3.2基因工程的基本操作程序課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修32

復(fù)習(xí)提問(wèn)1.限制酶的來(lái)源？特點(diǎn)？作用部位？2.DNA連接酶的作用？主要有哪兩類(lèi)？區(qū)別？3.什么是質(zhì)粒？4.基因工程中最常使用的載體是

，還有

。5.質(zhì)粒作為載體，需要具備的條件。①質(zhì)粒要能與外源DNA片段（目的基因）連接，需具備什么條件？②要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，質(zhì)粒應(yīng)具備什么條件？③我們用肉眼看不到質(zhì)粒是否攜帶著目的基因進(jìn)入了受體細(xì)胞內(nèi)，為了便于篩選重組DNA分子，質(zhì)粒需要具備什么條件？6.DNA粗提取的原理？鑒定的原理？判斷：1.限制酶的切割位點(diǎn)可以在識(shí)別序列的內(nèi)部或外部。2.不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端。3.用不同的限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端，也可能連接在一起。判斷：1.限制酶的切割位點(diǎn)可以在識(shí)別序列的內(nèi)部或外部。2.不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端。3.用不同的限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端，也可能連接在一起。c酶d酶3?3?3?3?5?5?5?5?a、b、c、d酶的識(shí)別序列及切點(diǎn)如圖所示學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握目的基因的篩選與獲取方法（生命觀念、科學(xué)思維）0102學(xué)會(huì)基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法和要求（科學(xué)探究）理解目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的具體過(guò)程（科學(xué)探究）掌握目的基因檢測(cè)與鑒定的方法（科學(xué)探究、社會(huì)責(zé)任）掌握DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的方法（科學(xué)探究）0304053.2基因工程的基本操作程序1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。

你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與普通棉花

從社會(huì)中來(lái)抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的基因的篩選與獲取3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測(cè)與鑒定Bt基因Ti質(zhì)粒重組DNA分子將目的基因插入染色體DNA中

從社會(huì)中來(lái)在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)?？茖W(xué)家將“殺蟲(chóng)基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲(chóng)蛋白抵抗蟲(chóng)害。目的基因1.目的基因（1）定義：(2)實(shí)例：一.目的基因的篩選與獲取

當(dāng)Bt抗蟲(chóng)蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲(chóng)腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲(chóng)死亡。相關(guān)信息：1.Bt抗蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)原理：2.抗蟲(chóng)棉中的Bt抗蟲(chóng)蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？

Bt抗蟲(chóng)蛋白只有在某類(lèi)昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體，因此，Bt抗蟲(chóng)蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響。

從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。目的培育抗蟲(chóng)棉已有研究成果①蘇云金桿菌制成的生物殺蟲(chóng)劑廣泛用于防治棉花蟲(chóng)害；②蘇云金桿菌的殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)；③對(duì)Bt基因的序列信息和其表達(dá)產(chǎn)物Bt抗蟲(chóng)蛋白有了較為深入的了解合適的目的基因Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因Bt抗蟲(chóng)蛋白基因（Bt基因）的篩選過(guò)程2．篩選合適的目的基因(1)方法：(2)實(shí)例：

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能3.目的基因獲取方法目的基因獲取方法從基因文庫(kù)中獲取人工合成目的基因利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一.目的基因的篩選與獲取基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）基因文庫(kù)：①基因組文庫(kù)：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。(1)從基因文庫(kù)中直接獲取一.目的基因的篩選與獲?、倩蚪M文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程某生物所有DNA特定的限制酶基因組所有基因每個(gè)基因和載體結(jié)合重組DNA分子導(dǎo)入受體菌基因組文庫(kù)一.目的基因的篩選與獲取保存的是受體菌。(1)從基因文庫(kù)中直接獲?、赾DNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程某種生物的成熟mRNA單鏈DNA雙鏈DNA片段（cDNA）導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶與載體連接一.目的基因的篩選與獲取保存的是受體菌。(1)從基因文庫(kù)中直接獲取2.基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以DNA合成儀①前提：基因比較小、核苷酸序列已知②方法：通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因3.目的基因的獲取方法(2)人工合成一.目的基因的篩選與獲取化學(xué)合成法：依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過(guò)程如下：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推測(cè)目的基因的核苷酸序列推測(cè)目的基因化學(xué)合成解旋：在____酶作用下，DNA兩條鏈打開(kāi)，形

成DNA單鏈。引物結(jié)合：在DNA單鏈____端，通__________

與DNA母鏈結(jié)合。DNA聚合酶結(jié)合：DNA聚合酶與模板鏈結(jié)合，

標(biāo)志著單鏈合成開(kāi)始。子鏈合成：__________酶從引物____端開(kāi)始，

將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)。后續(xù)加工：將____切去，并合成空缺處的DNA

單鏈，再由__________酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(lái)，子鏈和母鏈再形

成______結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程的解析解旋3′堿基互補(bǔ)配對(duì)DNA聚合3′引物DNA連接雙螺旋DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈引物是指一小段DNA或RNA，它能DNA母鏈的一段堿基序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。一般20～30個(gè)堿基。DNA復(fù)制需要引物的原因？子鏈的延伸方向？5’到3’PCR是_______________的縮寫(xiě)，是一項(xiàng)根據(jù)___________________的原理，在____提供參與DNA復(fù)制的_______與_________，對(duì)____________________進(jìn)行________的技術(shù)；PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制全稱(chēng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因一.目的基因的篩選與獲取3.目的基因的獲取方法(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因留復(fù)制原理操作環(huán)境目的優(yōu)點(diǎn)：利用PCR，既可用來(lái)擴(kuò)增已得到的基因或DNA片段，也可以用來(lái)擴(kuò)增很長(zhǎng)的DNA分子中的目的基因從而得到該基因。耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物緩沖溶液（一般添加Mg2+）PCR條件:一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因四種脫氧核苷酸激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（2種）

提供相應(yīng)穩(wěn)定的pH環(huán)境與某些離子；引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物(dNTP)要有一段已知目的基因的核苷酸序列PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制不同點(diǎn)場(chǎng)所解旋方式酶引物溫度能量子鏈合成結(jié)果相同點(diǎn)原則、方式條件子鏈延伸方向DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)DNA聚合酶、解旋酶大量的DNA片段或基因形成整個(gè)DNA分子一小段RNA一般為單鏈DNA片段體內(nèi)溫和條件一條子鏈連續(xù)合成，另一條子鏈不連續(xù)合成兩條子鏈都是連續(xù)合成ATP提供能量dNTP提供能量堿基互補(bǔ)配對(duì)、半保留復(fù)制模板、引物、酶等從5′端到3′端耐高溫的的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行

目的基因DNA__________后__________，______與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以___________為模板在____________作用下進(jìn)行_____，即將4種____________加到____________，如此重復(fù)循環(huán)多次。過(guò)程歸納：受熱變性解為單鏈引物延伸單鏈DNADNA聚合酶引物的3’端脫氧核苷酸

由于延伸后得到的_____又可以作為下一個(gè)循環(huán)的_____，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。產(chǎn)物模板一倍指數(shù)每次循環(huán)一般可以分為_(kāi)____、_____、_____三步。變性復(fù)性延伸③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。①逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃變性3`5`5`3`第一輪含有目的基因的雙鏈DNA片段DNA解聚為單鏈溫度上升到90℃以上變性③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃退火Taq聚合酶引物1引物2原料第一輪兩條DNA單鏈引物和兩條單鏈DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)溫度下降到50℃左右復(fù)性③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因注意：復(fù)性不一定均為引物與DNA模板結(jié)合。復(fù)性時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在DNA解開(kāi)的兩條鏈的結(jié)合。但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低，原因是：①模板鏈一般比較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率低；②加入引物的量足夠多而模板鏈數(shù)量少，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。925575℃延伸Taq聚合酶引物1引物2原料第一輪引物和互補(bǔ)DNA結(jié)合脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈溫度上升到72℃左右延伸③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃變性Taq聚合酶引物1引物2原料第二輪③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃退火Taq聚合酶引物1引物2原料第二輪③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃延伸Taq聚合酶引物1引物2原料第二輪③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃變性第三輪③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃退火第三輪③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925575℃延伸第三輪一.目的基因的篩選與獲取【典例1】下圖表示PCR的前三個(gè)循環(huán)，目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對(duì)應(yīng)的位置之間，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(1)PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？

不是，PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。(2)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？

根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是?目的基因兩端的核苷酸序列【典例1】下圖表示PCR的前三個(gè)循環(huán)，目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對(duì)應(yīng)的位置之間，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：(3)經(jīng)過(guò)第幾輪擴(kuò)增后，才從DNA分子中分離出目的基因？比例是多少？

第3輪；1/4。循環(huán)n次，理論上可獲得DNA數(shù)

，

其中含引物的DNA數(shù)

，含引物的DNA鏈數(shù)

，共需引物數(shù)

。2n2n2n+1-22n+1-2利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因問(wèn)題探討PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)要經(jīng)過(guò)幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？至少3次第一次第二次5’3’5’3’3’5’利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因第三次思考：繼續(xù)循環(huán)N次，會(huì)得到多少個(gè)DNA分子呢？

每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。若消耗了引物62個(gè),則進(jìn)行了幾輪的擴(kuò)增。5引物數(shù)=新增單鏈數(shù)=2n+1-2第四輪出現(xiàn)了

個(gè)等長(zhǎng)的DNA片段82.第n次循環(huán)，需引物數(shù)

，需A引物數(shù)

，2n-1T7.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占比例為

。

15/16T5.一個(gè)樣品DNA分子經(jīng)n次循環(huán)共需消耗引物a的數(shù)量為

．2n-1【例2】設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。(1）第1組：

；

第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ′自身內(nèi)部部分堿基發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)而失效一.目的基因的篩選與獲取(2)兩種引物的要求？

。①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)③引物長(zhǎng)度不宜過(guò)短，防止引物隨機(jī)結(jié)合(3)延伸時(shí)需要加入兩種引物，原因是

。(4)兩種引物與模板鏈的哪一端配對(duì)？脫氧核苷酸連接在引物的_____端進(jìn)行延伸DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增【例2】設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。一.目的基因的篩選與獲取引物的5′端與模板鏈3′端互補(bǔ)配對(duì)3’5’3’5’3’5’3’5’3’(1)在PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)

（需要/不需要）解旋酶，原因是

。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因前，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)

種引物，進(jìn)行PCR時(shí)需加熱至90∽95度然后冷卻至55∽60度，此操作的目的是

?！纠?】如圖為PCR技術(shù)擴(kuò)增圖解，請(qǐng)回答下列問(wèn)題不需要PCR過(guò)程中是通過(guò)高溫使DNA雙鏈解聚為單鏈的，而不是用解旋酶兩①90∽95度高溫使DNA解聚為單鏈，②然后冷卻至55∽60度使兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合一.目的基因的篩選與獲取(3)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個(gè)條件，即液體環(huán)境、適宜的__________和_________，前者由________

自動(dòng)調(diào)控，后者則靠___________來(lái)維持。（4）從理論上講，在PCR技術(shù)中，循環(huán)4次產(chǎn)生的DNA分子中，第四次循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為

。（5）假設(shè)DNA片段有150個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，若DNA分子中胞嘧啶脫氧核苷酸有70個(gè)，則5次循環(huán)，需要胸腺嘧啶脫氧核苷酸

個(gè)（不考慮引物所對(duì)應(yīng)的片段）（6）假設(shè)DNA片段有200個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，經(jīng)3次擴(kuò)增后，從理論上計(jì)算，除需要引物

個(gè)外（注：每個(gè)引物中含有20個(gè)脫氧核苷酸），還需要游離的脫氧核苷酸

個(gè)。溫度PH值PCR擴(kuò)增儀

緩沖液15/1624802520(2n-1)T(2n-1)400-20×14(2n+1-2)=14一.目的基因的篩選與獲取14一個(gè)DNA，一對(duì)引物（A與B），通過(guò)PCR擴(kuò)增n次：①子代DNA分子中等長(zhǎng)鏈DNA分子數(shù)為：______個(gè)②子代DNA分子中不等長(zhǎng)鏈DNA分子數(shù)為：_______個(gè)③子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：_______個(gè)④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：______個(gè)⑤復(fù)制過(guò)程中共需引物________個(gè)⑥第n次復(fù)制需要引物_________個(gè)2n-2n2n22n-12n＋1-22nPCR擴(kuò)增DNA規(guī)律歸納總結(jié)(7)如圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴(kuò)增方向，請(qǐng)用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出另一條引物的位置及擴(kuò)增方向．(8)若用PCR技術(shù)擴(kuò)增圖示目的基因，應(yīng)選用的引物是

。引物甲、引物丙一.目的基因的篩選與獲取引物的5′端可以修飾。如加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)等。兩種引物加不同的限制酶位點(diǎn)。使DNA片段與載體能定向連接?，F(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：若想獲得以下已知序列的DNA片段，設(shè)計(jì)了一些PCR引物，應(yīng)選用的PCR引物是______(從引物①②③④中選)DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′AACTATGCGCTCATGA3′②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′③5′AGAGGCTACGCATTGC3′④5′TCATGAGCGCATAGTT3′③①獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時(shí)，使Bt基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用這就是需要構(gòu)建基因表達(dá)載體。這也是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的核心工作那么基因表達(dá)載體是由哪些部分組成的呢？（1）目的：（2）組成及各部分作用？（3）目的基因的具體插入位點(diǎn)？基因表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？（4）比較“啟動(dòng)子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”（5）說(shuō)說(shuō)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程

獲得了足量的目的基因后，是否能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞呢？若這樣操作，效果如何？二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心步驟）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)原核生物基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄回顧知識(shí)：基因結(jié)構(gòu)：非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成加工轉(zhuǎn)錄mRNA前體成熟mRNA真核細(xì)胞的基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345啟動(dòng)子終止子補(bǔ)充知識(shí)：基因結(jié)構(gòu)：原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？思考:啟動(dòng)子：位于基因的上游,是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因的下游,終止轉(zhuǎn)錄。二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.組成便于重組DNA分子的篩選DNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)思考：基因表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)，生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于目的基因的表達(dá)。辨析：“啟動(dòng)子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動(dòng)子與終止子位于DNA分子中，作用：起始和終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程。起始密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，作用：起始和終止翻譯過(guò)程。二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思考】概述基因表達(dá)載體構(gòu)建的流程：①用限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)缺口；②用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，獲取目的基因；③用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體缺口處，形成重組DNA分子。目的基因重組DNA分子目的基因二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思考2】①單酶切法單酶切的方法缺陷是什么？如何避免？用DNA連接酶處理后會(huì)出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)【思考3】①載體與基因表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段?；虮磉_(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因。注意：②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。1.轉(zhuǎn)化指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程。2.轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法如①花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞的方法2.轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊①用

將

直接注入

中；②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去

，將________滴加在

上，使目的基因借助

進(jìn)入

；受體細(xì)胞：微量注射器含目的基因的DNA溶液子房柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受精卵③花粉管通道法的過(guò)程：注意：導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能集合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過(guò)花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。將目的基因插入

中，通過(guò)農(nóng)桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有______，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將______上的______（___________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其_________________；Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA上利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）初始時(shí)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用的生物及原因？

農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，它能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物T-DNA目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)據(jù)圖可知，目的基因發(fā)生了幾次拼接和導(dǎo)入？過(guò)程②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片

，然后_____________，并__________；受體細(xì)胞為_(kāi)______與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株體細(xì)胞b.可以將

直接浸沒(méi)在

中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得

，再進(jìn)行_____、_____等；受體細(xì)胞為_(kāi)______花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）顯微注射法①方法：②受體細(xì)胞：③過(guò)程：受精卵(因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性)2024/4/19構(gòu)建基因表達(dá)載體受精卵早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射【拓展其他方法】（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。腺病毒載體新冠疫苗的制備將編碼新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因組中，接種后，隨載體增殖，大量所需的抗原得以表達(dá)。接種疫苗，責(zé)無(wú)旁貸！【拓展其他方法】（3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞

（1）常用原核生物作為受體細(xì)胞的原因：

（2）常用處理方法及目的：繁殖周期短體積小易于培養(yǎng)操作多為單細(xì)胞遺傳物質(zhì)相對(duì)較少Ca2+處理（Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性）使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）種類(lèi)項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞導(dǎo)入方法

受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程【小結(jié)】三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；花粉管通道法體細(xì)胞或受精卵顯微注射法將目的基因插入到?→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞?→表達(dá)受精卵構(gòu)建基因表達(dá)載體受精卵早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物顯微注射Ca2＋處理法原核細(xì)胞Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中是否可以確定目的基因進(jìn)入了受體細(xì)胞并能維持穩(wěn)定？是否可以確定目的基因一定能夠進(jìn)行表達(dá)？是否可以確定得到了新的性狀？不一定！四.目的基因的檢查與鑒定檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性；2.檢測(cè)與鑒定的內(nèi)容及方法:類(lèi)型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀病原體接種實(shí)驗(yàn)等四.目的基因的檢查與鑒定1.目的:抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等個(gè)體水平鑒定（二）鑒定——轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常（1）分子水平的檢測(cè)a.PCR等技術(shù)在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。四.目的基因的檢查與鑒定方法：DNA分子雜交分子雜交b.抗原—抗體雜交技術(shù)從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。過(guò)程【歸納總結(jié)】四.目的基因的檢查與鑒定1.在實(shí)際種植過(guò)程中，棉鈴蟲(chóng)是否對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對(duì)長(zhǎng)江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種的抗蟲(chóng)性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周?chē)嬖诖罅刻烊槐幼o(hù)所，靶標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等并未對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國(guó)、澳大利亞、印度等國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過(guò)毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種。

到社會(huì)中去2.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個(gè)方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性和抗蟲(chóng)持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲(chóng)基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲(chóng)基因的表達(dá)量等。例如，最早種植的抗蟲(chóng)棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲(chóng)活性，又可以延緩害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過(guò)不同基因間的互補(bǔ)作用擴(kuò)大抗蟲(chóng)范圍。

到社會(huì)中去（2）田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國(guó)等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲(chóng)劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周?chē)N植20%～30%面積的可使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周?chē)辽俜N植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國(guó)除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場(chǎng)需設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長(zhǎng)江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲(chóng)寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無(wú)須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。

這樣做的原理是為少部分害蟲(chóng)提供一個(gè)正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲(chóng)種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了抗性，但是因?yàn)槠渑c敏感目標(biāo)害蟲(chóng)交配，后代抗性基因會(huì)發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲(chóng)的種群也不至于迅速增加。（3）國(guó)家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評(píng)價(jià)等。練習(xí)與應(yīng)用二、拓展應(yīng)用1.研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒(méi)有卡那霉素抗性的植株。請(qǐng)查找相關(guān)資料，嘗試對(duì)這個(gè)問(wèn)題作出解釋。提示：外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入。或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下。插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入;插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對(duì)轉(zhuǎn)GUS基因（β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。練習(xí)與應(yīng)用二、拓展應(yīng)用2.八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示）和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtI表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構(gòu)酶基因，它編碼的蛋白質(zhì)可使細(xì)胞在特殊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)?？茖W(xué)家將psy和crtI基因轉(zhuǎn)入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡蘿卜素，由此生產(chǎn)出的大米稱(chēng)為"黃金大米"。請(qǐng)根據(jù)以上信息回答下列問(wèn)題。（1）科學(xué)家在培育"黃金大米"時(shí)，將crtl和psy基因?qū)牒琾mi基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建了質(zhì)粒pSYN12424。該項(xiàng)研究的目的基因是______________________，標(biāo)記基因是____________，質(zhì)粒pSYN12424的作用是______________________________。（2）在構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識(shí)別序列?為什么?crtI基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯?xì)胞不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識(shí)別序列，限制酶可能將它切斷。實(shí)驗(yàn)探究：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理（1）DNA片段的擴(kuò)增PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。（2）DNA片段的電泳鑒定①DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。注意：電泳時(shí)，DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量越大，受到的阻力越大，遷移速率越慢，DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量越小，受到的阻力越小，遷移速率越快。即DNA分子的遷移速率與其大小成反比①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）二、材料用具10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（）

1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的