植物蛋白質(zhì)組學專家講座

第一篇分子與細胞生物學基礎(chǔ)

第三章植物蛋白質(zhì)組學植物蛋白質(zhì)組學專家講座第1頁

目錄

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學

2.蛋白質(zhì)組和基因組

3.植物蛋白質(zhì)組研究方法

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測定

3.3質(zhì)譜

3.4生物信息學

4.植物蛋白質(zhì)組學研究進展

4.1植物發(fā)育蛋白質(zhì)組學研究

4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學研究

5.植物蛋白質(zhì)組學研究前景和挑戰(zhàn)

5.1表示整體分析以及蛋白質(zhì)組編目

5.2大規(guī)模蛋白質(zhì)功效研究

5.3建立完整蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡植物蛋白質(zhì)組學專家講座第2頁

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組：由一個基因組所表示全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學：研究在特定時間或環(huán)境下某個細胞或某種組織基因組所表示全部蛋白質(zhì)。它不是按照傳統(tǒng)方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子功效,而是應用各種蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復雜細胞環(huán)境中功效。

蛋白質(zhì)組學分為表示蛋白質(zhì)組學和細胞圖譜蛋白質(zhì)組學。前者利用各種先進技術(shù)研究蛋白質(zhì)表示整體改變,即研究在機體生長發(fā)育、疾病和死亡不一樣階段中,細胞與組織蛋白質(zhì)組分改變;后者主要經(jīng)過分離蛋白質(zhì)復合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間相互作用植物蛋白質(zhì)組學專家講座第3頁2.蛋白質(zhì)組和基因組

蛋白質(zhì)組和基因組關(guān)系：它們在概念上有相關(guān)性，代表某一蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)是由基因組編碼，而基因功效是經(jīng)過蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來。蛋白質(zhì)組學研究遠比基因組研究復雜：（1）蛋白質(zhì)組復雜性遠遠高于基因組一個基因≠一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物≠一個蛋白質(zhì)基因→不一樣轉(zhuǎn)錄起始和mRNA剪切→不一樣mRNA→不一樣翻譯起始→不一樣蛋白質(zhì)→翻譯后修飾→蛋白質(zhì)功效、穩(wěn)定性、細胞定位發(fā)生改變植物蛋白質(zhì)組學專家講座第4頁

（2）基因組組成是固定，蛋白質(zhì)組組成是動態(tài)?；蚪M在全部細胞中幾乎都是相同，與之不一樣，蛋白質(zhì)組含有很高細胞和組織特異性?；蚪M是相對穩(wěn)定，蛋白質(zhì)組處于高度動態(tài)改變之中。（3）細胞內(nèi)蛋白質(zhì)拷貝數(shù)（108）遠比基因拷貝數(shù)大（105）。（4）基因可采取PCR擴增和自動測序，而蛋白質(zhì)還沒有這些技術(shù)。

植物蛋白質(zhì)組學專家講座第5頁

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測定

3.3質(zhì)譜技術(shù)

3.4生物信息學3.植物蛋白質(zhì)組研究方法植物蛋白質(zhì)組學專家講座第6頁蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線流程圖植物蛋白質(zhì)組學專家講座第7頁3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)：依據(jù)蛋白質(zhì)等電點和相對分子質(zhì)量不一樣，分別經(jīng)過第一維等電聚焦和第二維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白質(zhì)混合物進行分離。

電泳后對蛋白質(zhì)進行染色，慣用染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染以及蛋白質(zhì)熒光檢測方法。

蛋白質(zhì)雙向電泳圖植物蛋白質(zhì)組學專家講座第8頁3.1.1利用雙向電泳研究植物蛋白質(zhì)組基本流程

蛋白樣品提取→雙向電泳分離蛋白→蛋白質(zhì)染色→雙向電泳圖譜分析

→蛋白點切割→蛋白酶解和判定

該流程最關(guān)鍵步驟是蛋白質(zhì)樣品提取，它關(guān)系到下游蛋白質(zhì)分離和判定是否能夠成功。好蛋白質(zhì)樣品要求從某一個細胞、組織或器官中提取盡可能多蛋白質(zhì)，以最大程度地反應這個蛋白質(zhì)組全貌。植物蛋白質(zhì)組學專家講座第9頁3.1.2雙向電泳缺點和處理方法

處理方法：

1.對樣品進行前期分級

2.對不一樣細胞器官或組織進行分離

3.使用寬膠條，符合重合窄IPG凝膠

4.雙向熒光差異凝膠電泳

5.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

6.雙向電泳工作站植物蛋白質(zhì)組學專家講座第10頁

經(jīng)過使用不一樣強度離液劑和表面去垢劑，并進行分步溶解分離，能夠取得更多蛋白質(zhì)，同時降低蛋白質(zhì)樣品復雜性，提升2-DE分辨率。如：ReadyPrep次序抽提試劑盒。

ReadyPrep試劑盒所需樣品量較少，不需要額外設(shè)備，是一個既節(jié)約時間又節(jié)約設(shè)備好方法。

ReadyPrep

產(chǎn)品線包含一系列2-DE樣品制備試劑盒，不但適合用于通用樣品（總蛋白）處理，而且能夠?qū)碗s樣品按特定方法分級。處理通用樣品試劑盒包含總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級試劑盒可用來降低樣品復雜程度，同時有利于低豐度蛋白富集和判定。這類試劑盒又分為兩種，一個是基于蛋白不一樣亞細胞定位來分離，另一個是對細胞總蛋白進行分級。下面流程圖將幫您確定哪種試劑盒對您更適合。

一.對樣品進行前期分級植物蛋白質(zhì)組學專家講座第11頁植物蛋白質(zhì)組學專家講座第12頁

次序抽提試劑盒可將樣品分離成3個遞增溶解度組份。這3個分離份依次分離，使我們能觀察到其它方法觀察不到蛋白。經(jīng)過對每一分離份逐層使用更強去垢劑，可提供遞增溶解度.

試劑一試劑二試劑三植物蛋白質(zhì)組學專家講座第13頁

二、對不一樣細胞或組織進行分離

經(jīng)過亞細胞分類，比如單獨提取細胞壁、細胞核、細胞膜、線粒體和葉綠體等蛋白質(zhì)組分。優(yōu)點：降低蛋白質(zhì)樣品復雜性，提升分辨率，了解蛋白質(zhì)定位。

三、使用寬膠條，符合重合窄IPG凝膠

2-DE分辨率通常認為與有效分離面積成正比，使用寬分離距離IPG膠和長距離二維SDS能夠提升2-DE分辨率。選取不一樣pH范圍膠條，經(jīng)過重合幾次窄范圍IPG凝膠電泳結(jié)果，能夠提升在某一區(qū)段尤其是蛋白質(zhì)集中區(qū)段內(nèi)分辨率

植物蛋白質(zhì)組學專家講座第14頁pH范圍3—104—75.0—6.0上樣量40ug80ug120ug植物蛋白質(zhì)組學專家講座第15頁四.雙向熒光差異凝膠電泳原理：雙向熒光差異凝膠系統(tǒng)（DIGE）在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重熒光分析方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不一樣熒光標識樣品，分析它們之間差異性。極大地提升了結(jié)果準確性，可靠性和重復性。

五.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

優(yōu)點：提升二維電泳效率和試驗重復性

六.2-DE工作站優(yōu)點：提升以2-DE為基礎(chǔ)蛋白質(zhì)組研究自動化程度和工作效率

植物蛋白質(zhì)組學專家講座第16頁3.2氨基酸序列測定

氨基酸測序主要使用是N端測序Edman化學降解法。降解反應分三步進行：第一步：偶聯(lián)反應，降解試劑（PITC）與多肽鏈游離氨基作用，形成PCT-肽。第二步：環(huán)化斷裂反應，PCT-肽在無水強酸介質(zhì)如三氟乙酸中，最靠近PTC基肽鍵將發(fā)生斷裂，同時PTC-氨基酸殘基環(huán)化成ATZ衍生物。第三步：轉(zhuǎn)化反應，首先水解生成PTC-氨基酸，然后環(huán)化成PTH-氨基酸，其在紫外區(qū)有很強吸收峰。它能夠被各種技術(shù)層析出來，然后判定。每輪Edman反應，能夠判定一個氨基酸，剩下降低一個殘基肽鏈便在它N端暴露一個新氨基，又可參加第二輪反應。植物蛋白質(zhì)組學專家講座第17頁偶聯(lián)反應環(huán)化斷裂反應轉(zhuǎn)化反應植物蛋白質(zhì)組學專家講座第18頁3.3質(zhì)譜質(zhì)譜儀離心源質(zhì)量分析器離子檢測器基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）電噴霧電離（ESI）飛行時間（TOF）四級桿（Q）離子阱（IT）慣用質(zhì)譜儀有：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IT-MS傅里葉變換離子盤旋共振么質(zhì)樸（FTMS）植物蛋白質(zhì)組學專家講座第19頁進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器

質(zhì)譜分析原理植物蛋白質(zhì)組學專家講座第20頁TypicalresultfromMALDI-TOF植物蛋白質(zhì)組學專家講座第21頁Peptidefingerprinting(PMF)withMALDI-TOF

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidenticalto??massspectrometrystoreddataortheoretical?peptides植物蛋白質(zhì)組學專家講座第22頁各種質(zhì)譜儀適用范圍：MALDI-TOF-MS：分析判定一些相對比較簡單多肽混合物和進行高通量蛋白質(zhì)組研究。ESI-MS：分析復雜蛋白質(zhì)樣品，判定組成蛋白質(zhì)氨基酸序列和蛋白質(zhì)翻譯后修飾。FTMS：判定氨基酸序列和分析蛋白質(zhì)修飾。Bottom-up蛋白質(zhì)組學：需要將蛋白質(zhì)樣品進行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IF-MSTop-down蛋白質(zhì)組學：能夠直接分析完整蛋白質(zhì)樣品，不需要經(jīng)過2-DE前處理。如：FTMS植物蛋白質(zhì)組學專家講座第23頁3.4生物信息學3.4.1蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組包含大量信息：蛋白質(zhì)序列信息、加工和修飾信息、表示結(jié)構(gòu)功效信息、與其它蛋白質(zhì)形成復合物信息。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫擬南芥數(shù)據(jù)庫擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫PAT苜蓿數(shù)據(jù)庫DOME3.4.2蛋白質(zhì)判定分析軟件

比如：2-DE成像分析軟件：Melanie,QUEST

蛋白質(zhì)判定軟件：MASCOT,PROWL植物蛋白質(zhì)組學專家講座第24頁4.植物蛋白質(zhì)組研究進展4.1發(fā)育蛋白質(zhì)組學研究

發(fā)育蛋白質(zhì)組：指植物在某一特定生長發(fā)育時期，在特定生長條件下，特定細胞、組織或器官中所表示全部蛋白質(zhì)。

發(fā)育蛋白質(zhì)組學：它揭示了在每一個特定時期所表示蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)在特殊生長時期可能發(fā)揮作用，是深入了解和深入研究蛋白質(zhì)功效基礎(chǔ)。雙子葉植物：開展了根、莖、葉、花、種子和果實蛋白質(zhì)組學組研究課題。單子葉植物：增加了葉鞘、花藥、胚、胚乳等蛋白質(zhì)組研究課題細胞器：細胞壁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜、葉綠體、線粒體等植物蛋白質(zhì)組學專家講座第25頁4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學研究

環(huán)境原因非生物原因：厭氧、冷、熱、干旱、鹽、重金屬等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯等

研究與環(huán)境原因相關(guān)蛋白質(zhì)，觀察它們在逆境環(huán)境條件下表示量改變，并研究它們是怎樣抵抗外界不利生長環(huán)境，維持細胞生命活動環(huán)境蛋白質(zhì)組學：植物蛋白質(zhì)組學專家講座第26頁

蛋白磷酸化是植物細胞將外界信號傳遞到細胞內(nèi)一個主要伎倆，磷酸化能夠改變蛋白質(zhì)生物活性、亞細胞定位，影響蛋白質(zhì)之間相互作用，更主要是這種改變是雙向，及蛋白質(zhì)活性、細胞定位等能夠經(jīng)過磷酸化和去磷酸化來調(diào)整。

研究現(xiàn)實狀況：植物磷酸化蛋白質(zhì)組研究還是以單個蛋白質(zhì)為主，采取技術(shù)伎倆有Westernblot,2-DE,用MS/MS分析磷酸化酯酶處理后蛋白質(zhì)樣品等。近年來伴隨各種新技術(shù)發(fā)展，植物磷酸化蛋白質(zhì)組研究也有了很大進展。比如用2-DE和MS/MS聯(lián)用，堅定了馬鈴薯線粒體內(nèi)14個磷酸化蛋白，擬南芥質(zhì)膜磷酸化蛋白質(zhì)組研究共判定了300多個磷酸化位點。植物蛋白質(zhì)組學專家講座第27頁5.植物蛋白質(zhì)組學研究前景和挑戰(zhàn)

植物蛋白質(zhì)組學研究與應用面臨3個主要問題：

1.表示整體分析以及蛋白質(zhì)組編目大規(guī)模整體性分析蛋白質(zhì)在某一個細胞或組織中含量以及動態(tài)表示是蛋白質(zhì)組學研究目標之一。

2.大規(guī)模蛋白質(zhì)功效研究蛋白質(zhì)最大挑戰(zhàn)是判定每一個蛋白質(zhì)以及它們異構(gòu)體功效，一個較有前景策略是經(jīng)過酵母雙雜交系統(tǒng)整體性研究植物蛋白質(zhì)之間相互作用。

3.建立完整蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡建立蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)，不但能夠提供蛋白質(zhì)之間相互關(guān)系信息，而且還能夠和基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學等信息聯(lián)絡起來。

植物蛋白質(zhì)組學專家講座第28頁

謝謝植物蛋白質(zhì)組學專家講座第29頁

基因組(DNA)

轉(zhuǎn)錄組(RNA)蛋白質(zhì)組(PROTEIN)CitrateCycle代謝組(biochemicalmolecular)植物蛋白質(zhì)組學專家講座第30頁植物蛋白質(zhì)組學專家講座第31頁實例植物組織2-DE分析pH3

pH10100KD10KD物種：水稻組織名稱：根部制備方法：液氮研磨+TCA-丙酮沉淀法上樣量：5