【卡培立肽合成探究6500字（論文）】

前言卡培立肽合成研究【摘要】本實(shí)驗(yàn)是探討固相化學(xué)合成卡培立肽中HOBT、OXYMA這2種偶聯(lián)添加劑，誰的效果更好，可以合成純度更高的卡培立肽。用固相合成的方法，采用Fmoc氨基酸為原料，以氯樹脂為載體，用DIC/HOBT與DIC/OXYMA兩種縮合體系，分別合成卡培立肽。用A/Tis/碘化銨在不加熱的條件下進(jìn)行裂解，得到卡培立肽粗品。并用反相高效液相色譜對(duì)它進(jìn)行純化，其中HOBT體系得到收率為16.90%、純度83.40%的卡培立肽，OXYMA體系得到收率25.36%、純度為93.58%的卡培立肽。用DIC/OXYMA體系合成的卡培立肽收率25.36%、純度為93.58%均高于大于DIC/HOBT體系合成的卡培立肽。得到的結(jié)論是OXYMA價(jià)格低廉，且所得成品純度高，比HOBT更適合多肽的合成。【關(guān)鍵詞】卡培立肽，DIC，HOBT，OXYMA，心力衰竭目錄TOC\o"1-3"\h\u301341前言 163871.1本論文選題意義 130511.2多肽的研究現(xiàn)狀 1284551.3多肽合成 1231621.2.1多肽合成添加劑 3156481.2.2難以縮合的多肽 4154201.4多肽的應(yīng)用 4191831.3.1藥品 4141361.3.2化妝品 4132821.3.3食品 564641.5心力衰竭治療藥物的研究現(xiàn)狀 5141521.6卡培立肽的研究現(xiàn)狀 546672材料與方法 7173892.1實(shí)驗(yàn)試劑 75542.2配制溶液 7155333結(jié)果與分析 1081663.1使用HOBT合成的卡培立肽 1098913.2使用Oxyma合成的卡培立肽 1118253.3結(jié)果 1213749參考文獻(xiàn) 141前言1.1本論文選題意義21世紀(jì)是生物的世紀(jì)，在這個(gè)時(shí)代，生物行業(yè)飛速發(fā)展，出現(xiàn)了許多新藥物，尤其是在難以治愈的疾病方面，比如治療艾滋病的藥物恩夫韋肽，用于治療糖尿病的利拉魯肽等等?？ㄅ嗔㈦淖鳛橐环N治療心力衰竭的藥物，它的安全性高，療效顯著，在提高心輸出量、降低肺毛細(xì)血管楔壓(PCWP)方面，均高于尼可地爾，所以卡培立肽值得探索，說不定可以成為利拉魯肽這樣的重量級(jí)藥物。歷史以來，人們?cè)卺t(yī)藥行業(yè)不停的研究和探索，其目的能夠研制出高質(zhì)量、有效、穩(wěn)定而又低成本的良藥，可以讓世界上的每一位消費(fèi)者都能用的起、買得起高質(zhì)量的藥物，讓每一個(gè)人都能夠看的起病。本文使用Fmoc固相合成法來合成卡培立肽，來探究DIC/HOBT、DIC/Oxyma誰更適合多肽的合成，從而實(shí)現(xiàn)合成工藝的優(yōu)化。1.2多肽的研究現(xiàn)狀多肽是有氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接而成的，它介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間，10個(gè)以下又叫寡肽，多肽雖然只是蛋白質(zhì)的一部分，但是具有它的功能基團(tuán)。二者之間的差別在于空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度不同，蛋白質(zhì)具有一到四級(jí)的結(jié)構(gòu)，而多肽只有一二級(jí)，由于只是它的一部分，所以分子量也要小很多。因此多肽做藥物的優(yōu)點(diǎn)有：容易代謝，不易中毒，因?yàn)樵隗w內(nèi)停留的時(shí)間不長，多肽類藥物的免疫原性要小于蛋白質(zhì)類藥物，更加穩(wěn)定，且比蛋白質(zhì)容易合成、改造，價(jià)格也更能讓人接受。缺點(diǎn)就是容易被降解吸收，不能口服，給藥形式比較麻煩，比如皮下注射等。雖然多肽目前占領(lǐng)藥物市場(chǎng)的份額并不大，但是多肽藥物是一個(gè)熱點(diǎn)，它的市場(chǎng)正在迅速膨脹。在全球總共有76個(gè)多肽藥物獲批上市，而中國批準(zhǔn)的有26個(gè)，但我們可以自主生產(chǎn)的，只有17個(gè)。而且這其中大部分都是仿制藥，核心技術(shù)依然被國外把持，所以我們需要?jiǎng)?chuàng)新。1.3多肽合成多肽合成分為化學(xué)合成與生物合成，本文的實(shí)驗(yàn)用的是固相化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成多肽時(shí)，需要把不參與反應(yīng)的氨基酸的氨基保護(hù)起來，這樣可以保證反應(yīng)按照預(yù)設(shè)的方向進(jìn)行，而化學(xué)合成按照是否有固定載體可以分為液相合成與固相合成。液相合成EmilFischer創(chuàng)立，一般分為逐步合成與片段合成，當(dāng)合成的序列比較短時(shí)，采用逐步合成，反之，多肽比較長或者縮合困難就采用片段合成。液相合成的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)濃度比較高，在每一步合成結(jié)束時(shí)，會(huì)有結(jié)晶的操作，所以雜質(zhì)會(huì)比較少，得到的粗品純度會(huì)較高，生產(chǎn)的成本也比較低，因此大部分能夠規(guī)模化生產(chǎn)的多肽都是采用液相合成。但是隨著肽鏈的增長，它的溶解度會(huì)越來越低，所以對(duì)反應(yīng)溶劑的要求也會(huì)改變，且操作麻煩，需要轉(zhuǎn)移，所以會(huì)有一部分的損失，不如由Merrifield提出的固相合成。合成始終在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，不需要轉(zhuǎn)移，減少了多肽合成中的損失，固相合成的原理是選擇合適的樹脂，將氨基酸的羧基端與樹脂的Linker鍵連接，再按照順序添加氨基酸，進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)過程中，需要把不參加反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈上的活性基團(tuán)用保護(hù)基保護(hù)起來，而氨基酸的保護(hù)基及捕獲劑如下圖所示：圖1氨基酸的保護(hù)基及捕獲劑圖固相合成的方法根據(jù)氨基的保護(hù)基類別主要有Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9一芴甲氧羰基)法，Boc(叔丁氧羰基)法的boc對(duì)酸敏感,對(duì)它進(jìn)行脫除時(shí)，是采用三氟乙酸(TFA)的，而它最后的裂解是用強(qiáng)酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMsA)來將多肽與樹脂分離，因?yàn)槭褂玫乃岣g性和毒性都很大，對(duì)操作人員來說太危險(xiǎn)，且多肽在PH較小的條件下，不能穩(wěn)定存在，易從樹脂上脫離。所以現(xiàn)在采用Fmoc(9一芴甲氧羰基)法，它脫除條件溫和，低濃度的堿即可脫除保護(hù)，且對(duì)酸不敏感，可以與Boc聯(lián)用，其中Fmoc保護(hù)α氨基，Boc保護(hù)側(cè)鏈上的氨基，形成正交保護(hù)，大大提高了合成效率。固相合成按照反應(yīng)方式可以有縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，最主要的有3種，分別是縮合劑法、原位法、對(duì)稱酸酐法，縮合試劑法是在加了dic之后，還添加了例如HOBT（1-羥基苯并三氮唑）的物質(zhì)，可以減少消旋和副反應(yīng)的發(fā)生，提高產(chǎn)率。原位法是直接加碳二亞胺類物質(zhì)和保護(hù)氨基酸在樹脂中進(jìn)行反應(yīng)，它反應(yīng)速度快，但是容易有副反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)稱酸酐法它反應(yīng)速度很快，操作也很簡單，適用于合成小分子肽，但是它耗費(fèi)氨基酸原料較多，且樹脂要一直保持良好的溶脹性，所以更多采用的是縮合劑法。1.2.1多肽合成添加劑HOBT與OXYMA都是多肽合成中的偶聯(lián)添加劑。HOBT是苯丙三唑類的衍生物，是最常使用的偶聯(lián)添加劑，可以降低手性分子的消旋，提高合成效率。但是HOBT容易發(fā)生爆炸，運(yùn)輸、儲(chǔ)存皆需要一定的條件，比如防爆，且對(duì)身體的呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)有危害性。OXYMA（2-肟氰乙酸乙酯）：它具有良好的溶解性，制作它的原材料容易獲取，價(jià)格低廉，是優(yōu)良的多肽合成偶聯(lián)添加劑。MasumiItoh發(fā)現(xiàn)OXYMA與碳二亞胺聯(lián)合使用時(shí)，可以顯著的抑制多肽消旋化，可使消旋化由35％下降到1．8％，它的作用原理是當(dāng)O一酰基異脲(0一acylisourea)中間體生成后，由于OXYMA具有強(qiáng)大的吸電子能力，讓?；c之結(jié)合，形成活性酯，再氨解，從而生成酰胺物質(zhì)，它減少了嗯唑酮與N-?；宓纳?，就很大程度上提高了產(chǎn)率。OXYMA的副產(chǎn)物也更容易處理，毒性更小。而且，OXYMA與醇形成的肟酯還可以收集用于酯的合成可以減少浪費(fèi)，對(duì)環(huán)境更為友好。Elfaham等報(bào)道在催化N一乙酰賴氨酸與4-氨基苯甲酸偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，當(dāng)使用DIC/HOBt體系時(shí)，產(chǎn)率是82％，核磁共振氫譜顯示有雜質(zhì)，當(dāng)使用DIC/OXYMA體系時(shí)，產(chǎn)率是88％，核磁共振氫譜顯示沒有雜質(zhì)。綜上所述，OXYMA的耦合效率要優(yōu)于HOBt，且Oxyma大大降低了爆炸風(fēng)險(xiǎn)，所以它未來會(huì)得到比HOBT具有更廣泛的應(yīng)用。1.2.2難以縮合的多肽當(dāng)多肽難以縮合的時(shí)候，我們可以用的辦法有1微波合成；微波的溫度很高，這可以促進(jìn)多肽的合成；2DCM/DMF混溶，溶脹樹脂，減少空間位阻；3DMSO/DMF與物質(zhì)混溶，增加該物質(zhì)的溶解度；4使用合適取代度的樹脂，盡可能減少樹脂的用量，確保洗滌、縮合效果；5使用高效縮合劑比如把HOBT換成HBTU、Oxyma等。1.4多肽的應(yīng)用1.3.1藥品抗菌肽不僅可以抑制細(xì)菌的生長，當(dāng)它量多時(shí)還可以殺死癌細(xì)胞，比如BCp12。多肽疫苗的優(yōu)點(diǎn)是它的特異性、安全性都比較高，相較其他疫苗，但免疫原性低，可以通過修飾來彌補(bǔ)，用于HPV、艾滋病、肝炎等傳染病的預(yù)防。與腫瘤基因靶點(diǎn)進(jìn)行特異性的結(jié)合可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，比如人顆粒蛋白A（HGRNA）。從肽庫內(nèi)還可以篩選細(xì)胞因子模擬肽，雖然結(jié)構(gòu)不同，但是具有相似的作用。從動(dòng)植物體內(nèi)分離的小分子多肽比如PCSK9單克隆抗體具有明顯防治心血管疾病的作用。還有用于診斷時(shí)，它主要對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度、特異性都很高，且容易制備，臨床上可以大量使用。1.3.2化妝品多肽由于是小分子物質(zhì)，比蛋白質(zhì)更容易被皮膚吸收，且它具有抗氧化、消炎、美白等作用，所以它被廣泛添加到化妝品中，在醫(yī)美市場(chǎng)很火爆。具體的例子比如可以促使皮膚愈合、防止疤痕組織增生的藍(lán)銅勝肽，清除人體自由基、防止過氧化物生成的谷胱甘肽，可以除皺的類肉毒桿菌素，還有水蛭素、棕櫚酰多肽等等。1.3.3食品在人體中，蛋白質(zhì)被吸收大部分時(shí)候是以多肽的形式，而不是氨基酸，且吸收多肽的速度比氨基酸快，當(dāng)多肽添加在食品中，可以讓它具有保健作用，比如把玉米多肽添加在酒中，可以保護(hù)肝細(xì)胞不受損傷。還有將花生多肽添加到需長期保存的食品中，例如月餅，可以保證它的水分不流失，表皮不被氧化，保持了它的外觀、口感，還延長了它的保質(zhì)期。1.5心力衰竭治療藥物的研究現(xiàn)狀心力衰竭是指任何原因引起心肌損傷使心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致心室泵血功能降低，不能滿足機(jī)體需要的臨床綜合征，是各種心臟病的終末階段。治療心力衰竭的藥物根據(jù)機(jī)制不同可以分為：1腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)抑制藥：ACEI不僅能緩解心衰的癥狀，還可以防止心室重構(gòu)，降低心衰病死率，代表藥物為卡托普利，用于治療心功能不全；血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑：阻斷AngII與其受體的結(jié)合，抑制AngII的促生長作用，還可以預(yù)防、逆轉(zhuǎn)心血管的重構(gòu)，代表藥物為氯沙坦；抗醛固酮藥：與ACE抑制藥合用降低AngII及醛固酮水平，代表藥物為螺內(nèi)酯。2利尿藥：如氫氯噻嗪，可以減輕疼痛，改善體液潴留，是長久用藥。3β受體阻斷藥：改善CHF的癥狀，長久用藥，可能會(huì)抑制心肌收縮力，加重心功能障礙。4血管擴(kuò)張劑：包括硝酸酯類和鈣離子拮抗劑，前者比如硝酸甘油，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加心肌供氧量，后者硝苯地平，可以控制心室重塑現(xiàn)象，改善心肌的舒張功能，但是長久用藥，會(huì)增加風(fēng)險(xiǎn)。3正性肌力藥：如左西孟旦，加強(qiáng)心肌收縮性，提高心輸出量。4抗血小板類藥物：減輕血液的黏稠程度，防止血管堵塞。5人心房鈉尿肽等新藥：卡培立肽，可以擴(kuò)張血管，利尿，對(duì)器官起保護(hù)作用。1.6卡培立肽的研究現(xiàn)狀卡培立肽是由絲氨酸（Ser）、亮氨酸（Leu）、精氨酸（Arg）、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、甲硫氨酸（Met）、天冬氨酸（Asp）、異亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asn)、酪氨酸（Tyr）這幾種氨基酸構(gòu)成的，總共28個(gè)氨基酸，它是α型心房鈉尿肽,分子式為C127H203N45O39S3分子量：3080.44。結(jié)構(gòu)式如下：圖2卡培立肽結(jié)構(gòu)圖它與血管平滑肌的ANP（心房利鈉多肽）受體結(jié)合，使鳥苷酸環(huán)化酶的活性上升，從而舒張血管。用于治療急性心功能衰竭（acuteheartfailure，AHF）和慢性心功能衰竭（chronicheartfailure,CHF）加重，它的不良反應(yīng)主要是低血壓，所以使用卡培立肽時(shí)，患者不能有低血壓，此外，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明卡培立肽可以預(yù)防心室重構(gòu)，并保護(hù)器官?？ㄅ嗔㈦哪壳暗氖褂梅绞绞庆o脈滴注。它目前的生產(chǎn)方式有基因重組技術(shù)、Boc路線液相/固相合成法、Fmoc路線液相/固相合成法、Fmoc路線固液結(jié)合片段法四種方法，其中基因重組技術(shù)的成本高昂，操作麻煩，所得成品雜質(zhì)較多，純度不高。Boc路線液相/固相合成法在生產(chǎn)過程中會(huì)使用大量的HF、TFA，對(duì)操作人員和環(huán)境都具有較大的危害。Fmoc路線液相/固相合成法生產(chǎn)周期較長。而Fmoc路線固液結(jié)合片段法，可以同時(shí)合成多個(gè)片段，將時(shí)間縮短至原來的1/3,且成本低廉，雜質(zhì)少，所得粗品的純度大于75%，最后的收率大于25%，且使用的試劑相對(duì)來說，對(duì)人和環(huán)境來說更為友好，所以Fmoc路線固液結(jié)合片段法最適合卡培立肽的商業(yè)化生產(chǎn)。致謝2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)試劑AR二氯甲烷(DCM)，純DIC，20%Pip（哌啶），ARDMF(N,N-二甲基甲酰胺)，AR甲醇，工業(yè)DMF，HOBT（1-羥基苯并三氮唑），OXYMA（2-肟氰乙酸乙酯），檢A（5%茚三酮無水乙醇溶液），檢B（80%苯酚無水乙醇溶液），三氟乙酸(TEA)，茴香硫醚，苯酚，Tis（三異丙基硅烷），EDT(1，2-乙二硫醇)，碘化銨，純水，冰乙醚，乙腈；Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。2.2配制溶液按照AA/dic/oxyma=1:0.95:1的比例來算，氨基酸的濃度要求為0.2mmol/ml,使用的是50ml的氨基酸溶液。OXYMA溶液配制：稱取21.3gOXYMA溶45mlDMF中，HOBT稱20.3g溶到45mlDMF中。表1氨基酸用量氨基酸分子量質(zhì)量氨基酸溶液體積（V）Fmoc-Ser(tBu)-OH383.43.8350mlFmoc-Leu-OH353.43.5350mlFmoc-Arg(pbf)-OH648.76.4950mlFmoc-Cys(Trt)-OH585.75.8650mlFmoc-Phe-OH3873.8750mlFmoc-Gly-OH297.32.9750mlFmoc-Met-OH371.53.7250mlFmoc-Asp(otBu)-OH411.54.1250mlFmoc-Ile-OH353.43.5350mlFmoc-Ala-OH311.33.1150mlFmoc-Gln(Trt)-OH6106.1050mlFmoc-Asn(Trt)-OH596.75.9750mlFmoc-Tyr(tBu)-OH4664.6650ml2.2儀器與設(shè)備萬分之一電子天平；柱狀反應(yīng)器；恒溫水浴鍋；循環(huán)水式真空泵；冰箱；日本島津LC-20分析型液相色譜儀；日本島津LC-8制備型液相色譜儀；HPLC質(zhì)譜儀。2.3方法（1）改造樹脂：在電子天平上稱取3g氯樹脂，1mmol絲氨酸，先倒氯樹脂，再加入DCM（二氯甲烷）至樹脂剛好鼓動(dòng)，再加入稱好的絲氨酸，加1mlDIEA反應(yīng)70分鐘，再加1mlDIEA和1ml甲醇封頭25分鐘。（2）洗滌：用工業(yè)DMF洗4次（3）脫保護(hù)：用20%Pip脫保護(hù)，并對(duì)樹脂進(jìn)行抽檢，檢查Fmoc是否脫除，在試管中分別加入1ml檢A、檢B，并加熱60s左右，溫度為95℃以上，若前后顏色相差大，即Fmoc脫除。（4）洗滌6次，并用四氯苯酚測(cè)試，看是否洗凈。（5）縮合：加入對(duì)應(yīng)的氨基酸，并分別加入dic/oxyma、dic/hobt，反應(yīng)1h。（6）縮合檢測(cè)：用檢A、檢B對(duì)樹脂進(jìn)行全檢，反應(yīng)結(jié)束后，樹脂顏色相差不大，即氨基酸縮合完全。若顏色相差大，就再接一遍，然后就是脫保護(hù)-洗滌-縮合-縮合檢測(cè)這幾個(gè)步驟循環(huán)，直到卡培立肽序列合成結(jié)束。（7）裂解：用dcm溶脹樹脂，甲醇抽干樹脂，再轉(zhuǎn)移到船型反應(yīng)器中，用82.5%TFA、5%茴香硫醚、5%苯酚5%水2.5%EDT的正常切割液加上Tis、碘化銨，在不加熱的條件下把卡培立肽從樹脂上裂解下來，一般需要3h的裂解時(shí)間，完成裂解之后再加4-5倍乙醚進(jìn)行離心。（8）純化：用反相高效液相色譜儀純化，波長為214nm,色譜柱為50*250mm反相C8柱，用常規(guī)0.1%TFA/乙腈流動(dòng)相純化，分段收集主峰，再冷凍、減壓干燥，最后得到目標(biāo)產(chǎn)物。3結(jié)果與分析3.1使用HOBT合成的卡培立肽圖3HOBT合成MS圖譜圖3.1.1是用HOBT合成的卡培立肽于14aa處時(shí)取小樣做的MS圖，理論分子量為1627.832，實(shí)際分子量為1625.2，根據(jù)公式M=M/Z*N-N算出與實(shí)際分子量相差在合理范圍之內(nèi)，可以繼續(xù)合成。圖4HOBT合成MS圖譜圖3.1.2是用HOBT在合成卡培立肽到28aa處時(shí)做的MS圖，理論分子量為3080.44，實(shí)際分子量為3081.5，根據(jù)公式M=M/Z*N-N算出與實(shí)際分子量相差在誤差范圍以內(nèi)，說明合成成功，可以進(jìn)行純化。圖5HOBT合成HPLC圖譜圖3.1.3是用HOBT在合成卡培立肽完成后用反相高效液相色譜儀所做的成品HPLC圖譜，根據(jù)圖我們可以判斷出該物質(zhì)的出峰時(shí)間為14分鐘左右，用210mg樣品經(jīng)過純化最后得到了純度為83.40%的成品35.48mg，收率大約為16.90%3.2使用Oxyma合成的卡培立肽圖6Oxyma合成MS圖譜圖3.2.1是用Oxyma合成的卡培立肽于14aa處時(shí)取小樣做的MS圖，理論分子量為1627.832，實(shí)際分子量為1626.7，根據(jù)公式M=M/Z*N-N算出與實(shí)際分子量相差在誤差范圍以內(nèi)，可以繼續(xù)合成。圖7Oxyma合成MS圖譜圖3.2.2是用Oxyma在合成卡培立肽到28aa處時(shí)做的MS圖，理論分子量為3080.44，根據(jù)公式M=M/Z*N-N算出與實(shí)際分子量相差在誤差范圍以內(nèi)，說明合成成功，可以進(jìn)行純化。圖8Oxyma合成HPLC圖譜圖3.2.3是用Oxyma在合成卡培立肽完成后用反相高效液相色譜儀做的成品HPLC圖譜，根據(jù)圖我們可以判斷出該物質(zhì)的出峰時(shí)間為14分鐘左右，用210mg樣品經(jīng)過純化最后得到了純度為93.58%的成品53.26mg，收率大約為25.36%。3.3結(jié)果用Oxyma合成的的卡培立肽收率為25.36%，純度為93.58%,均高于HOBT所合成的的卡培立肽，收率為16.90%、純度83.40%，所以O(shè)xyma的耦合效率要高于HOBT，Oxyma更適用于多肽的合成。參考文獻(xiàn)[1]趙存友,王洋,韓香.多肽合成中肽鍵形成的研究進(jìn)展[J].武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,25(01):72-76[2].多肽藥物專家共識(shí)[J].藥物生物技術(shù),2020,27(01):14-16.[3]陸冬冬,喬春華,張國慶,白俊才,談技.固液結(jié)合法合成抗腫瘤多肽藥物醋酸布舍瑞林[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2014,45(11):1004-1008.[4]RBMerrifield.Solidphasepeptidesynthesis.I.Thesynthesisoftatetrapeptide[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1963,85(14):2149-2154.[5]王浙鋒.固相合成活性肽工藝優(yōu)化及活性驗(yàn)證[D].福州大學(xué),2011.[6]孫鵬程.縮宮素的固相合成及其純化方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化[D].海南大學(xué),2015.[7]董倩,琚瀅鎣,徐宏偉,葉小惠,成美玲,孔毅.布舍瑞林的合成制備研究[J]藥物生物技術(shù),2014,21(05):412-415.[8]李敏.氮雜多肽的固相合成方法研究及其應(yīng)用[D].重慶大學(xué),2019.[9]狄曼,郭麗媛,孔露,何子儒,黃勝堂,吳詩.Oxyma及其衍生的新型偶聯(lián)試劑[J].湖北科技學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2019,33(03):267-272.[10]AdamD.McF