細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

細(xì)胞室準(zhǔn)備室：用于進(jìn)行培養(yǎng)器皿清楚、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)準(zhǔn)備和消毒以及供給物品保藏等.緩沖間：為了降低將外界污染源頭帶入培養(yǎng)室培養(yǎng)室：是專門用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各種無菌操作試驗(yàn)室。其基本條件是：清潔、無菌、干燥、不通風(fēng)，并含有適宜光線。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第1頁體外培養(yǎng)設(shè)備和器具超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮保留罐、離心機(jī)、水純化裝置、高壓蒸汽消毒裝置、酶標(biāo)儀過濾除菌裝置、手術(shù)器械、培養(yǎng)器皿、移液器細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第2頁超凈工作臺(tái)

利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣經(jīng)過高效空氣微粒濾層凈化后，漸漸經(jīng)過工作臺(tái)面，在操作區(qū)形成無菌環(huán)境。按氣流方向不一樣分為：1.外流式，2.側(cè)流式細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第3頁CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意問題：

①使用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以確保通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣潔凈。定時(shí)消毒。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3升，以保持箱內(nèi)濕度，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第4頁自動(dòng)雙重純水蒸餾器細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第5頁培養(yǎng)器皿一次性培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板：普通朔料培養(yǎng)器皿細(xì)胞生長(zhǎng)面帶負(fù)電荷，有利于大多數(shù)表面帶正電荷細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)玻璃培養(yǎng)瓶、溶液瓶、移液管細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第6頁慣用玻璃器皿清洗浸泡：在5%稀鹽酸溶液中浸泡12h以上，以到達(dá)軟化器皿表面所附著物質(zhì)，并中和器皿表面堿性物質(zhì)。刷洗：用軟毛毛刷將浸泡后其面在洗滌劑水中重復(fù)刷洗，以除去表面雜質(zhì)。浸酸：利用強(qiáng)氧化作用去除器皿表面可能殘留有機(jī)物,時(shí)間在6小時(shí)以上最好過夜。沖洗：重復(fù)注滿水、倒空達(dá)20次以上。最終用二次水浸洗2～3次，烘干后包裝。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第7頁清潔液配制細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第8頁膠塞和塑料用具清洗先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分鐘，自來水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘，最終分別用自來水和三次水各沖洗3次，烘干備用。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第9頁過濾除菌裝置1.不銹鋼板式濾器：2.微孔濾膜濾器：有可換膜式濾器和一次性濾器兩大類。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第10頁細(xì)胞培養(yǎng)概念原代培養(yǎng)：就是首次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)皿中就不再分割，任其生長(zhǎng)繁殖而不更換生長(zhǎng)器皿。它包含：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：伴隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)、細(xì)胞分裂繁殖，細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度逐步減慢甚至停頓，在這種情況下，都需要將培養(yǎng)物分割成小培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第11頁原代培養(yǎng)細(xì)胞生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期衰退期細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第12頁體外細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)類型貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第13頁每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過程游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間改變成倍增加，活力最正確，最適合進(jìn)行試驗(yàn)研究。停頓期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。其機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第14頁細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第15頁細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第16頁傳代方法依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)恃點(diǎn)，傳代方法有3種。1.懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

離心法傳代：離心（1000r/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2.半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）這類細(xì)胞部分展現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3.貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采取酶消化法傳代。慣用消化液有0.25％胰蛋白酶細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第17頁貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法1.吸光培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液,用PBS溶液清洗2-3次。2.加入1-2ml0.25％胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4.用吸管吸收瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，重復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5.吸收1/10—1/40細(xì)胞懸液，接種于新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7.將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第18頁培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)條件1.細(xì)胞營養(yǎng)需要2.細(xì)胞生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第19頁細(xì)胞培養(yǎng)用液水：新鮮配置三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+緩沖液PBS：NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4·H2O1.56gKH2PO40.20g加水至1000mlPH值調(diào)至7.2-7.4細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第20頁消化液1.胰蛋白酶：主要用是0.25％胰蛋白酶液，胰蛋白酶是一個(gè)黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+PBS緩沖液配制，過濾除菌。它作用于與賴氨酸或精氨酸相連接肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。濃度越高，作用越強(qiáng)，但超出一定程度會(huì)損傷細(xì)胞。用含血清培養(yǎng)液終止其消化作用。2.EDTA：是一個(gè)化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定解離作用。毒性小、價(jià)格廉價(jià)、使用方便。3.膠原酶溶液：又稱羧肽酶，有膠原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型及肝細(xì)胞專用膠原酶5種，可依據(jù)制備不一樣組織細(xì)胞懸液選擇不一樣類型膠原酶細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第21頁培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第22頁1.天然培養(yǎng)基：有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成份豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：起源受限，成份復(fù)雜，影響對(duì)一些試驗(yàn)產(chǎn)物提取和試驗(yàn)結(jié)果分析，易發(fā)生支原體污染。2.合成培養(yǎng)基：是依據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成。主要成份是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低。缺點(diǎn)：缺乏一些成份，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要，還需補(bǔ)充一定量天然培養(yǎng)基（如血清）細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第23頁慣用血清有：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第24頁血清中含有：各種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）各種金屬離子；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成份細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第25頁普通說來．含5％小牛血清培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞能夠維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)普通需加10％血清．對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)生物學(xué)效應(yīng)已得到證實(shí)，但對(duì)血清中復(fù)雜成份至今還未完全清楚。血清中不但存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同時(shí)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，所以在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞所反應(yīng)生物學(xué)特征是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表示調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第26頁血清質(zhì)量好壞是試驗(yàn)成敗關(guān)鍵。慣用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清消毒：過濾除菌細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第27頁抗菌素使用在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在細(xì)菌生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第28頁完全培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％～95％血清5％～20％HEPES、碳酸氫鈉按培養(yǎng)基類型添加青、鏈霉素各100單位／毫升細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第29頁RPMI-1640培養(yǎng)基配制：RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.2gHEPES2.385g青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過濾除菌。調(diào)整pH值至7.2-7.4加血清（終濃度10％）細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第30頁細(xì)胞凍存和復(fù)蘇冷凍保留就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑溶液中，以一定冷凍速率降至超低溫條件，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)久保留過程。復(fù)蘇是一定復(fù)溫速率將凍存培養(yǎng)物回復(fù)到常溫過程。凍存和復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。假如遲緩冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大冰晶。大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目標(biāo)是預(yù)防小冰晶形成大冰晶，即冰晶重結(jié)晶。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第31頁慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可快速放入液氮中簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，經(jīng)過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第32頁低溫保護(hù)劑應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提升凍存效果。慣用低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一個(gè)滲透性保護(hù)劑，可快速透入細(xì)胞，提升胞膜對(duì)水通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，降低胞內(nèi)冰晶，從而降低冰晶對(duì)細(xì)胞損傷。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第33頁細(xì)胞凍存方法1.凍存液配制：含20%血清培養(yǎng)基,10%

DMSO2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5

×106細(xì)胞/ml)3.加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)識(shí)冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。4.年后，存活率可達(dá)80％以上。DMSO液用培養(yǎng)液配好，5.防止因暫時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。對(duì)人造血干細(xì)胞研究證細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第34頁細(xì)胞復(fù)蘇方法1.從液氮中取出冷凍管，快速投入37~38

℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。2.5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積10倍以上。3.低速離心10分鐘。4.去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第35頁培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)分死、活細(xì)胞是困難。細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣技術(shù)伎倆之一。

1.細(xì)胞克隆形成率試驗(yàn)2.臺(tái)盼藍(lán)法3.四唑鹽（MTT）比色法細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第36頁1.細(xì)胞克隆形成率試驗(yàn)：

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成細(xì)胞群體形成肉眼可見克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯?xì)胞增殖能力?？寺⌒纬陕时龋娇寺⌒纬蓴?shù)／接種細(xì)胞數(shù)缺點(diǎn)：操作繁瑣優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、可靠細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第37頁2.臺(tái)盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中百分比表示細(xì)胞活力。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)第38頁3.四唑鹽（MTT）比色法

MTT名為噻唑藍(lán)，其原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功效。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含藍(lán)紫色產(chǎn)物量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值MTT法簡(jiǎn)單快速