牛錐蟲病補體結合試驗方法

本標準規(guī)定了牛錐蟲病補體結合試驗方法。本標準適用于牛錐蟲病的抗體檢測。96孔“U”型微量板、10pL～100pl.可調移液器、培養(yǎng)箱、水浴鍋、15ml.尖底離心管、離心機、12mm×75mm試管。2.2.1溶血素：從生物制藥廠購買，效價不低于1!1500。2.2.2補體：選擇成年雄性豚鼠3只～4只，絕食6h~8h后，從心臟采血，分離新鮮血清保存于普通冰箱中備用。也可以購買凍干補體。2.2.3錐蟲病抗原、陽性血清和陰性血清；從生物制品廠購買。2.2.4綿羊紅細胞懸液的制備；見第A.1章。2.2.5巴比妥緩沖液(簡稱VBS);見第A,2章。2.2.6溶血標準比色孔的制備；見第A.3章。2.3血清的處理被檢血清、標準陽性血清和標準陰性血清，使用前均需56℃滅活30min。3預備試驗3.1溶血素效價的測定3.1.1配制1;20的補體。3.1.2溶血素稀釋；將溶血素用VBS做11500,111000,111500,112000,112500,113000,1:3500,114000,1+4500,1+5000稀釋。3.1.3溶血素效價測定：取96孔“U”型微量版，按表1中各成分的量加人各孔中。23456789 0 表2補體效價測定表(結果舉例)2346789陽性直清的性直潛3.3.8混勻，37℃保溫30min,以500g離心5min,參服標準比色孔(見第A,3章)判定結果。表3抗原，陽性血清測定結果舉例 3.3.9抗原效價的判定：能與最高稀釋度的陽性血清呈完全抑制反應的最高抗原稀釋度，即為抗原效價。如表3抗原效價為1:140。4.1血清的稀釋：試驗用血清全部做145稀釋。4.2正式試驗：按表4進行。每次試驗均設陽性血清、陰性血清、補體、溶血素、抗原對照。 震蕩據勻封板后，于37℃保溫30min,以500g離心5min,參照標準比色孔(見附錄A)觀察細果，4.3結果判定：將平板置于鏡面上方進行觀察。所有對照成立時，待檢血清孔溶血量小于等于50%,判為陽性；溶血量大于50%,小于90%,判為可疑；溶血量大于90%為陰性。被判為可疑的樣品重新檢測一次，仍為可疑的，則判為陽性。4.4終點滴定：所有5倍稀釋為陽性的血清，須進行連續(xù)2倍數稀釋，按以上步驟測定終點滴度。將10mL網氏液保存的綿羊血通過紗布過濾倒人40mL心，如此離心洗滌三次。吸棄上清液。每管約加10mLVBS,混勻。將懸液倒入15mL容量的刻度離心管中，離心10min(800g)。儲存于4℃~8℃冰箱中備用。紅細胞可保存5d~6d。選擇一管洗過的紅細胞。如果紅細胞與液面間出現溶血應再離心洗滌，直至清亮。若稀釋紅細胞，使成為3%的紅細胞懸液。巴比要鈉[(C?H?)?CCONHCO6水氯化鎂(MgCl?·6H?O)待全部溶解后，繼續(xù)加水至2000mL,0.8MPA滅菌20min,作為母液，冷藏保存。使用前，用含明膠的燕餾水作1:5稀釋。A.3標準溶血比色孔的制備A.3.1溶血液的配制：吸取60μL經洗滌的綿羊紅細胞加入7,0ml.蒸餾水中，據動試管直至紅細胞完全溶解，加蒸餾水到8.0mL,再加入2.0ml.VBS母液(5倍濃端液，見第A.2章)充分混勻。A.3.20.6%紅細胞懸液的配制；取2.0mL3%的紅細胞懸液加8.0mLVBS混勻。1234567890005A.3.4標準溶血比色孔的制備：將標準比色管分別加入96孔“U”型微量板的一排，每孔0.125mL。封板后以50