3.2.2基因工程的基本操作程序高二下學期生物人教版選擇性必修二

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基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞第一步第二步第三步第四步目的基因的檢測與鑒定閱讀課本P81-82，找出目的基因?qū)胧荏w細胞的方法，各個方法的原理以及各自適用于什么生物？有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。目的基因進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。P80旁欄思考：將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便么？如果這樣做，效果會怎樣？這種方法針對性差，完全靠運氣也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)）①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。花粉管通道法導入外源DNA三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。②特點：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。b.農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法③過程：兩次拼接和兩次導入拼接1拼接2導入1導入2④具體轉(zhuǎn)化方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株。b.可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會被整合到宿主細胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進入宿主細胞并整合到宿主細胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進入植物的一個體細胞，但基因工程最終要的是一個轉(zhuǎn)基因植株，如何實現(xiàn)這一目標？得到含有目的基因的植物細胞后進行植物組織培養(yǎng)問題探討三、將目的基因?qū)胧荏w細胞2.將目的基因?qū)雱游锛毎?）導入方法：（2）受體細胞:顯微注射法受精卵原因：①體積大，易操作；

②易表現(xiàn)出全能性。（3）過程：構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物知識拓展--病毒介導法（主要用于導入動物細胞）科學家也用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對S蛋白的免疫記憶。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎?）常用方法：Ca2+處理原核細胞（常選擇大腸桿菌）可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（3）過程：（目的？）（2）受體細胞：（優(yōu)點？）繁殖快，多為單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)。Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收重組DNA增加細胞壁的通透性一般利用溫度變化導入將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法總結(jié)細胞種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射Ca2＋處理法(CaCl2)受體細胞受精卵或體細胞受精卵常用原核細胞轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達目的基因表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細胞→重組的基因表達載體導入細胞中四、目的基因的檢測與鑒定

目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。1.檢測與鑒定的方法分子水平的檢測個體水平的鑒定四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測①電泳檢測法方法2：可以以質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，之后再進行電泳檢測。設(shè)計PCR的一對引物時，最好一個引物與質(zhì)粒DNA互補結(jié)合，另一個引物與目的基因DNA互補結(jié)合，這樣只有以重組DNA為模板才能獲得擴增產(chǎn)物（也可以都跟目的基因互補結(jié)合，這樣只有含有目的基因，才能獲得擴增產(chǎn)物），之后再進行電泳檢測；方法1：體細胞中的質(zhì)粒直接進行電泳檢測或者選擇合適的限制酶對質(zhì)粒進行酶切后再進行電泳檢測，同時可借助指示分子大小的標準參照物來進一步確認目的基因。方法3：提取受體細胞的mRNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，用上述方法2進行PCR擴增，之后再進行電泳檢測；重組質(zhì)粒四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測②核酸雜交檢測法a.將轉(zhuǎn)化的菌落影印在濾膜上；b.通過溶菌和核酸變性處理，使核酸暴露并與濾膜原位結(jié)合;c.用相應(yīng)的帶有標記的探針進行雜交,經(jīng)放射自顯影，就可以鑒別出目的基因;d.最后從原來的培養(yǎng)基上選出相應(yīng)的菌落。a.提取受體細胞的DNA進行酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳；b.對分離后定位在凝膠上的DNA進行處理，并將凝膠中變性的DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上固定；c.用相應(yīng)的帶有標記的探針進行雜交，經(jīng)放射自顯影，就可以鑒別出目的基因。菌落原位雜交法DNA印染法四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測②核酸雜交檢測法（原理）

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交（遵循堿基互補配對原則），若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出mRNA。四、目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測③抗原-抗體雜交技術(shù)在抗原-抗體雜交中，目的蛋白是作為抗原還是抗體？

從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。抗原蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化四、目的基因的檢測與鑒定（2）個體水平的檢測轉(zhuǎn)基因生物檢測方法觀察目標抗蟲植物害蟲吞食害蟲是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出現(xiàn)病斑抗鹽植物鹽水澆灌是否正常生長抗除草劑植物噴灑除草劑是否正常生長獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物提取細胞產(chǎn)物，與天然產(chǎn)品進行功能活性比較細胞產(chǎn)物的功能活性是否正常（1）原核生物基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)終止子：終止轉(zhuǎn)錄基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達（2）真核生物基因1.若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？2.以上情況如何解決？3.若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無活性，原因可能是？4.以上情況如何解決？真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，因此無法表達出該蛋白使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，無法對真核生物的蛋白質(zhì)進行正確的加工人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞思考當真核生物的基因以原核生物作為受體細胞時：1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）√××練習與應(yīng)用(P83)2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關(guān)PCR的敘述

錯誤的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸D一、概念檢測研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關(guān)資料，嘗試對這個問題作出解釋。二、拓展應(yīng)用外源基因插入基因