微載體培養(yǎng)技術(shù)

關(guān)于微載體培養(yǎng)技術(shù)最初采用在培養(yǎng)液中加入一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積。此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，放大過(guò)程可依靠滾瓶數(shù)量的增加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大。如何增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積？微載體系統(tǒng)第2頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。現(xiàn)廣泛用于培養(yǎng)各類(lèi)細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)4h，微載體間的細(xì)胞“橋聯(lián)”×200

電鏡下串在一起的肝細(xì)胞微載體×730由于肝細(xì)胞的粘附作用微載體形成“串珠”×400

脊髓灰質(zhì)炎、狂犬和乙腦等疫苗第3頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、微載體的商品類(lèi)型第一種微載體：

VanWezel用DEAE-SephadexA50研制而來(lái)市售（國(guó)際）種類(lèi)有十幾種以上：液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline第4頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天顯微鏡下的高密度微載體第5頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性價(jià)廉，能重復(fù)使用。不含能毒害細(xì)胞的成分；微載體須與細(xì)胞有良好的相容性；密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基；粒徑在40～120μm范圍，生理鹽水溶脹后增大到60~250μm，粒度分布地均勻，徑差不大于20~25μm；良好的光學(xué)透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高溫滅菌；應(yīng)是非剛性材料；不吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分；收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分離純化；第6頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、微載體培養(yǎng)原理與操作

1、原理：將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒——微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。絲網(wǎng)微載體通氣的培養(yǎng)基鼓泡器攪拌葉輪微載體培養(yǎng)裝置圖第7頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天●微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)表面積（S/F）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。

●微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大?！裎⑤d體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過(guò)大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。第8頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。細(xì)胞增殖階段：黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層；貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上：貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，主要是靠靜電引力和范德華力；第9頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天Vero細(xì)胞在Cytodex-3微載體表面粘附鋪展的形貌變化第10頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天通常做法：貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。2、攪拌轉(zhuǎn)速：動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。第11頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天攪拌速率越大，制得的微球越小，聚合物濃度越大，制得的微球較大以聚己內(nèi)酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（PGLA）為基質(zhì)制備可生物降解微載體第12頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、細(xì)胞與微載體的相融性：與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。第13頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天(a)MCC細(xì)胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3表面；(b)MCC細(xì)胞，用纖粘連蛋白處理后的Cytodex-3表面(c)Vero細(xì)胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3表面；(d)Vero細(xì)胞，用層粘連蛋白處理的Cytodex-3表面(e)Vero細(xì)胞，用纖粘連蛋白處理的Cytodex-3表面細(xì)胞（Vero和MCC）在不同外源基質(zhì)處理的（Cytodex-3）微載體上貼附第14頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天

4、細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng)的影響因素

細(xì)胞方面：細(xì)胞群體、狀態(tài)和類(lèi)型。微載體方面：微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。培養(yǎng)環(huán)境中：培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。

第15頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟：(1)選擇合適的微載體類(lèi)型(2)浸泡水化及消毒(3)接種(4)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù)(5)消化(6)分離細(xì)胞(7)傳代培養(yǎng)第16頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)微載體纖維素為基質(zhì)微載體蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體（變性膠原微載體:蛋黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合）高分子材料為基質(zhì)微載體無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體

微載體基質(zhì)第17頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCL微球表面多皺，PLLA微球表面布滿坑洞，PGLA微球表面光滑不同種類(lèi)聚酯的微球表面形貌差異第18頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn):降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。生長(zhǎng)空間大，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)；多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)；多孔載體固定細(xì)胞過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害和損傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。第19頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天多孔載體制備的材料選擇(1)生物相容性：材料對(duì)細(xì)胞必須無(wú)毒害，對(duì)貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用；(2)機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長(zhǎng)時(shí)間攪拌狀態(tài)下不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、回收利用的要求。(3)熱穩(wěn)定性：在121℃、蒸汽滅菌下不分解、不破碎、不軟化。主要考慮生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性第20頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)

●培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度不同，常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

第21頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。第22頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天●培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢；隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來(lái)越重，需增加攪拌速率；經(jīng)過(guò)3d左右，培養(yǎng)液開(kāi)始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開(kāi)始攪拌。

第23頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天

●收獲細(xì)胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。第24頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天●微載體培養(yǎng)的放大：可以通過(guò)增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。第25頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞形態(tài)飽滿、生長(zhǎng)良好細(xì)胞形態(tài)更加立體，輪廓清晰，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，少量微載體上細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，細(xì)胞形態(tài)健康微載體上細(xì)胞更加致密，細(xì)胞密度達(dá)到5×106個(gè)/ml以上微載體上細(xì)胞依然良好，沒(méi)有明顯細(xì)胞脫落現(xiàn)象

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第1天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第2天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第3天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第4天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第10天第26頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)

●培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。

●表面積/體積大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；●把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；

●可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況；●簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好；●培養(yǎng)基利用率較高；

●放大容易；

●細(xì)胞收獲過(guò)程不復(fù)雜；

●勞動(dòng)強(qiáng)度小；

第27頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天傳統(tǒng)方法——疫苗生產(chǎn)的流感病毒在雞胚內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程：對(duì)幾百萬(wàn)個(gè)蛋胚逐一接種和收獲，很難自動(dòng)化、勞動(dòng)強(qiáng)度大、時(shí)間消耗多，且有污染的可能。BaxterBiomedical研究中心，奧地利如今——大規(guī)模微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗成為可能馴化Vero細(xì)胞適應(yīng)在用于大規(guī)模生產(chǎn)的無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。中試生產(chǎn)中最終的生物反應(yīng)器規(guī)模是1200升。包括工藝設(shè)計(jì)，特殊的通氣和攪拌裝置，可以進(jìn)一步放大到生產(chǎn)體積為6000升。關(guān)于H1N1疫苗生產(chǎn)第28頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天流感疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模生產(chǎn)區(qū)域(A)細(xì)胞培養(yǎng)(B)離心分離(C)超濾、洗濾。第29頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天Vero細(xì)胞流感疫苗生產(chǎn)圖(A)未感染的細(xì)胞(B)早期細(xì)胞病變影響(C)收獲前的晚期細(xì)胞病變大規(guī)模流感病毒生產(chǎn)中細(xì)胞病變影響圖片第30頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天本章講授到此，謝謝！第31頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天何謂微載體？指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。原理：

將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)?；叵胍幌拢旱?2頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天

一、微囊法（microencapsulation）:

用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。第四章動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)第33頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天圖4－1微膠囊示意圖微膠囊膜生物大分子代謝產(chǎn)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)第34頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、研究發(fā)展歷程1、首次報(bào)道生物活性物質(zhì)的微囊化研究（1957）：

將酶、蛋白質(zhì)和激素等生物活性物質(zhì)包封在選擇性透過(guò)膜中，形成球狀微膠囊,稱之為“生物微膠囊”。通過(guò)微膠囊膜的選擇透過(guò)作用,使囊外大于某一分子量的物質(zhì)不能擴(kuò)散進(jìn)入,而生物環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)或細(xì)胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微膠囊,從而達(dá)到免疫隔離目的。第35頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、“人工細(xì)胞”——“人工胰腺”80年代初,Lim等人將微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞移植相結(jié)合,制備了海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊,包埋豬胰島細(xì)胞形成“人工細(xì)胞”,并移植入糖尿病大鼠體內(nèi),結(jié)果成功地調(diào)節(jié)了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被稱為“人工胰腺”。該成果較好地解決了組織細(xì)胞移植過(guò)程的免疫排斥問(wèn)題,避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用,為組織細(xì)胞移植治療神經(jīng)/內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供了新思路。第36頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、90年代以來(lái),醫(yī)學(xué)界開(kāi)始嘗試以微膠囊作為基因重組細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具,利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能,治療相關(guān)疾病。微囊化人胰島培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞培養(yǎng)10d微囊化肝癌細(xì)胞培養(yǎng)40d第37頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、目前，微膠囊的應(yīng)用研究涉及藥物控制釋放、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞和酶的固定化以及生化物質(zhì)分離等領(lǐng)域,已經(jīng)成為材料、化學(xué)、化工、生物和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域工作者的研究熱點(diǎn)。

SEM下微膠囊的顯微形貌

×200LSCM下微膠囊表面形貌的照片第38頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同放大倍數(shù)的海藻酸鈣微膠囊的SEM照片不同放大倍數(shù)的殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊的SEM照片第39頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、性質(zhì)：曾是酶固定化技術(shù)中的一種（半透膜將酶包裹在球狀的微囊里，酶及大分子不能從微囊里透出，而小分子物質(zhì)可自由通過(guò)膜）。動(dòng)物細(xì)胞微囊化后，與游離細(xì)胞相比，降低了培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞的剪切力，同時(shí)也能提供很高的細(xì)胞密度，使得產(chǎn)物濃度增加，純度提高。動(dòng)物細(xì)胞微囊化培養(yǎng)的成功為干擾素、乙肝表面抗原(HBsAg)、單克隆抗體(MAb)等的產(chǎn)生提供了廣泛應(yīng)用前景。

第40頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天表4－1微膠囊制備材料

來(lái)源類(lèi)型材料天然脂質(zhì)卵磷脂、神經(jīng)鞘髓磷脂等多糖海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、淀粉等蛋白質(zhì)明膠、白蛋白、纖維蛋白半合成纖維素類(lèi)衍生物羧甲基纖維素鈉、已基纖維素、醋酸纖維素及其酯等合成可降解型乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚內(nèi)酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等第41頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天制備方法化學(xué)法界面聚合法、乳化法、輻射化學(xué)法物理化學(xué)法相分離法、溶劑蒸發(fā)法、界面沉積法、噴霧干燥法物理法靜電沉積法、氣相沉積法、流化床噴霧包衣法圖2制備方法使用率比較

1－－乳化法，2－－靜電法，3－－聚合法，4－－沉積法，

5－－相分離法，6－－噴霧干燥法，7－－溶劑蒸發(fā)法第42頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天

四、

微囊化培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn):操作：在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；生長(zhǎng)介質(zhì)為1.4%海藻酸鈉溶液,半透膜由多聚賴氨酸形成；培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)；微囊直徑控制在200-400μm為宜。

第43頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、動(dòng)物細(xì)胞微囊化的制備主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸的方法

簡(jiǎn)單過(guò)程：動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過(guò)微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣(cacl2)溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。第44頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天針頭CaCl2液微珠磁力攪拌器（微囊發(fā)生器）海藻酸/細(xì)胞懸浮液聚氨基酸檸檬酸第45頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天聚賴氨酸/海藻酸微囊化步驟：1.懸浮細(xì)胞膠狀液；2.成滴器；3.膠化小珠；4.包被溶液；5.顯微鏡下微囊；6.多孔微囊膜；7.完成操作后的微囊。第46頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天

制備注意事項(xiàng)：

●溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；

●所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害；

●膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)；

●膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

第47頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天①可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中受到物理?yè)p傷;②活性蛋白不能從囊中