【課件】動物細胞融合技術與單克隆抗體課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

第二章動物細胞工程第2節(jié)動物細胞融合技術和單克隆抗體（第二課時）目錄/CONTENTS01動物細胞融合技術02制備單克隆抗體03單克隆抗體的應用04習題檢測學習目標：1.舉例說出動物細胞融合的概念、原理及應用。2.闡明利用動物細胞融合技術制備單克隆抗體的過程。3.認同單克隆抗體在臨床上有重要的應用價值。新課導入植物體細胞雜交植物細胞融合植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交技術打破生殖隔離,實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種。

提問：有沒有技術讓不同種動物的體細胞雜交，培育出集中不同細胞優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？新課導入實例：1970年，人—鼠細胞熒光標記融合實驗人細胞鼠細胞紅色熒光染料標記的膜蛋白綠色熒光染料標記的膜蛋白細胞融合人鼠雜交細胞37°培養(yǎng)40min細胞融合實驗表明：細胞膜具有一定的流動性新課導入思考：動物細胞進行融合，與植物有哪些不同之處？無需去除細胞壁；全能性受限制，不能培育成新的動物個體。顯微鏡下的動物細胞融合目錄01一、動物細胞融合技術一、動物細胞融合技術1.動物細胞融合技術（1）概念：指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。細胞膜具有一定的流動性。（2）原理：（3）誘導細胞融合的三種方法：物理法：電融合法化學法：聚乙二醇（PEG）融合法生物法：滅活病毒誘導法——動物細胞融合特有滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，并不破壞病毒的抗原結構。（4）過程：細胞膜融合細胞核融合細胞質融合細胞融合的實質：一、動物細胞融合技術思考：19世紀30年代，科學家曾在肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。肺結核病人病理切片原理是什么？滅活病毒誘導法一、動物細胞融合技術病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。滅活病毒誘導法原理用滅活的病毒誘導動物細胞融合過程：病毒顆粒滅活的病毒顆粒粘附于細胞表面，使細胞互相凝聚細胞膜融合細胞核融合形成雜交細胞細胞膜打開細胞質融合融合完成的標志一、動物細胞融合技術（5）結果：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。（6）意義：形成單核的雜交細胞。即融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。（7）應用：研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段，特別是利用動物細胞融合技術發(fā)展起來的雜交瘤細胞技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。一、動物細胞融合技術1、動物細胞完成融合實質及完成的標志是什么？【思考討論】當兩個細胞核融合后形成具有單核的雜交細胞，標志動物細胞融合完成。2、不滅活的病毒能否作為誘導劑？不能。用病毒作為誘導劑時，必須事先滅活，使病毒失去感染和增殖能力，但不破壞病毒的抗原結構。而不滅活的病毒會感染細胞，不能誘導細胞融合。一、動物細胞融合技術動物細胞融合與受精作用的區(qū)別注意說明（1）受精作用：是在同種生物之間進行的，精子與卵細胞的融合不需要任何誘導劑，受精卵內具備同種生物的兩個親本的遺傳物質。（2）動物細胞融合可在不同物種間進行，由于物種間存在生殖隔離，所以自然條件下不能融合成雜交細胞，必須有誘導劑才能融合。形成的雜交細胞具備兩個親本細胞的遺傳物質，從而體現(xiàn)兩個親本的遺傳特性。受精作用動物細胞融合一、動物細胞融合技術植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志意義主要用途細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞聚乙二醇（PEG）融合法、電融合法、離心法；高Ca2+-高pH融合法聚乙二醇（PEG）融合法、電融合法、滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體習題檢測1．與植物原生質體相比，動物細胞融合特有的誘因因素有聚乙二醇（PEG）、滅活的病毒（）2．滅活的含義是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但是不破壞它們的抗原結（）二倍體動物細胞融合后的雜交細胞仍然是二倍體細胞（）×√√習題檢測1．下列關于動物細胞融合技術及意義的敘述，不正確的是(

)A．可以利用動物細胞融合技術生產細胞因子

B．動物細胞融合可打破生殖隔離獲得新物種

C．細胞融合過程與細胞膜的結構特點直接相關

D．動物細胞融合為制備單克隆抗體開辟了新途徑B習題檢測2．下列對植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較，描述正確的是(

)A．動物細胞融合與植物原生質體融合的基本原理相同，誘導融合的方法也完全相同B．兩者都可以跨越種屬間的生殖隔離，突破有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能C．利用植物體細胞雜交技術而發(fā)展起來的雜交瘤技術，為生產單克隆抗體開辟了新途徑D．目前科學家終于實現(xiàn)了兩個植物物種間的體細胞雜交，得到了同時具有兩個物種遺傳物質的“超級植物”，并使它們的性狀全部得以體現(xiàn)B二、制備單克隆抗體2021年，全國在抗擊COVID-19疫情的時候，我們從新聞里看到很多康復者在捐獻血漿，用來治療其他病人。那么，血漿里到底是什么東西能夠治療新型冠狀病毒感染？但是一個捐獻者200~300ml的血漿，如果合格，也只能治療2~3個患者?？祻突颊唧w內有大量的綜合抗體對抗病毒如何解決？目錄02二、制備單克隆抗體二、制備單克隆抗體早期獲得抗體的方法傳統(tǒng)抗體制備方法：向動物體內反復注射某種抗原，使動物產生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體?？乖荒軣o限增殖產生大量抗體動物體內抗原

反復注射漿細胞抗體篩選單一B細胞增殖分化抗體不純缺點：產量低，純度低，制備的抗體特異性差。如何解決這個問題呢？二、制備單克隆抗體閱讀P49并思考：科學家發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞有什么特點？（１）動物體內產生的特異性抗體種類多達百萬種；（２）每個B淋巴細胞（漿細胞）只分泌一種特異性的抗體?？茖W家發(fā)現(xiàn)：單一B淋巴細胞每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體

選擇克隆細胞群大量純度高、特異性強的抗體產生①大量制備單一抗體的思路：②存在的問題：B淋巴細胞不可能無限增殖（漿細胞高度分化）二、制備單克隆抗體什么細胞能無限增殖？癌細胞如骨髓瘤細胞（體外可以大量增殖，但是不能產生抗體）有什么方法將這兩種細胞的特點結合起來？動物細胞融合技術③解決方案：一個極富創(chuàng)造力的方案：動物細胞融合雜交細胞動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體雜交瘤細胞既能迅速大量增殖，又能產生專一抗體二、制備單克隆抗體制備單克隆抗體二、制備單克隆抗體注射特定的抗原體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合用特定的抗原免疫小鼠，從脾中得到能產生特定抗體的B淋巴細胞。多種雜交細胞*不是為了得到抗體如BB、B瘤、瘤瘤等2.單克隆抗體的制備過程二、制備單克隆抗體雜交瘤細胞（多種）置于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)第一次篩選融合的細胞B細胞自身融合未融合的B淋巴細胞B瘤骨髓瘤細胞自身融合未融合的骨髓瘤細胞B瘤B瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。第一次篩選二、制備單克隆抗體知識拓展：第一次篩選獲得雜交瘤細胞。資料：已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。B淋巴細胞及同型融合細胞不能無限增殖，死亡骨髓瘤細胞及同型融合細胞不能合成DNA，死亡雜交瘤細胞能無限增殖，生長培養(yǎng)基中加入氨基喋呤（HAT選擇培養(yǎng)基）B淋巴細胞合成DNAS途徑D途徑不能分裂增殖骨髓瘤細胞不能合成DNAD途徑能無限增殖任務：請根據(jù)以上信息，設計一種方法，從培養(yǎng)基中篩選出雜交瘤細胞。雜交瘤細胞合成DNAS途徑D途徑不能分裂增殖二、制備單克隆抗體注射特定的抗原體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合用特定的抗原免疫小鼠，從脾中得到能產生特定抗體的B淋巴細胞。多種雜交細胞*不是為了得到抗體如BB、B瘤、瘤瘤等2.單克隆抗體的制備過程二、制備單克隆抗體篩選原因：由于小鼠體內提取的B淋巴細胞有很多種，形成的雜交瘤細胞也有很多種雜交瘤細胞(多種)能分泌所需抗體的雜交瘤細胞多孔培養(yǎng)板克隆化培養(yǎng)和抗體檢測將雜交瘤細胞群稀釋，約每孔1個進行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）一段時間后，用標記的抗原檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結合即為陽性孔）第二次篩選陽性孔多孔細胞培養(yǎng)板抗體檢測板(抗原-抗體雜交技術)二、制備單克隆抗體每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞多次96孔板培養(yǎng)和篩選克隆化培養(yǎng)抗體檢測檢測原理：抗原和抗體能夠特異性結合(分子水平的鑒定）—抗原抗體雜交法。在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。第二次篩選二、制備單克隆抗體在體外培養(yǎng)培養(yǎng)液中獲取從腹水中獲取篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞單克隆抗體【培養(yǎng)雜交瘤細胞的方法比較】項目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點缺點易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低規(guī)模小，產量少可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高相關技術和原理：動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)；細胞膜的流動性、細胞增殖（有絲分裂）二、制備單克隆抗體注射抗原用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產生特定抗體的B淋巴細胞多種B淋巴細胞培養(yǎng)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞細胞融合誘導融合多種雜交細胞雜交瘤細胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選：只有融合的雜交瘤細胞才能生長多輪次的克隆化培養(yǎng)和抗體檢測抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內增殖體外培養(yǎng)注射到腹腔單克隆抗體從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體二、制備單克隆抗體課堂小結多種B淋巴細胞B淋巴細胞注射特定抗原骨髓瘤細胞融合B-B細胞雜交瘤細胞瘤-瘤細胞多種雜交瘤細胞符合要求的雜交瘤細胞抗原—抗體雜交法

篩選2克隆化培養(yǎng)體外培養(yǎng)小鼠腹腔內增殖單克隆抗體B細胞瘤細胞選擇培養(yǎng)基篩選12、誘導其融合的方法有哪些？1、注射特定抗原的目的是什么？獲得能產生特定抗體的B淋巴細胞物理：電融合法化學：聚乙二醇（PEG）融合法生物：滅活病毒誘導法3、雜交瘤細胞的特點？既可以產生抗體，又可以大量增殖4、兩次篩選的目的？第1次篩選：得到雜交瘤細胞（多種）。第2次篩選：得到能分泌所需要抗體的雜交瘤細胞。二、制備單克隆抗體課堂小結多種B淋巴細胞B淋巴細胞注射特定抗原骨髓瘤細胞融合B-B細胞雜交瘤細胞瘤-瘤細胞多種雜交瘤細胞符合要求的雜交瘤細胞抗原—抗體雜交法

篩選2克隆化培養(yǎng)體外培養(yǎng)小鼠腹腔內增殖單克隆抗體B細胞瘤細胞選擇培養(yǎng)基篩選15、單克隆抗體制備過程中應用到的細胞工程技術手段？動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)6、單克隆抗體制備過程原理？細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖（有絲分裂）7、單克隆抗體的優(yōu)點？①能準確地識別抗原的細微差異。②與特定抗原發(fā)生特異性結合。③可以大量制備。（特異性強、靈敏度高、可大量制備）目錄03三、單克隆抗體的應用三、單克隆抗體的應用①作為診斷試劑：(最廣泛的用途)資料1:用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的"早早孕診斷試劑盒"，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10天左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。女性懷孕后會分泌一種糖蛋白,-人絨毛膜促性腺激素(HCG)，尿液中會檢出HCG的存在。用抗HCG單克隆抗體制備的試紙可以測試女性是否懷孕。(抗原-抗體雜交法)三、單克隆抗體的應用①作為診斷試劑：(最廣泛的用途)原理：準確識別各種抗原的細微差別，與抗原特異性結合，并可大量制備。優(yōu)點：準確、高效、簡易、快速同位素標記或熒光標記的單克隆抗體，在特定組織中成像，定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。三、單克隆抗體的應用資料2：使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現(xiàn)了對腫瘤西包的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成。②用于運載藥物：(主要用于癌癥的治療)單克隆抗體+接頭+藥物（如細胞毒素）=ADC三、單克隆抗體的應用②用于運載藥物：(主要用于癌癥的治療)優(yōu)點1、特異性強、靈敏度高，可以大量制備。優(yōu)點2、位置準確、療效高、毒副作用?。翰粨p傷正常細胞，減少劑量★組成：

——單抗導向，藥物為彈頭生物導彈——單克隆抗體＋抗癌藥物(放射性同位素/細胞毒素）單克隆抗體：導向作用，將藥物定向帶到癌細胞所在位置抗癌藥物：殺死癌細胞三、單克隆抗體的應用1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論：抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞。三、單克隆抗體的應用2.除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療。②一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療。①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復蘇利用，有利于控制產品的質量和標準化生產診斷試劑盒。②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？三、單克隆抗體的應用4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應用？你可以課后搜集資料，然后以“單克隆抗體在臨床上的應用”為主題，出一期黑板報或制作電子板報宣傳相關知識。

單克隆抗體在臨床上的應用涉及治療、診斷等方面。單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。在臨床診斷方面，單克隆抗體被廣泛用于一些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細胞因子的測定等。以單克隆抗體在診斷腫瘤方面的應用為例，用放射性同位素或熒光標記抗腫瘤表面抗原的單克隆抗體，可以用這些抗體來對體內的腫瘤進行定位，輔助診斷并確定腫瘤的復發(fā)與轉移等。曲妥珠單抗二、制備單克隆抗體項目第一次篩選第二次篩選（需要多次篩選）篩選原因篩選方法篩選結果誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞。用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。篩選獲得雜交瘤細胞因為小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經選擇培養(yǎng)基篩選獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞。用96孔板培養(yǎng)，在每個孔中盡量接種一個雜交瘤細胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌特定抗體的細胞獲得能分泌特定抗體的雜交瘤細胞第一次篩選和第二次篩選本章小結概述應用動物細胞融合技術結果意義原理融合方法原理應用單克隆抗體的制備免疫處理第一次篩選誘導融合第二次篩選大規(guī)模培養(yǎng)診斷試劑運載藥物治療疾病克隆化培養(yǎng)抗體檢測體外培養(yǎng)小鼠腹腔過程習題檢測1.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合后，得到的都是雜交細胞（）2.單克隆抗體制備過程中兩次篩選的目的相同（）3.ADC的抗體具靶向運輸作用，藥物具有治療作用（）××√習題檢測概念檢測（教材51頁）1.下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交比較的敘述，錯誤的是（

）

A.它們的原理都涉及細胞膜的流動性

B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合

C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞

D.前者主要為了獲得細胞產品，后者主要為了獲得雜種植株C習題檢測概念檢測（教材51頁）2.科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是（）

A.利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒

B.體外培養(yǎng)單個B淋巴細胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體

C.將等量B淋巴細胞和骨髓瘤細胞混合，經誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞

D.將純化的核衣殼蛋白反復注射到小鼠體內，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體A習題檢測擴展應用3.假如你掌握了動物細胞融合技術，你想用這種技術來解決哪些問題？解決這些問題的大致思路是怎樣的？這樣做會有什么風險？請查閱相關資料，完善自己的思路，并形成文字報告，與同學交流。

可以利用動物細胞融合技術培育多倍體胚胎，研究其發(fā)育機制，甚至可能培育出新的物種。但是，日前相關技術還不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等問題，并且還可能帶來些倫理方面的問題。真題檢測(2020全國卷)為研制抗病毒A的單克隆抗體，某同學以小鼠甲為實驗材料設計了以下實驗流程。(1)上述實驗前必須給小鼠甲注射病毒A，該處理的目的是

。(2)寫出以小鼠甲的脾臟為材料制備單細胞懸液的主要實驗步驟:

。(3)為了得到能產生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細胞，需要進行篩選。圖中篩選1所采用的培養(yǎng)基屬于

，使用該培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)的結果是

。圖中篩選2含多次篩選，篩選所依據(jù)的基本原理是

。(4)若要使能產生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細胞大量增殖，可采用的方法有(答出2點即可)

。誘導小鼠甲產生能夠分泌抗病毒A抗體的B淋巴細胞將小鼠的脾臟剪碎，用胰蛋白酶處理使其分散成單個細胞，加入培養(yǎng)液制成單細胞懸液選擇培養(yǎng)基抗原與抗體的特異性結合只有雜交瘤細胞能夠生存將雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔內增殖；將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)真題檢測（2023·北京·高考真題）1.甲狀旁腺激素（PTH）水平是人類多種疾病的重要診斷指標。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，有關制備過程的敘述不正確的是（）A．需要使用動物細胞培養(yǎng)技術B．需要制備用PTH免疫的小鼠C．利用抗原-抗體結合的原理篩選雜交瘤細胞D．篩選能分泌多種抗體的單個雜交瘤細胞D真題檢測（2022·山東·高考真題）2.如圖所示，將由2種不同的抗原分別制備的單克隆抗體分子，在體外解偶聯(lián)后重新偶聯(lián)可制備雙特異性抗體，簡稱雙抗。下列說法錯誤的是（）A．雙抗可同時與2種抗原結合B．利用雙抗可以將蛋白類藥物運送至靶細胞C．篩選雙抗時需使用制備單克隆抗體時所使用的2種抗原D．同時注射2種抗原可刺