同工酶標識）和分子標識（如RFLP、RAPD、AFLP等）細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第24頁染色體加倍單倍體植株不能正常堅固，只有經(jīng)過染色體加倍、育性才能恢復，而且在遺傳上是純合，為了取得更多二倍體植株，除了有意識利用上述自發(fā)核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生二倍體外，還需要經(jīng)過人工方法使單倍體植株染色體加倍，成為純合二倍體。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第25頁染色體加倍（一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株莖段進行培養(yǎng)，誘導愈傷組織形成。因為單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合二倍體植株。（二）化學試劑誘變有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素誘導（1）浸泡法無菌條件下以一定濃度秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）生長錐處理秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。（3）培養(yǎng)基處理將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。2、除草劑誘導（毒性小，引發(fā)植株變異幾率?。┘毎こ袒ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)第26頁細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第27頁細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第28頁水稻花藥栽培細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第29頁水稻花藥栽培細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第30頁7.2花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)：即小孢子培養(yǎng)，是將花粉粒從花藥中分離出來進行培養(yǎng)技術(shù)，花粉培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)一樣都是取得植物單倍體有效方法。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第31頁一、材料選擇和預(yù)處理和花藥培養(yǎng)類似，供體植株基因型和栽培條件、花粉發(fā)育時期和預(yù)處理等，對花粉培養(yǎng)能否成功有著主要影響。影響原因：1.不一樣植物及同一植物不一樣基因型材料在一樣試驗條件下，花粉培養(yǎng)誘導頻率差異很大。2.供體植物生理狀態(tài)對花粉胚胎發(fā)生也有很大影響。普通從發(fā)育健壯植株上取花粉進行培養(yǎng)效果很好。3.花粉培養(yǎng)還受供體植株生長條件影響，如溫度、光照等原因。選擇適當花粉發(fā)育時期是提升植株花粉誘導頻率主要原因。不一樣作物適宜花粉發(fā)育時期不一樣。和花藥培養(yǎng)一樣，適當預(yù)處理能夠提升花粉培養(yǎng)成功率。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第32頁二、花粉分離所得花粉需滿足以下條件：1.花粉成活率較高2.發(fā)育整齊3.要到達一定數(shù)量4.無菌、無雜質(zhì)分離方法有：1.擠壓法2.散落法3.器械法（1）小型攪拌器（2）超速旋切機假如需要，能夠把以上三種方法分離所得花粉深入用密度梯度離心純化細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第33頁二、花粉培養(yǎng)方法1.培養(yǎng)基和花藥培養(yǎng)類似，花粉培養(yǎng)中多使用過濾除菌液體培養(yǎng)基，其中銨態(tài)氮濃度普通比較低，通常加入一些有機氮源。普通情況下，對于花粉胚狀體發(fā)生所需植物生長物質(zhì)，不一樣種類、濃度效果不一樣，不一樣供體材料反應(yīng)也不一致。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第34頁二、花粉培養(yǎng)方法2.培養(yǎng)方法細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第35頁7.2花藥和花粉培養(yǎng)中白化苗問題植株白化苗現(xiàn)象細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第36頁一、白化苗產(chǎn)生原因1.外因1）光照條件影響2）

溫度條件影響

3）其它環(huán)境原因影響2.內(nèi)因1）葉綠素等光合色素合成酶基因突變2）質(zhì)體分化和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因突變3）其它內(nèi)源原因一些非光合系統(tǒng)蛋白編碼基因突變、葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運受阻和核-基質(zhì)組之間相互作用及不親和性都可能引發(fā)百花現(xiàn)象發(fā)生。細胞工程花藥和花粉培養(yǎng)第37頁二、白化苗控制