單采、混采、單檢、混檢究竟該如何選

2/2單采、混采、單檢、混檢究竟該如何選擇？概念的區(qū)別一、單檢單檢即“單個檢測”，指樣本采集時是將1個人的拭子單獨放在1根病毒采集管中，這根采集管里通常含3mL病毒保存液（注：我們在實際工作中也會建議對疑似患者采樣時同時采口咽拭子和鼻咽拭子，共2根拭子一起放入1根采集管中，以提高檢出率）。每個采集管單獨作為一個獨立的樣本進行檢測，比如檢測試劑盒說明書中要求加原始樣本200μl，那么這份單檢樣本就按200μl加入進行核酸提取。單檢是疫情初期以及當前對重點人群檢測、隔離監(jiān)測以及新冠病毒感染者病程監(jiān)測的主要檢測方式。二、混檢混檢即“混合檢測”，樣本采集完全同單檢的方法，即1個人用1根病毒采集管（3mL病毒保存液），只是在核酸檢測時為了提高檢測效率和檢測通量，把幾個人的病毒采樣管里的液體都減少加樣量，幾個人受檢者占用1個檢測通量進行后續(xù)的核酸提取和擴增。比如，檢測試劑盒說明書要求加原始樣本200μl，采用5個人混檢方案的話，那就是每個人加入原始樣本量40μl（200μl/5人份=40μl/人份），其他檢測步驟不變。混檢主要是在2020年8月以前國家混采方案還未出臺、混采管也未生產(chǎn)出來時，且為了提高新冠核酸篩查效率，用于人群大批量篩查時所使用的一個退而求其次的方案。在有混采的方案后，現(xiàn)在基本不用混檢。三、單采單采即“采集單個樣本”，這個名稱強調(diào)的是采集過程，是在混采方案推行后用于區(qū)別于混采的一種名稱，其實質(zhì)就是和單檢是一樣的，1個人占用1根采集管，核酸檢測時也通常會單檢，應(yīng)用范圍自然與單檢的一樣。四、混采混采即“采集混合樣本”，采集多個人的樣本放在一起，以提高效率?；觳捎址譃?合1混采、10合1混采以及20合1混采。2020年8月17日，國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組（簡稱救治組）發(fā)布《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知》；2022年1月15日救治組發(fā)布《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸20合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知》。這兩份通知里都詳細介紹了對病毒采集管和采樣拭子的要求，對于10合1的采集管，要求內(nèi)含6ml胍鹽或其他有效病毒滅活劑的保存液；對于20合1的采集管，要求內(nèi)含11-12ml胍鹽或其他有效病毒滅活劑的保存液。10合1是指將采集自10人的10支拭子集合于1個采集管中進行核酸檢測的方法，20合1是指將采集自20人的20支拭子集合于1個采集管中進行核酸檢測的方法?；觳蛇m用于全員或區(qū)域大規(guī)模新冠篩查，可明顯提高檢測效率、加快檢測速度。以上介紹了“單檢”、“混檢”、“單采”和“混采”這些概念的區(qū)別，下面針對“單檢”、“混檢”、“單采”和“混采”對核酸檢測結(jié)果的影響逐一進行解析。對檢測結(jié)果的影響因新冠核酸篩查所用的技術(shù)主要就是熒光PCR技術(shù)，所以今天只討論不同的采集方案對熒光PCR檢測結(jié)果的影響。敏感性和特異性任何一個診斷指標都有兩個最基本的特征，即敏感性和特異性。用熒光PCR技術(shù)檢測新冠核酸時，通俗的理解，其敏感性就是在真正的新冠感染者中，該方法能做出陽性結(jié)果的能力或百分率，敏感性越高，其不漏診的機會就越大；所謂特異性，就是在沒有感染新冠的人群中，該方法能做出是陰性結(jié)果的能力或百分率，特異性越高，其不誤診的機會就越大。對于單獨一個指標，如果提高其診斷的敏感性，必然降低其診斷的特異性，換句話說，減少漏診必然增加誤診，反之亦然，即提高其特異性，會降低敏感性。對于目前傳播力（R0為9.5）如此強大的奧密克戎變異株，更需提高其敏感性，自然也就會犧牲其部分特異性。那怎樣在盡可能不降低特異性的基礎(chǔ)上又能提高其敏感性呢？當然是多次篩查！請先看下面分析：2020年在對廣州市20348例密切接觸者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，第1、2、3和第7輪核酸檢測的敏感性與特異性分別為69.14%與99.99%、89.84%與99.99%、97.27%與99.99%、100%與99.98%。有相當一部分的感染者要經(jīng)過多次篩查才能做出陽性，是PCR這個檢測技術(shù)不好嗎？我們來分析一下。敏感性達不到最理想狀態(tài)的100%，原因有很多，比如病程早期病毒載量低、樣本收集的過早或過晚、未取到有效部位、沒有正確的保存、運輸和處理樣本導致病毒RNA降解、口咽部食物或藥物等含有PCR抑制物、病毒基因變異以及檢測試劑盒靈敏度不高等因素。在這兒先解釋一下“靈敏度”這個術(shù)語，它和敏感性看上去很相似但實際上是完全不同的兩個概念。靈敏度是指檢測試劑或檢測體系的最低分析濃度或最低檢出限，比如甲公司生產(chǎn)的核酸檢測試劑能檢測到的最低病毒原始濃度是500拷貝數(shù)/mL，乙公司生產(chǎn)的試劑能檢測到的最低病毒原始濃度是100拷貝數(shù)/mL，那么對于200拷貝數(shù)/mL這樣一個病毒含量很低的樣本，甲公司試劑做出來的結(jié)果是陰性（靈敏度不夠，低濃度未能檢出），乙公司試劑做出來則是陽性，因此試劑盒檢測靈敏度是影響這個方法敏感度的重要因素。除了試劑本身靈敏度對敏感性的影響以外，其他因素如取樣不到位、病程早期病毒含量低、標本運輸和保存不當，以及口咽部取材時含有未知的PCR抑制物等這些分析前因素也是影響整體敏感性下降的重要原因。就拿PCR抑制物來說，咽拭子這類標本由于受口/鼻咽部分泌物以及進食、飲酒、吸煙等因素影響，會使樣本的成分變得復雜。目前已證實乙醇（飲酒）、血紅素（出血）、肝素（肝素抗凝管）、植物多糖（糞便或植物）、蛋白酶（牛奶）、膽酸鹽（糞便）、鈣離子（帶有滑石粉的手套）等等成分可以抑制PCR擴增，還有很多未知的可以抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，這些抑制物需要盡可能在取樣時避免或者在提取核酸的過程中將其去除，否則會引起核酸擴增抑制，導致假陰性結(jié)果。通過以上分析可知，要想提高新冠核酸檢測的敏感性，不僅需要靈敏度高的檢測試劑，還需要控制檢驗前的各種影響因素。在此基礎(chǔ)上，通過多次篩查可明顯提高監(jiān)測敏感性。對敏感性的影響那接下來要說的就是單檢、混檢、單采、混采對敏感性的影響，其實就是這些不同的樣本采集方式是否會對上述所提到的因素有影響。相對于單采、單檢樣本來講，混檢由于在加樣時減少了單個樣本的加樣量，會使得樣本的病毒檢出率降低，但降低多少呢？現(xiàn)在以10混檢為例，假如10份樣本中有1份是陽性樣本，其余9份都是陰性樣本，按照試劑盒說明書提取核酸時單檢加樣200μl，那么10混檢的話，這份陽性樣本在核酸提取時只加進去20μl，相當于病毒含量被稀釋了10倍，這樣出來的病毒擴增曲線會向右平移，平移多少個循環(huán)數(shù)呢？這里要做一個理想型的數(shù)學模式來推算。理論上，一系列稀釋的樣品擴增曲線之間有均勻的間距。那么:

5倍稀釋的DNA樣品，2n=5，n=Log2

(5)=2.3210倍稀釋的DNA樣品，2n=10，n=Log2

(10)=3.3220倍稀釋的DNA樣品，2n=20，n=Log2(20)=4.32n為倍比稀釋后的兩條相鄰曲線之間的Ct值差距。Ct值Ct值全稱Cyclethreshold，即循環(huán)閾值，其含義是指擴增到一定的循環(huán)數(shù)時，其擴增產(chǎn)物所攜帶的熒光值可以達到能被檢測到的臨界值水平，這時候所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)就是其Ct值。所以稀釋后的標本與原始標本相比，需要比原先更多的擴增循環(huán)數(shù)才能達到檢測臨界值，其Ct值是增加的，曲線會右移。由此可見，以10混檢、擴增程序設(shè)置總循環(huán)數(shù)是40為例，如果其中一個樣本的病毒在單檢時其Ct值大于36.68，那么在混檢時其擴增曲線就會向右平移3.32個循環(huán)，也就是說混檢后就檢測不出來了，結(jié)果就是陰性。那該如何避免混檢所帶來的弱陽性樣本漏檢的風險呢？筆者建議可以通過加大擴增循環(huán)數(shù)，比如要做10混檢的話，就在原先40個擴增的程序上再增加3-5個循環(huán)，這樣就可避免Ct值為36左右的弱陽性樣本漏檢。當然對于Ct值大于36.68的樣本，這是屬于非常弱的樣本，但其對應(yīng)的病毒載量究竟是多少？單純這個定性實驗無法得知，必須有新冠病毒核酸標準品制作標準曲線才能準確計算出來。

在這里需要指出的是：不僅是咽拭子，還有宮頸脫落細胞、潰瘍面分泌物等這類標本，由于受取樣時拭子擦拭力度和擦拭次數(shù)的影響，取樣的初始量不容易標準化，不能像檢測血液中乙肝病毒、丙肝病毒那樣可以精準控制血清加樣量，因此在進行分泌物標本的核酸檢測項目時通常是做的定性試驗，而不是絕對定量試驗。定性實驗就不能過分依賴單次的分泌物樣本的Ct值結(jié)果，需要第二次甚至更多次取樣復核，兩次取樣的Ct值相差較大也是可能的。此外，混檢帶來的另一個隱患是其中的一個或幾個樣本即使因采樣不到位，因其內(nèi)參基因會被其他樣本的內(nèi)參基因掩蓋，而失去了內(nèi)參基因監(jiān)測樣本取樣是否合格的內(nèi)質(zhì)控作用。因此，對于疑似患者、發(fā)熱門診就診患者、新冠患者的病程觀察、密接者的篩查時，不建議用混檢的方法。接下來要說一下混采對結(jié)果的影響了。以10合1混采為例，前面已介紹過，10合1混采是10個人的拭子放在1個管子里，管子里的液體是6mL，相對于單采管的3mL來說，混采里某個樣本的病毒濃度是被稀釋了1倍。我們?nèi)砸?0個樣本中有1個為陽性，其余9個樣本都為陰性的例子來看，提取核酸時加的總液體量仍然是200μl，由于這個陽性患者的病毒濃度被稀釋了1倍，因此最終的Ct值會延后1【計算公式n=Log2

(2)=1】。那假如這10個混采的人里面有2個人是陽性，那就和單采是一樣的了，敏感性不會減弱；那如果大于2個人陽性，那就比單采的敏感性還高。不管是5混采，10混采，還是20混采，都可以按以上這個理論推算出來。但要注意的是以上計算都是理論上和理想條件（核酸提取效率為100%，核酸擴增效率也是100%）下的計算方法，而實際工作中核酸提取效率和擴增效率不一定100%，所以按以上公式計算出來的Ct值差距和真實的是有出入的。同樣，混采帶來的另一個隱患是其中的一個或幾個樣本即使因采樣不到位，也不會被監(jiān)測出來，道理同上面介紹的混檢。不管是混采還是混檢