甜菜胞囊線蟲檢疫鑒定方法

4.9乳酚油(苯酚20mL、乳酸20mL、甘油40mL和蒸餾水20mL混合而成)。5現(xiàn)場檢疫5.1.1抽樣方法棋盤式、五點式或隨機抽樣。5.1.2抽樣數(shù)量按總件數(shù)的5%～20%抽樣，最低抽檢數(shù)量不少于10件或500株。取樣的數(shù)量為：50株以下取五株；51株～200株取10株；201株～1000株取15株；1001株～5000株取20株；5001株以上，每增加5000株增取五株，不足5000株的余量計取五株樣品。5.2外觀癥狀檢查對植物，尤其是甜菜、黎科、十字花科及其他植物繁殖材料的帶根和土的情況進行檢查，注意檢查側根較多，整個根系呈簇須狀，植株出現(xiàn)萎蔫狀的材料，收集上述材料和所扦取的樣品及運輸工具上可能攜帶的土壤，一并帶回實驗室檢驗。6實驗室檢驗6.1土壤的收集用毛刷將收集的材料和所扦取的樣品的根或其他組織表面附著的土刷下，收集到塑料袋中，作為檢驗的土樣。6.2線蟲分離6.2.1改進的浮力離心法本法可以分離到土壤中的胞囊和幼蟲一般用于檢驗100g以下的土壤。具體分離步驟如6.2.1.1搓碎土樣，充分混勻。6.2.1.2100mL離心管加水70ml,再加土樣，攪拌成懸浮狀。6.2.1.33000r/min離心5min,去上清液。6.2.1.4加入80%蔗糖液60mL,攪拌成懸浮狀。6.2.1.52000r/min離心2min。6.2.1.6上清液倒入套篩中(20目+100目+500目),用清水盡快沖洗。6.2.1.7去除20日篩中的雜質；從100日篩中可以收集到胞囊(陰門錐制作方法見附錄B);將500目篩中剩余物全部洗入培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下觀察，用挑針挑取二齡幼蟲制備臨時玻片(線蟲玻片制作見附錄C)鏡檢。本法可同時分離土壤中的胞囊和二齡幼蟲，一般用于檢驗100g以下的土壤。具體方法如6.2.2.1選用20目、60目、100目、300目、500目篩子各一個，從上到下依次放置在特制的架子6.2.2.2采回的土樣放于燒杯中，加水充分攪拌成懸浮狀；6.2.2.3將土壤懸浮液緩慢倒入套篩中，并用清水沖洗；6.2.2.4從60目和100目篩中收集胞囊，從300目和500目篩中收集二齡幼蟲，制片鏡檢。6.2.3Fenwick胞囊漂浮器分離法(見圖D.1)僅用于分離土樣中的胞囊，一般用于檢驗100g以上的土壤。具體方法如下：6.2.3.1將收集到的附著土壤鋪于干凈的淺瓷盤內，將土樣在室內風干，去除土壤中的植物組織和粗砂等雜物，稱100g土樣備用。6.2.3.2先將漂浮器加滿清水，再取100g的風干土樣放入漂浮器的上篩中，加水沖洗，使土樣全部被淋洗至漂浮筒內。6.2.3.3再由上篩加水至漂浮簡內，用100目篩子(底篩)接收從漂浮器中漂浮出來的胞囊和雜6.2.3.4將100目篩子上的含胞囊的殘留物沖洗到濾紙上，在體視顯微鏡下用毛刷挑取胞囊制片鏡檢。7形態(tài)鑒定特征7.1異皮線蟲屬形態(tài)鑒定特征雌蟲：有胞囊期：蟲體球形或檸檬形，有短頸和末端錐；角質層厚，表面有網(wǎng)狀花紋，D層不明顯：陰門位于末端，陰門層不突出，陰門區(qū)有雙半膜孔或雙膜孔，無肛區(qū)膜孔，一般有下橋，泡囊有或無(胞囊線蟲雌蟲陰門錐見圖E.1)。卵存留在體內，有時也產生卵塊，卵表面光雄蟲：蟲體蠕蟲形、彎曲，側線四條(偶爾三條);交合刺長于30μm,遠末端尖或呈叉狀，泄殖腔層不形成泄殖腔管；尾圓、非常短。二齡幼蟲：口針短于30μm,側線四條(偶爾三條),食道腺充滿體腔；尾圓錐形、端尖，尾的透明后部長度有變化，一般為尾長的二分之一；側尾腺口呈刻點狀。7.2甜菜胞囊線蟲形態(tài)鑒定特征7.2.1測計值(據(jù)Raski,1950)m口針長/μma紋m361~1.4~=體長÷最大體寬。胞囊：陰門窗長=38.7μm,陰門窗寬略小，陰門與肛7.2.2形態(tài)鑒定特征(見圖1)原1甜意購療峰由瓶態(tài)(信Kranklino篇)胞囊：含有卵和幼蟲的胞囊從植物根上脫落，留在土壤中。胞囊褐色，表皮為鞣革質，具有兩側，此區(qū)域在較老的胞囊中只剩下兩個孔或者被陰門橋分成兩個半膜孔。在陰門錐內，陰道連蟲體膨大而成近球形，至陰門錐處變小：肛門位于近尾端的背部，無明顯的尾：頭骨架弱，口針細、有小的基部球，中食道球明顯、呈球形，食道腺覆蓋腸的腹側面：雙生殖腺、長、盤卷。少部分卵產在膠質團內，大部分卵存留在體內。表皮基本上分三層，外層覆蓋著脊狀網(wǎng)形結構。道球紡錘形，食道腺覆蓋腸的側腹面，背食道腺開口于口針基部球后2μm處。排泄孔在中食道球后二倍至三倍體寬處，半月體在排泄孔前六個至十個體環(huán)處。交合刺腹面彎，基部略膨大，頂端凹陷：引帶結構簡單。尾部短于體寬的二分之一，尾端鈍圓，側尾腺口位于肛門附近。二齡幼蟲：頭部半球形、縊縮，頭環(huán)四個，頭骨架粗壯，對稱；體環(huán)較寬，口針處體環(huán)寬1.4μm,體中部體環(huán)寬為1.7μm,側線四條：口針中度硬化、有小的基部球，基部球前端向前凸：中食道球比雄蟲發(fā)達，背食道腺開口在基部球后3μm~4μm處；肛門不清楚，距尾端約四倍體寬處：尾部急劇變細呈圓錐形、末端圓，尾后部透明區(qū)明顯，長度是口針長的1.25倍。8結果判定符合第7章的形態(tài)鑒定特征可鑒定為甜菜胞囊線蟲。9樣品保存9.1對于分離獲得的剩余二齡幼蟲可以加熱殺死、固定制成永久玻片保存；也可固定后放人含TAF液的指形管中，在4℃冰箱內長期保存～并標明樣品登記號碼、制作日期和制作人等。9.2對于剩余的胞囊，可以放入含TAF液的指形管中，在4℃冰箱內長期保存，并標明樣品登記號碼、制作日期和制作人等。9.3對于檢出甜菜胞囊線蟲的剩余樣品，土樣可風干，保存在低溫干燥、防蟲防鼠處；并標明基本情況，如樣品登記號碼、截獲日期、截獲人、寄主名稱、運輸工具名稱和輸出國名等。9.4所有保存樣品，至少需保存六個月，以備復驗、談判和仲裁。(資料性附錄)甜菜胞囊線蟲的寄主與分布A.1甜菜胞囊線蟲的寄王甜菜胞囊線蟲的寄主范圍極廣，主要發(fā)生在十字花科、藜科植物上，還可侵染蓼科、石竹科、莧科、豆科、茄科等多種植物和雜草，包括：甜菜、菠菜、莖椰菜、抱子甘藍、結球甘藍、球莖甘藍、羽衣甘藍、大白菜、蕓苔、蕪青甘藍、蘿卜、南芥、白芥、食用大黃、香石竹、番茄、大豆、鷹嘴豆、羽扇豆、黃莢種菜豆等植物，及芥菜類、藜、龍葵、濱藜、扁蓄、莧、馬齒莧、薺菜、香杏、繁縷、野蘿卜、反枝莧等多種雜草。A.2甜菜胞囊線蟲的分布亞洲：伊朗、伊拉克、約旦、韓國、巴基斯坦、阿塞拜疆、哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦、吉爾吉斯斯坦、土耳其、以色列。歐洲：奧地利、比利時、法國、捷克、斯洛伐克、丹麥、意大利、德國、芬蘭、愛沙尼亞、英國、荷蘭、盧森堡、葡萄牙、西班牙、愛爾蘭、希臘、波蘭、羅馬尼亞、拉脫維亞、摩爾達維亞、烏克蘭、俄羅斯、前南斯拉夫、保加利亞、瑞典、瑞士。非洲：贊比亞、塞內加爾、南非、加那利群島、佛得角共和國。北美洲：加拿大、美國、墨西哥。大洋洲：澳大利亞、新西蘭。南美洲：智利、烏拉圭。胞囊線蟲雌蟲陰門錐的制作方法B.1將用水浸泡24h的胞囊移至有水滴的載玻片上，在體視顯微鏡下用解剖刀切下胞囊后部的陰門錐部分。B.2用竹針仔細清除陰門錐內的附著物。B.3用解剖刀適當修整陰門錐邊緣，最好使陰門錐的高度不超過陰門窗區(qū)域寬度的10倍～15倍。B.4將切下的陰門錐用40%雙氧水處理數(shù)分鐘，再依次移至玻片另一側的70%、95%、100%灑精液滴中脫水，再移至凹玻片的凹穴中的丁香油內透明。B.5在凹玻片的凹穴內加一小滴中性樹膠，稍涂平，將處理好的陰門錐埋于中性樹膠內，陰門錐頂端向上。B.6待中性樹膠凝固后，再在陰門錐附近加入適量的中性樹膠，并加蓋玻片，貼好標簽。甜菜胞囊線蟲二齡幼蟲的玻片標本制作方法C.1線蟲的殺死：在體視顯微鏡下用線蟲挑針挑取少量線蟲放至凹玻片上的水滴中，使線蟲位于水滴中央，手持凹玻片在酒精燈火焰上來回5s～6s,使線蟲恰好被殺死為止；殺死大量的線蟲，可將線蟲懸浮液放在試管中加等量的沸水殺死線蟲。C.2線蟲的固定：少量線蟲被殺死后，可用線蟲挑針將線蟲移至TAF固定液中固定。大量的線蟲被殺死后，在線蟲懸浮液中加等量濃度雙倍的固定液即可。C.3臨時玻片標本的制作：以TAF作為浮載劑，滴適量于載玻片上，用挑針將固定好的線蟲移數(shù)條于浮載劑中，并使其完全沉下，浮載劑邊緣均勻放置3mm~5mm長、直徑與線蟲體寬相近的玻璃纖維絲三根，加蓋玻片，用濾紙吸去溢出的浮載劑，用指甲油封片，待指甲油干后再加封一次，可保存幾天至數(shù)周。C.4永久玻片標本的制作C.4.1脫水：采用乳酚油快速脫水法(Franklin&Goodey,1949),把滴有乳酚油的凹玻片放在加熱板上，加熱至65℃~70℃,將已固定一天以上的線蟲挑人熱的乳酚油中，繼續(xù)加熱2min~3min后，在解剖鏡下觀察標本是否清晰，若不夠清晰，繼續(xù)在65℃~70℃的加熱板上加熱片刻至清晰(注意避免加熱過度而損壞標本),然后放在干燥器中12h～24h,進一步去除水分后即可制C.4.2制片：將直徑1.5cm的打孔器在酒精燈火焰上加熱后，插到蠟盤中蘸取少