類器官技術及其對消化系統(tǒng)腫瘤的臨床應用

一、引言人類的消化系統(tǒng)主要由口腔、食道、胃腸道，以及唾液腺、肝臟、胰腺等輔助器官組成。起源于消化道和輔助器官的消化系統(tǒng)腫瘤是目前最常見的癌癥類型，包括食管癌、胃癌、結直腸癌（CRC）、肝癌和胰腺癌。其中，食管癌、胃癌、結直腸癌的發(fā)病率在全球惡性腫瘤中分別排在第八、第五、第三位。胃癌和結直腸癌分別是全球第三大和第二大癌癥相關死亡原因。此外，肝癌和胰腺癌因確診較晚且對治療反應有限，是最致命的惡性腫瘤。總的來說，這些消化系統(tǒng)腫瘤占人類癌癥發(fā)病率的25%以上，占癌癥相關死亡原因的35%。因此，臨床上亟需為這些癌癥制定更加有效的治療策略。然而，開發(fā)新的治療方法的主要障礙之一是缺乏能夠很好地再現(xiàn)患者腫瘤特征的癌癥模型。以往人們通過各種模型對消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機制和治療策略進行了大量的研究。目前，患者來源的腫瘤細胞系（PDC）和腫瘤異種移植（PDX）是最常用的腫瘤模型。二維培養(yǎng)的PDC因缺乏腫瘤結構和微環(huán)境的特點，限制了其在臨床前研究中的應用。雖然與PDC相比，PDX可以更好地模擬人類腫瘤生物學特性，但也存在成功率低、周期長等缺點。近年來，三維（3D）培養(yǎng)技術已經被用于開發(fā)新的和更接近人類生理的癌癥模型。值得一提的是，Sato等利用單個LGR5+的干細胞成功建立了3D腸道隱管-絨毛結構，稱為腸類器官。這項研究為其他消化系統(tǒng)類器官的建立奠定了基礎。目前為止，研究者已經建立了大多數(shù)消化系統(tǒng)的類器官，包括結腸、肝臟、胰腺、胃、唾液腺、食道。這些3D培養(yǎng)的類器官模擬了原始組織的組織學和遺傳學特征，比PDC和PDX具有更多優(yōu)勢。因此，類器官已成為消化系統(tǒng)腫瘤研究的理想模型。本文中，我們討論了類器官的建立方法及其在基礎和轉化研究中的應用。二、消化系統(tǒng)類器官的建立（一）類器官的細胞來源理論上，類器官可以從含有干細胞的組織或結構中生成。目前，建立正常類器官的細胞來源包括多能干細胞（plurpotentstemcells,PSC）和成體干細胞（adultstemcells,ASC）（圖1）。成體干細胞廣泛存在于各種組織類型中，負責組織維護和損傷修復。例如，研究表明LGR5可作為各種消化道上皮細胞的干細胞標記物。在多種生長因子和其他刺激存在的情況下，組織來源的成體干細胞可以在3D基質中高效地生長為類器官。兩種PSC——胚胎干細胞（ESC）和誘導多能干細胞（iPSC）——可以用來建立類器官。由于人類ESC既不方便獲取也不符合倫理要求，在這里不作討論。iPSC具有自我更新和分化的能力，已被廣泛應用于正常的類器官構建。由于癌癥類型和致癌突變的差異，不同患者來源的iPSC生成腫瘤類器官的效率不同。因此，iPSC來源的類器官通常需要選擇性地培養(yǎng)為特定亞型，缺乏原始腫瘤的遺傳異質性。

圖1.消化系統(tǒng)類器官的構建。（二）一般步驟從小鼠和人類成體組織中構建消化系統(tǒng)類器官的方法已經有大量研究報道。這里將大致步驟總結如下。首先，采集標本后，去除肌肉、結締組織等多余組織。然后，將組織剪碎，并在溫和的蛋白酶，如膠原酶或中性蛋白酶中進行消化。對于表達特異性干細胞標記物的單個干細胞，可以通過流式細胞術進行分選。接下來，將消化后的混合細胞或干細胞懸液包裹于3D細胞外基質（如Matrigel），該基質能夠幫助細胞分化和進行空間組織，使其成為具有功能的類器官。Matrigel凝固后，加入含多種生長因子、分化因子和細胞因子的類器官培養(yǎng)基。每3~5天更換一次培養(yǎng)基，單細胞一般可在1周內形成3D類器官結構。這些類器官可以進行連續(xù)傳代和凍存，同時保持其形態(tài)特征和基因組穩(wěn)定性。PSC產生類器官的過程是緊密模仿胚胎發(fā)育的過程。該過程通常包括三個步驟：胚層誘導、組織特異性球體形成和類器官特化。由于消化系統(tǒng)均由內胚層來源的組織構成，因此內胚層形成對消化系統(tǒng)類器官的建成至關重要。在這一過程中，激活素A和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）被用來誘導最終內胚層形成；然后添加一組生長因子來誘導前腸（WNT3A、FGF4、NOGGIN）或中/后腸（WNT3A、FGF4）分化。此外，在最后一天添加視黃酸，以誘導前腸內胚層的后續(xù)分化。經過以上處理，2~4天內可以觀察到漂浮的3D球體的形成。最后，將球體重懸于Matrigel中，覆蓋相應的類器官培養(yǎng)基。（三）消化系統(tǒng)類器官的培養(yǎng)體系類器官培養(yǎng)體系由類器官培養(yǎng)基和細胞外基質（ECM）組成。該體系模擬了體內干細胞自我更新的微環(huán)境，支持干細胞的體外擴張和3D組織。類器官培養(yǎng)基由各種生長因子、分化刺激因子和小分子化合物構成，是成功建立類器官的關鍵。所有的類器官培養(yǎng)基的基礎成分一般包含：advancedDMEM/F12、青霉素/鏈霉素、HEPES、GlutaMAX、N2、B27、煙酰胺、N-乙酰半胱氨酸以及其他生長因子和抑制劑。盡管不同消化系統(tǒng)類器官的干細胞微環(huán)境的組成存在差異，但以下因子對大多數(shù)消化系統(tǒng)類器官的培養(yǎng)是必不可少的，包括受體酪氨酸激酶配體（EGF和FGF10）、Wnt激動劑（WNT3A和R-spondin）、BMP抑制劑（NOGGIN）和轉化生長因子（TGF）-β抑制劑。此外，根據(jù)組織來源還需添加其他因子或抑制劑以促進類器官的擴增（表1）。

表1消化系統(tǒng)類器官培養(yǎng)基成分

由于Wnt信號在維持消化道干細胞活性中發(fā)揮重要作用，因此所有消化系統(tǒng)類器官培養(yǎng)基中均含有WNT3A和R-spondin。研究證明BMP信號通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制腸道干細胞的自我更新，因而BMP的拮抗蛋白是干細胞長期維持所必需的。表皮生長因子EGF與上皮細胞的增殖相關，是培養(yǎng)基的另一個重要組成部分。FGF10被證明在消化道發(fā)育過程中可促進細胞增殖、抑制分化，因此，其在胃、肝臟、胰腺類器官的培養(yǎng)中是必要的。胃泌素能促進胃細胞增殖，在大多數(shù)消化系統(tǒng)類器官的培養(yǎng)基中也是必需的。除以上生長因子外，類器官培養(yǎng)還需添加一組小分子化合物。Rho激酶抑制劑Y-27632可有效抑制單個干細胞的失巢凋亡，是有效建立肝臟類器官所必需的。煙酰胺也稱為維生素B3，被證明可以抑制乙?；竤irtuins的活性，促進人結腸類器官的形成。研究證明TGF-β信號通路可抑制結腸上皮細胞增殖，促進細胞凋亡和分化，因而在類器官培養(yǎng)基中加入TGF-β抑制劑A83-01以提高構建效率。P38抑制劑SB202190被發(fā)現(xiàn)可以提高接種效率，促進人結腸類器官的連續(xù)傳代。據(jù)報道，前列腺素E2（PGE2）可防止脫離誘導的細胞死亡和激活經典的Wnt信號通路，并被發(fā)現(xiàn)對人消化系統(tǒng)干細胞增殖是必要的。與二維培養(yǎng)系統(tǒng)不同，類器官培養(yǎng)需要ECM來輔助形成類似器官結構的空間排列和3D模式。ECM由大量具有不同物理和生化性質的成分組成，包括糖蛋白、蛋白多糖和多糖等。從小鼠肉瘤中提取的Matrigel是目前類器官培養(yǎng)體系中應用最廣泛的ECM。Matrigel由多種細胞外基質蛋白組成，如膠原蛋白、層黏連蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖等，能夠為體外培養(yǎng)的細胞提供生理環(huán)境。（四）類器官鑒定標準目前，對于類器官的鑒定沒有統(tǒng)一的標準?？偨Y現(xiàn)有文獻，鑒定類器官的通用標準是保留原始組織的形態(tài)和遺傳特征。首先，類器官需具備起源組織的組織病理學特征，這些可以通過蘇木精-伊紅（H&E）染色和免疫染色等組織學分析來識別。例如，肝臟類器官可以通過肝細胞標志物ALB和HepPar1來鑒別，膽管細胞類器官可以通過KRT19膽道標志物來鑒別。類器官還應保持起源組織的遺傳特征，可以通過基因組和轉錄組測序等方法進行分析。我們相信，在以后的研究中，功能表征也應該成為鑒定類器官的一個必要標準。真實的器官功能再現(xiàn)能夠實現(xiàn)類器官在再生醫(yī)學中的應用。例如，在最近一項令人振奮的研究中，Sampaziotis等建立的膽管細胞類器官可在移植后修復人膽管上皮。三、消化系統(tǒng)腫瘤類器官的建立正常消化系統(tǒng)類器官培養(yǎng)方法已成功應用于患者腫瘤組織來源的類器官培養(yǎng)。迄今為止，研究者已經成功建立了多種消化系統(tǒng)腫瘤患者來源的腫瘤類器官，包括食道、胃、小腸、結腸、肝臟和胰腺。一般來說，可以通過手術切除或活檢獲取腫瘤組織，建立腫瘤類器官。大部分腫瘤類器官的培養(yǎng)基成分與對應的正常類器官的培養(yǎng)基成分相同。然而，根據(jù)腫瘤樣本特定的突變背景和異常激活通路，在缺失某些特定因子的情況下，消化系統(tǒng)腫瘤類器官通常能夠更有效地生長。食管癌可分為食管腺癌（EAC）和食管鱗狀細胞癌（ESCC）兩種亞型。已有研究成功從人EAC和ESCC組織中建立了食管腫瘤類器官。Li等構建了EAC患者來源的類器官，再現(xiàn)了EAC的形態(tài)、轉錄組和基因組特征。Kijima等利用小鼠食管類器官的培養(yǎng)基配方，從ESCC患者的活檢組織中同時建立了腫瘤和非腫瘤類器官。多項研究發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下，正常類器官往往比腫瘤類器官生長更旺盛，這可能與腫瘤類器官基因組不穩(wěn)定及其導致的細胞凋亡有關。因此，可以通過對培養(yǎng)基進行調整，添加或去除某些因子，以促進腫瘤類器官的生長，抑制非腫瘤類器官的過度生長。例如，建立胃癌類器官時，若APC基因突變導致Wnt信號異常激活，則不需要加入WNT3A；若為RAS/MAPK信號通路突變，則不需要加入EGF；若有TGF-β信號通路突變則不需要加入A83-01。結直腸癌是一種高度異質性腫瘤，不同患者的遺傳改變、臨床表現(xiàn)和預后各異。據(jù)報道，結直腸癌最常見的突變信號通路包括Wnt、RAS/MAPK、PI3K、TGF和TP53信號。因此，研究人員利用不同亞型對培養(yǎng)因子需求的差異，有選擇地擴增結直腸腫瘤類器官。Fujii等從不同組織學亞型和臨床分期的患者組織中建立了一系列結直腸腫瘤類器官。通過轉錄組分析對這些類器官進行鑒別，并根據(jù)對因子的不同需求進行選擇培養(yǎng)。他們還證明，這些類器官能夠很好地模擬原始腫瘤組織的組織病理分級和分化程度。研究者通過使用特定的分離和擴增培養(yǎng)基，成功構建了原發(fā)性肝癌[包括肝細胞癌（HCC）、膽管癌（CC）和混合癌（CHC）]的類器官。值得注意的是，為了避免非腫瘤類器官的生長，Broutier等調整了正常肝臟類器官的構建方法：①延長組織消化時間；②調整培養(yǎng)基成分，去除R-spondin1、NOGGIN和WNT3A，添加地塞米松和Rho激酶抑制劑。如上文提到，類器官也可從iPSC中獲得，已有幾項研究報道了利用iPSC建立肝臟腫瘤類器官。例如，Sun等利用重編程的人肝臟細胞進行TP53、RB的失活，建立了肝臟類器官，然后通過基因過表達致癌基因c-Myc和RAS建立肝癌類器官模型。多個研究團隊已經成功建立了胰腺癌類器官。與肝臟腫瘤類器官相似，胰腺癌類器官可以從不同來源獲得。手術切除的腫瘤組織是胰腺癌類器官的主要來源。Boj等對小鼠與人的正常和胰腺腫瘤組織均建立了類器官模型。他們通過原位移植實驗證明，這些胰腺腫瘤類器官完全模擬了腫瘤的發(fā)展進程：先是形成早期贅生物，進而發(fā)展為局部侵襲性和轉移性腫瘤。另一團隊報道，通過在iPSC來源的前體類器官中表達突變KRAS或TP53，成功建立了胰腺癌模型。四、類器官在消化系統(tǒng)腫瘤模型中的應用（一）宿主-病原體相互作用與其他惡性腫瘤不同，消化系統(tǒng)腫瘤與病原性感染顯著相關，如胃癌與幽門螺桿菌、膽囊癌與腸沙門氏菌、肝癌與肝炎病毒。然而，病原體的感染和癌癥進展之間的關系仍不甚清楚。將包含原始組織所有細胞類型的類器官與特定病原體共培養(yǎng)或進行感染實驗，可以研究以上問題。多項研究證明，胃類器官可以作為一種有效的幽門螺桿菌感染模型。如Bartfeld等利用顯微注射法將幽門螺桿菌注射至胃類器官，發(fā)現(xiàn)胃癌相關基因表達上調。在另一項研究中，McCracken等證明，幽門螺桿菌感染胃類器官，導致c-Met顯著激活，并促進上皮細胞增殖。Scanu等利用小鼠膽囊類器官與腸道沙門氏菌共培養(yǎng)體系，研究病原體感染對膽囊癌發(fā)展的影響。他們發(fā)現(xiàn)，腸道沙門氏菌通過激活AKT和MAPK信號通路，誘導膽囊類器官出現(xiàn)不依賴生長因子的生長和惡性轉化。也可建立類器官的病毒感染模型，用于研究病毒與腫瘤的關系。例如，Yin等利用腸道類器官模擬輪狀病毒感染并評估抗病毒藥物效果。同樣，也可以將肝臟類器官作為一個潛在的模型，研究病毒感染及其與肝炎病毒相關的肝細胞癌發(fā)展之間的聯(lián)系。（二）類器官作為消化系統(tǒng)腫瘤進展模型的應用腫瘤的起始和進展通常是腫瘤驅動基因突變逐漸積累的結果。因此，破譯腫瘤發(fā)展中的突變過程是非常重要的。目前，全基因組測序已經發(fā)現(xiàn)了消化系統(tǒng)腫瘤相關的大量基因突變。然而，對于這些突變中的大部分，尚不能確定它們是否具有腫瘤驅動功能。以往的腫瘤發(fā)生研究主要基于腫瘤細胞系和動物模型。然而，從起源組織建立腫瘤細胞系的效率非常低，并且腫瘤細胞系不能完全保留原代腫瘤的遺傳特征。雖然小鼠模型被廣泛用于建立致癌突變模型，但建立轉基因小鼠需要耗費較多的時間和資源，并且種間差異會影響實驗結果的可靠性。類器官能夠在長時間的培養(yǎng)中保持遺傳和表型穩(wěn)定。CRISPR-Cas9是一種新型的基因組編輯工具，能夠實現(xiàn)在特定基因組位點引入DNA雙鏈斷裂，使得基因修飾技術比以往的基因組編輯方法更加方便和高效。CRISPR-Cas9和類器官技術的結合將極大地克服上述限制。近期已經有研究人員利用人類的正常結腸類器官建立了腫瘤的起始和進展模型。研究者利用CRISPR-Cas9技術，將結直腸癌中4個最常見的突變基因（APC、TP53、KRAS和SMAD4）依次引入正常結腸類器官。通過調節(jié)培養(yǎng)基中生長因子的組成來篩選獲得突變體類器官。研究發(fā)現(xiàn)APC和P53的缺失是結直腸癌中染色體不穩(wěn)定和異倍體產生的主要驅動因素。類似的，研究者利用CRISPR-Cas9介導的基因組編輯技術在人類胰腺導管類器官中建立了胰腺癌進展模型。除了成體干細胞來源的類器官外，iPSC來源的類器官也已被用于消化系統(tǒng)腫瘤的起始和進展建模。上文提到，肝癌的起始可以通過對iPSC來源的肝臟類器官進行致癌基因或抑癌基因編輯來建模?？傊惼鞴倩蚓庉嫾夹g將作為一種方便可行和高通量的工具，用以評估突變基因的功能。五、藥物開發(fā)和腫瘤個性化治療在過去幾十年中，在傳統(tǒng)腫瘤細胞系中篩選出大量抗腫瘤藥物。然而，這些新發(fā)現(xiàn)的藥物中的大部分在臨床試驗中未能達到預期效果。患者來源的腫瘤類器官保留了原始腫瘤的基因組、轉錄組和組織學特征，可以作為抗腫瘤藥物篩選和測試的更好模型。研究證明，腫瘤類器官的藥物敏感性與腫瘤組織的分子分型相匹配。例如，vandeWetering等利用結直腸癌類器官檢測一組化合物的作用，發(fā)現(xiàn)攜帶TP53突變的類器官對nutlin-3a（MDM2的抑制劑）具有抗性，而攜帶RAS突變的類器官對EGFR抑制劑不敏感；另外還發(fā)現(xiàn)攜帶RNF43

（Wnt通路的一種負性調控因子）突變的類器官對Wnt抑制劑超敏感。越來越多的研究表明類器官可以精準地預測患者對抗腫瘤藥物的反應。最近，Vlachogiannis等建立了患者來源的結直腸癌和胃食管癌類器官，并測試了這些類器官能否預測患者對抗癌藥物的治療反應。他們發(fā)現(xiàn)患者源性類器官（PDO）在預測患者對靶向藥物或化療的反應方面具有很高的預測價值（陽性準確率88%，陰性準確率100%）。最近的兩項研究也報道了直腸癌類器官在預測患者對放化療的反應中的成功應用。總之，以上研究有力地證明了PDO在臨床試驗中能夠真實模擬患者的反應，為新模式的個性化醫(yī)療奠定了基礎（圖2）。圖2.消化系統(tǒng)腫瘤類器官的構建和應用。除了PDO能夠有效預測患者反應外，將類器官用于藥物開發(fā)的另一個主要優(yōu)勢是方便操作且節(jié)約成本，能夠實現(xiàn)患者個性化的高通量藥物篩選?；铙w腫瘤類器官生物庫可用于藥物篩選，促進新藥開發(fā)。目前為止，已經建立了結腸、胰腺、肝臟、胃等多種消化系統(tǒng)腫瘤的活體類器官生物庫。例如，建立了包含人胃癌多種腫瘤亞型的類器官生物庫，通過測試類器官對順鉑和五氟類藥物的反應，他們發(fā)現(xiàn)類器官與相應患者的藥物反應一致。研究人員還利用胃癌類器官生物庫進行了大規(guī)模的藥物篩選，發(fā)現(xiàn)了新的潛在靶向藥物。在一項膽道腫瘤（BTC）的研究中，Saito等建立了BTC來源的類器官并進行了藥物篩選，發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物阿莫羅芬和芬替康唑顯著抑制BTC類器官的生長。此外，嚴重的副作用是導致藥物臨床試驗失敗的主要原因之一。因此，類器官技術的另一個巨大的優(yōu)勢是，從患者身上可同時獲得健康類器官和腫瘤類器官，有望實現(xiàn)專門針對腫瘤細胞而不損害健康細胞的藥物篩選。六、免疫療法雖然研究發(fā)現(xiàn)越來越多的抗腫瘤藥物，但耐藥性的產生往往導致治療效果不佳。在這種情況下，通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤細胞的免疫療法正在成為一種強有力的抗癌策略。然而，由于缺乏測試此類治療效果的臨床前模型，限制了免疫治療的臨床應用。研究者正努力探索如何將免疫系統(tǒng)整合到類器官的培養(yǎng)中。研究表明，可以利用共培養(yǎng)系統(tǒng)在類器官培養(yǎng)中加入免疫細胞。2017年的一項研究采用氣-液界面的方法，將CD45+淋巴細胞與人結直腸癌類器官共培養(yǎng)，可維持存活長達8d。Neal等采用類似的方法建立了保留腫瘤微環(huán)境的患者來源的腫瘤類器官。研究中，巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷（NK）細胞、自然殺傷T（NKT）細胞等免疫細胞在共培養(yǎng)體系中成功存活了30d。類器官-免疫細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的成功建立為腫瘤免疫治療研究提供了一個前所未有的模型。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，類器官中的腫瘤細胞能夠為免疫細胞提供抗原特異性刺激。Dijkstra等利用患者自身結直腸癌類器官和外周血淋巴細胞共培養(yǎng)來擴增腫瘤反應性T細胞。獲得T細胞后，再檢測其對相應的肺癌類器官的殺傷效率。Chakrabarti等通過將小鼠來源的胃癌類器官與自體免疫細胞共培養(yǎng)，檢測PD-L1檢查點抑制的抗腫瘤效果?；谇逗峡乖荏w（CAR）的治療是另一種重要的免疫治療策略。在2019年的一項研究中，Schnalzger等使用患者來源的結直腸癌類器官測試了CAR改造的NK-92細胞的殺傷效率。在多種消化系統(tǒng)腫瘤類器官建立的基礎上，類器官與免疫細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)可用于個性化免疫治療策略的開發(fā)和評估，這將成為一種非常有價值的模型。七、不足和展望盡管類器官技術作為一種體外癌癥模型展現(xiàn)出巨大潛力，但仍然存在局限性。首先，最明顯的缺點之一是缺乏細胞類型的多樣性，如缺乏間質、血管、免疫細胞和神經細胞，使其不能完全模擬復雜的腫瘤微