深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座

細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)節(jié)問題深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第1頁基礎(chǔ)篇-無菌操作基本技術(shù)1.試驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始試驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以防止失誤混同或細(xì)胞間污染。試驗(yàn)完成后，將試驗(yàn)物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬大，必要物品，比如試管架、吸管吸收器或吸管盒等能夠暫時(shí)放置，其它試驗(yàn)用具用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。試驗(yàn)用具以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。試驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3.小心取用無菌之試驗(yàn)物品，防止造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作試驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡可能勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第2頁4.工作人員應(yīng)注意本身之安全，須穿戴試驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行試驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)尤其小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(最少ClassII)。操作過程中，應(yīng)防止引發(fā)aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，比如DMSO及TPA等，并防止尖銳針頭之傷害等。

5.定時(shí)檢測以下項(xiàng)目：

5.1.CO2鋼瓶之CO2壓力

5.2.CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤水用無菌水，每七天更換)。

5.3.無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定時(shí)更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)。

6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定時(shí)更換水槽水。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第3頁基礎(chǔ)篇-試驗(yàn)用具1.種類︰

1.1.細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)用具均為無菌，除了玻璃容器與pasteurpipet外，其它均為塑料無菌制品。

1.2.TC級培養(yǎng)盤表面都有coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依試驗(yàn)需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料離心管:15ml,50ml，都有2種不一樣材質(zhì)，其中polypropylene(PP)為不透明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依試驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第4頁2.清洗︰

2.1.新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開始使用。

2.2.用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗潔凈，勿加清潔劑清洗。

3.滅菌︰

3.1.試驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃,15lb,20分鐘，置于oven中烘干。

3.2.試驗(yàn)用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170℃,4小時(shí)。

3.3.液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高壓滅菌121℃,15lb,20分鐘處理。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第5頁基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基1.液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱，防止光照，試驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃水槽中溫?zé)帷?/p>

2.液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個(gè)月，期間glutamine可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，能夠再添加適量glutamine。

3.粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：

3.1.細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清，所以粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH之誤差，或局部過堿。所以粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基pH易發(fā)生改變。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第6頁3.2.材料：

純水(milli-Q水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常主要)，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器無菌血清瓶，0.1或0.2mm無菌過濾膜，pH計(jì)，真空泵，CO2氣體

3.3.步驟：

3.3.1.取粉末培養(yǎng)基溶于700mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解。

3.3.2.稱取適量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3-5分鐘。

3.3.3.將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH應(yīng)為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，不然不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦經(jīng)過過濾膜時(shí)，pH會升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm無菌過濾膜過濾滅菌，同時(shí)分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)

3.3.5.配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗(yàn)與污染測試。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第7頁附-配制培養(yǎng)基之生長測試材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步驟：

1.以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKcell，接種MDCK細(xì)胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每個(gè)well接種1×102活細(xì)胞，同時(shí)作對照組試驗(yàn)。

2.接種5～7天后，在100倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長，待細(xì)胞群落大到能夠肉眼觀察，而群落間不相互接觸時(shí)即可。

3.去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜置10min。

4.去除固定液，水洗二次。

5.加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

6.去除染液，水洗二次。

7.以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號培養(yǎng)基對細(xì)胞生長不佳，則丟棄之。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第8頁基礎(chǔ)篇-抗生素1.細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素

1.1.培養(yǎng)自ATCC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

1.2.培養(yǎng)自其它試驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作tokenfreeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待tokenfreeze經(jīng)過污染測試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。

2.寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask時(shí)，則須添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。

3.若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制mycoplasma生長。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第9頁4.去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后藥品毒性會增強(qiáng)。

5.抗生素使用種類與濃度：

工作濃度.儲存溫度.殺滅細(xì)菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma

amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第10頁基礎(chǔ)篇-血清1.血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超出一個(gè)月。假如一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中，因?yàn)檠褰Y(jié)凍時(shí)體積會增加約10%，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，不然易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

2.普通廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)覺血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。

3.瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，普通以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖擺均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成份均一，降低沈淀發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，輕易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第11頁4.heat-inactivation是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖擺均勻。此熱處理之目標(biāo)是使血清中之補(bǔ)體成份(complement)去活化。除非必須，普通不提議作此熱處理，因?yàn)闀斐缮虻砦镏@著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參加之反應(yīng)有：cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。

5.勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會所以受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第12頁6.血清之沈淀物

6.1.凝絮物：發(fā)生之原因有許各種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲降低這些凝絮沈淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液能夠加入培養(yǎng)基中一起過濾。不提議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀枞^濾膜。

6.2.顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物形成會顯著增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。普通而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)馬上停用，更換另一批號血清。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第13頁附-血清之生長測試材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL1-022)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

步驟：

1.以a-MEMwith10%FBS(已測試過)培養(yǎng)MDCK細(xì)胞于T75flask至80%confluency。

2.以trypsin-EDTA處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM制成細(xì)胞懸浮液，并測細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM稀釋細(xì)胞濃度為1×102活細(xì)胞數(shù)/ml。

3.將1ml細(xì)胞懸浮液接種入6-wellplate中，并另加入1ml含不一樣濃度血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。用已測試過之血清同時(shí)進(jìn)行對照組試驗(yàn)。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第14頁4.37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到能夠肉眼觀察，而群落間不相互接觸即可。

5.去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜置10min。

6.去除固定液，水洗二次。

7.加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

8.去除染液，水洗二次。

9.以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)

10.計(jì)算SPE(SerumPlatingEfficiency)：

SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%

11.計(jì)算RPE(RelativePlatingEfficiency)：

SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%

比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細(xì)胞生長影響。訂購多量同一批號優(yōu)良血清，置于–70℃保留之深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第15頁基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng)1.細(xì)胞生長至高密度時(shí)，即須分殖至新培養(yǎng)瓶中，普通稀釋百分比為1:3至1:6，依細(xì)胞種類而異。

2.材料：

2.1.無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：

以10ml分裝于15ml無菌離心管中，保留于–20℃，使用前放在37℃水槽回溫。

2.3.新鮮培養(yǎng)基

2.4.無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3.步驟：

3.1.附著型胞(adherentcell)

3.1.1.吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2.用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第16頁3.1.3.加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而展現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。)

3.1.4.輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋百分比轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第17頁3.2.懸浮型細(xì)胞(suspensioncell)

3.2.1.吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

3.2.2.吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋百分比轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3.融合瘤(hybridoma)

3.3.1.有些hybridomacell需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。所以繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第18頁基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保留（一）1.注意事項(xiàng)：

1.1.欲冷凍保留之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。

1.2.冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，比如hybridoma應(yīng)在冷凍保留前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3.注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micronFGLPTelflon過濾或是直接購置無菌產(chǎn)品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保留，勿作屢次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保留。在開啟后一年內(nèi)使用，因長久儲存后對細(xì)胞會有毒性。1.4.冷凍保留之細(xì)胞濃度：

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第19頁1.4.1.normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml

1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，一些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。

1.4.3.adherenttumorlines:5~7x106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。

1.4.4.othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte須最少5x106cells/ml。

1.5.冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保留之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backupculture，以預(yù)防冷凍失敗。1.6.冷凍方法：

1.6.1.傳統(tǒng)方法:4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16-18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長久儲存。

1.6.2.程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vaporphase長久儲存。適合用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保留。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第20頁基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保留（二）2.材料：

2.1.生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞

2.2.新鮮培養(yǎng)基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.無菌塑料冷凍保留管(Nalgene5000-0020)

2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

2.6.血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片

2.7.等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第21頁3.步驟：

3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。

3.2.配制冷凍保留溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最終濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3.3.依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，搜集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少許細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保留溶液，使細(xì)胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保留管中，1ml/vial，并取少許細(xì)胞懸浮液作污染檢測。

3.5.冷凍保留方法1:冷凍管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長久儲存。

3.6.冷凍保留方法2:冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)?program7:HBCELL深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第22頁基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化1.冷凍細(xì)胞之活化標(biāo)準(zhǔn)為快速解凍，以防止冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，造成細(xì)胞之死亡。

2.細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特征表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(比如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3.材料

37℃恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第23頁4.步驟：

4.1操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，預(yù)防冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢驗(yàn)蓋子是否旋緊，因?yàn)闊崦浝淇s過程，此時(shí)蓋子易松掉。

4.3將新鮮培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。

4.4取出冷凍管，馬上放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%ethanol擦拭保留管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

4.5取出0.9ml解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋百分比1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。

4.6解凍后是否馬上去除冷凍保護(hù)劑(比如DMSO或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，普通而言，大都不需要馬上去除冷凍保護(hù)劑。惟若要馬上去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000rpm,5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.7若不需馬上去除冷凍保留劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第24頁基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞處理方式(一)1.收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請檢驗(yàn)細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請馬上通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)，或馬上冷凍保留(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。

2.冷凍細(xì)胞解凍程序:

2.1.依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和百分比，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法馬上適應(yīng)不一樣之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不一樣之血清種類，若因試驗(yàn)需要，必須有所不一樣時(shí)，務(wù)必以遲緩百分比漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之試驗(yàn)。

2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第25頁2.3.將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管，馬上放入37°C水槽中快速解凍，水面高度不可靠近或高過冷凍管之蓋沿，不然易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

2.4.依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25或T75flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5.對絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需馬上去除DMSO者，則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5-10ml培養(yǎng)基中，離心300xg(約1000rpm)，5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第26頁基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞處理方式(二)收到T25flask細(xì)胞時(shí)，處理方式為︰

1.于寄送過程中，為防止起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25flask均加滿培養(yǎng)基。請檢驗(yàn)flask外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和有沒有污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請馬上通知細(xì)胞試驗(yàn)室。

2.將原封之T25flask靜置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37°C，并讓運(yùn)輸過程中少數(shù)脫落細(xì)胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基能夠再使用)，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內(nèi)，依普通培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長滿盤，則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第27頁附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測試（一）1.原理：

1.1.計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動計(jì)數(shù)。

1.2.血球計(jì)數(shù)盤普通有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。

1.3.存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲透死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲透而不會呈色。普通使用藍(lán)色之trypanblue染料，假如細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第28頁附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測試（二）2.材料：

0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline

血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)，計(jì)數(shù)器(counter)，低倍倒立顯微鏡

粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步驟：

3.1.取50ml細(xì)胞懸浮液與50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

3.2.取少許混合液(約15ml)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosinbluish)。

3.3.計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(最少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最終乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。

4大格*細(xì)胞總數(shù)x2x104/4=細(xì)胞數(shù)/ml

*每一大格體積=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第29頁3.4.若不用血球計(jì)數(shù)盤，可用Coultercounter作自動計(jì)數(shù)，惟無法區(qū)分死細(xì)胞或活細(xì)胞。

3.5.范例：

T75monolayerculture制成10ml細(xì)胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55,62,49,59

死細(xì)胞數(shù)/方格：5,3,4,6

細(xì)胞總數(shù)=243

平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75

稀釋倍數(shù)=2

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75x104x2=1.22x106

細(xì)胞數(shù)/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第30頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)11冷凍管應(yīng)怎樣解凍？

取出冷凍管后，須馬上放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超出冷凍管蓋沿，不然易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。2細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)尤其注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包含懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可防止大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第31頁3可否使用與原先培養(yǎng)條件不一樣之培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株都有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不一樣之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法馬上適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。4可否使用與原先培養(yǎng)條件不一樣之血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為主要營養(yǎng)起源，所以血清種類和品質(zhì)對于細(xì)胞生長會產(chǎn)生極大影響。來自不一樣物種血清，在一些物質(zhì)或分子量或內(nèi)容物上都有所不一樣，血清使用錯(cuò)誤常會造成細(xì)胞無法存活。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第32頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)25何謂FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同意思，二者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤使用字眼，請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。6培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？

普通培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第33頁7何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

8培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，普通正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。9附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)怎樣處理？

普通使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開瓶后應(yīng)馬上少許分裝于無菌試管中，保留于–20°C，防止重復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可降低污染之機(jī)會。10懸浮性細(xì)胞應(yīng)怎樣繼代處理？

普通僅需連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第34頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)311欲將普通動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細(xì)胞，其離心速率普通為300xg(約1,000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。12細(xì)胞之接種密度為何？依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之百分比接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一主要原因。13細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細(xì)胞冷凍保留時(shí)最常使用冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：因?yàn)镈MSO稀釋時(shí)會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第35頁14DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保留使用之DMSO等級，必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌情況，第一次開瓶后應(yīng)馬上少許分裝于無菌試管中，保留于4°C，防止重復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可降低污染之機(jī)會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。15冷凍保留細(xì)胞之方法？

冷凍保留方法一:冷凍管置于4°C30~60分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長久儲存。

冷凍保留方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長久儲存。*-20°C不可超出1小時(shí)，以預(yù)防冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第36頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)416細(xì)胞欲冷凍保留時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目普通為1x106cells/mlvial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。17應(yīng)怎樣防止細(xì)胞污染？細(xì)胞污染種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不妥、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞起源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。18假如細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)怎樣處理？

加入對應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。19支原體(mycoplasma)污染細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第37頁不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之教授外，大多數(shù)遭受支原體污染細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。20支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響全部細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行試驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，試驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。21偵測出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該怎樣處理？

直接滅菌后丟棄，以防止污染其它細(xì)胞株。22CO2培養(yǎng)箱之水盤怎樣保持清潔？

定時(shí)(最少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第38頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)523為何培養(yǎng)基保留于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保留于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐步溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，能夠通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。24各種細(xì)胞培養(yǎng)用dish，flask是否均相同？

不一樣廠牌dish或flask，其所coatingpolymer不一樣，制造程序亦不一樣，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不一樣之dish或flask而有顯著之生長差異。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第39頁25購置之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上失誤，造成細(xì)胞物理性損傷，以及細(xì)胞流失。提議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。26購置之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。27收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不妥，造成冷凍管裂損，提議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能所以而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第40頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)628怎樣選取特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中一樣很輕易生長?？傊走xMEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好開始，各種目標(biāo)無血清培養(yǎng)最好首選AIMV（1）培養(yǎng)基（SFM）。

29L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中主要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是主要。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞能量起源、參加蛋白質(zhì)合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會降解，不過確切降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺降解造成氨形成，而氨對于一些細(xì)胞含有毒性。

深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第41頁30GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞怎樣利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺衍生物，其不穩(wěn)定alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一個(gè)肽酶逐步裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小降解，假如在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

31什么培養(yǎng)基中能夠省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅能夠模擬固醇類激素作用，（尤其是雌激素）。為防止固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅培養(yǎng)基。因?yàn)榉蛹t干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅培養(yǎng)基。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第42頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)732培養(yǎng)基中丙酮酸鈉作用是什么？

丙酮酸鈉能夠作為細(xì)胞培養(yǎng)中替換碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，不過，假如沒有葡萄糖話，細(xì)胞也能夠代謝丙酮酸鈉。

34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA目標(biāo)是什么？

二價(jià)離子確實(shí)抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離鎂離子和鈣離子，方便保持抑制胰蛋白酶活性。提議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中全部二價(jià)離子。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第43頁33目錄上說，Hank‘s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)功效差異？

HBS和EBS主要差異在于碳酸氫鈉水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平CO2平衡，以維持溶液PH值。Eagles液在空氣水平CO2中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。假如希望在CO2培養(yǎng)箱中保留組織，需要用Eagles液，。假如僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存組織，用Hanks液就能夠了。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第44頁升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)835當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低最少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞到達(dá)毒性水平。

36一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯谢境煞菰诮鈨龊缶烷_始降解。

37大部分添加物和試劑最多能夠凍融3次，假如次數(shù)更多都會在包含蛋白溶液引發(fā)一定水平降解和沉淀，將會影響它性能。

38在溶解一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，假如在室溫下放置超出30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第45頁細(xì)胞分離試劑（1）大部分連續(xù)細(xì)胞系，強(qiáng)貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞HBSS或無鈣鎂PBS0.25％胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中細(xì)胞表面蛋白完整性主要連續(xù)細(xì)胞系HBSS或無鈣鎂PBS0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mMEDTA弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞HBSS或無鈣鎂PBSEDTA,甘油溶解在檸檬酸鈉中強(qiáng)貼壁早代細(xì)胞系HBSS或無鈣鎂PBS0.25％胰蛋白酶溶解在1mMEDTA，Dispase0.6-2.4單位/ml溶解在PBS深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第46頁細(xì)胞分離試劑（2）上皮細(xì)胞0.5mM-1mMEDTA0.5mM-1mMEDTA，Dispase0.6-2.4單位/ml溶解在PBS強(qiáng)貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞0.5mM-1mMEDTA0.25％胰蛋白酶1mMEDTA，Dispase0.6-2.4單位/ml溶解在無鈣鎂PBS厚培養(yǎng)物，多層富含膠原密集培養(yǎng)1mMEDTA0.25％胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mMEDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第47頁培養(yǎng)液pH值改變太快CO2張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細(xì)菌、酵母或真菌污染。（1）按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或降低培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5％到10％。（2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開瓶蓋1/4圈。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制培養(yǎng)液。丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。深度優(yōu)化純凈版細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題專家講座第48頁培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成份沉淀下來。冰凍保留培養(yǎng)液。用去離子水重復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌。將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀依然存在，丟棄培養(yǎng)液