植物基因克隆方法

關于植物基因克隆方法

一、基因克隆（分子克隆molecularcloning）通過體外重組技術,將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。二、基因克隆的核心---體外重組(Recombination)人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。第2頁,共47頁，2024年2月25日，星期天載體DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重組DNA（recombinantDNA）宿主（host）篩選、擴增克?。╟lone）基因克隆的路線DNA重組轉化第3頁,共47頁，2024年2月25日，星期天

用何種方法取決于基因產(chǎn)物（Geneproducts）的豐度以及gene的相關背景知識，如geneoritsprotein的表達模式及初級結構等

（一）已知基因產(chǎn)物的基因分離（二）未知基因產(chǎn)物的基因分離第4頁,共47頁，2024年2月25日，星期天（一）已知Geneproducts的基因分離1、利用DNA探針篩選基因文庫前提是已知一段DNA序列并構建了基因文庫●

同源(homologous)DNA探針

為了克隆一個完整基因結構或研究調節(jié)序列?！?/p>

異源(Heterologous)DNA探針利用一種植物的一段DNA序列作探針，從其它植物中克隆同源基因注意：有的基因在不同物種間同源性很高，有的則很低。第5頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2、利用protein信息分離基因前提是所研究的protein可以從植物中分離純化●利用antibody篩選表達文庫(ExpressionLibrary)

AntibodyproductionConstructionofExpressionLibrary●利用protein測序的氨基酸信息

Probe(oligonucleotides)Primer(degeneratedprimer)第6頁,共47頁，2024年2月25日，星期天(b)

Oligonucleotideprobesorgeneratedprimersforgeneswhosetranslationproductshavebeencharacterized

p176Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met122221(16species)Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn622642(1152species)第7頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共47頁，2024年2月25日，星期天RT-PCRandRACEPCRReverseTranscription,RapidAmplificationofcDNAEnds第9頁,共47頁，2024年2月25日，星期天問題1：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物。

原因：

1）RNA被降解

建議解決方法：利用無污染技術分離RNA；

如果使用RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0。

2）RNA中包含逆轉錄抑制劑

建議解決方法：

通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗。

逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，甲酰胺和胍鹽。

RT-PCR實驗中的常見問題與對策第10頁,共47頁，2024年2月25日，星期天3）多糖同RNA共沉淀

建議解決方法：

使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。4）起始RNA量不夠

建議解決方法：增加RNA量。

對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

5）RNA模板二級結構太多

建議解決方法：

將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火.提高逆轉錄反應溫度，對SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反應溫度≤65℃。

注意：不要在高于37℃時使用M-MLV。

如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應中使用隨機引物。

第11頁,共47頁，2024年2月25日，星期天6）PCR引物設計較差

建議解決方法：

避免在引物3‘端含有互補序列。避免可以形成內部發(fā)卡結構的序列。設計Tm類似的引物。

7）鎂離子濃度太低

建議解決方法：

從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。8）退火溫度太高

建議解決方法：

把退火溫度設定為低于Tm5℃。因為公式估算Tm值比所有真正的退火溫度實際會高些或低些。

9）富含GC的模板

建議解決方法：

對于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。

第12頁,共47頁，2024年2月25日，星期天問題2：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。

原因：

1）引物和模板非特異性退火

建議解決方法：

以2℃到5℃間隔增加退火溫度，減少退火時間。

在開始幾個循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。

使用PlatinumTaqDNA進行自動熱啟動PCR。

2）引物設計較差

避免在引物3‘端含有2到3個dG或dC。3）RNA中沾染了基因組DNA

4）鎂離子濃度太高

建議解決方法：

優(yōu)化鎂離子濃度。

5）因為擴增復雜模板導致引物錯誤起始

建議解決方法：

使用巢式PCR或遞減PCR。

第13頁,共47頁，2024年2月25日，星期天RACEPCR第14頁,共47頁，2024年2月25日，星期天PCR和細胞內DNA復制的相同點：（1）兩者都符合半保留復制模型，即兩條鏈都可作為模板，子代鏈中一條鏈來自于親代鏈，另一條鏈是新合成的（2）兩者都需要引物（3）兩者都需要依賴DNA的DNA聚合酶（4）兩者的底物都是dNTP（5）DNA合成時都是在DNA聚合酶作用下按堿基配對原則往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯鍵（6）兩者新合成鏈延伸的方向都是5’to3’（7）兩者DNA合成的保真度（精確性）都較高第15頁,共47頁，2024年2月25日，星期天PCR和細胞內DNA復制的不同點：（1）復制為半不連續(xù)復制，而PCR兩條鏈的合成都是連續(xù)的（2）復制時引物是由引發(fā)酶或引發(fā)體合成的，而PCR引物是在反應前加到反應體系中（3）復制需要在特定的復制原點起始，并且有終止點，而PCR在有特異引物存在時在任何序列都可起始，并且沒有終止點（4）復制時兩條模板鏈是在解旋酶的作用下局部打開雙鏈，而PCR兩條模板鏈通過變性完全打開雙鏈（5）復制時兩條鏈的合成是同步進行的，而PCR兩條鏈的合成可能不同步（6）PCR的DNA聚合酶為耐熱的DNA聚合酶，而復制的聚合酶一般不耐熱（7）復制一般為雙向復制，而PCR反應中DNA合成是單向的（8）復制時由多種蛋白因子參與，而PCR只有DNA聚合酶參與第16頁,共47頁，2024年2月25日，星期天（二）未知Geneproducts的基因分離1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達文庫（expressionlibrary）

4、DNA結合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術（Map-basedcloning）第17頁,共47頁，2024年2月25日，星期天建庫法cDNALibraryab第18頁,共47頁，2024年2月25日，星期天傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR）是根據(jù)絕大多數(shù)真核細胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人LiangP和PardeeA根據(jù)PolyA序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3’-錨定引物，其通式為5’-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。第19頁,共47頁，2024年2月25日，星期天mRNA差異顯示(differentialdisplay)第20頁,共47頁，2024年2月25日，星期天表達文庫法第21頁,共47頁，2024年2月25日，星期天從基因文庫的功能上看可分為克隆文庫及表達文庫?？寺∥膸煊煽寺≥d體構建。載體中具復制子、多克隆位點及選擇標記，可通過細菌培養(yǎng)使克隆片斷大量增殖。表達文庫是用表達載體構建。載體中除上述元件外，還具有控制基因表達的序列(如啟動子、SD序列、ATG、終止子等)，可在宿主細胞中表達出克隆片段的編碼產(chǎn)物。表達載體又有融合蛋白表達載體及天然蛋白表達載體之分。從克隆文庫中分離目的克隆時主要利用核酸探針，可以是根據(jù)蛋白質序列合成的寡核苷酸探針，也可以是同種或同屬生物的同源序列探針。從表達文庫中分離目的克隆時，因克隆片段的表達產(chǎn)物蛋白質具有抗原性及生物活性，所以除核酸探針外，還可以利用免疫學探針及生物功能進行篩選。表達文庫適合于那些不知道蛋白質的氨基酸序列、不能用核酸類探針篩選的目的基因的分離。

第22頁,共47頁，2024年2月25日，星期天1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達文庫（expressionlibrary）

4、DNA結合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術（Map-basedcloning）利用表達文庫利用酵母單雜交第23頁,共47頁，2024年2月25日，星期天Promoterstructure3’noncodingregion5’noncoding

regioncodingregionPromoterregion0ATG●-75-25TATACAATEnhancerSilencerOthercontrolsequenceCore

promoterTerminationsignal第24頁,共47頁，2024年2月25日，星期天DNA結合蛋白第25頁,共47頁，2024年2月25日，星期天a.DNA結合域-DNAbindingdomain，簡稱DNA-BD，它可識別效應基因上游的一段特定的區(qū)段，即上游激活序列(up-streamactivatingsequence,UAS)，并與之結合。b.轉錄激活域-Transcriptionalactivationdomain，簡稱AD，它通過同轉錄機(transcriptionmachinery)中的其它成分的結合作用，啟動UAS下游的基因進行轉錄。

轉錄因子的兩個主要結構域：

第26頁,共47頁，2024年2月25日，星期天酵母單雜交(yeastonehybrid)技術是體外分析DNA與細胞內蛋白質相互作用的一種方法，通過對酵母細胞內報告基因表達狀況的分析，來鑒別DNA結合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結合蛋白基因，或對DNA結合位點進行分析.運用此技術，能篩選到與DNA結合的蛋白質，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質的核苷酸序列，而無需復雜的蛋白質分離純化操作。目前認為真核生物的轉錄起始需要轉錄因子的參與。這些轉錄因子通常由一個DNA結合域（BD)和一個或多個與其他調控蛋白相互作用的轉錄激活域（AD）組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉錄因子。酵母單雜交Yeastone-hybridsystem第27頁,共47頁，2024年2月25日，星期天GAL4的DNA結合域靠近羧基端,含有幾個鋅指結構,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS);而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發(fā)揮作用.據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結合結構域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉錄激活結構域激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉錄。正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒；(2)含有目的基因和下游報告基因的報告質粒。首先將報告質粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株；再將文庫質粒轉化入報告株；若存在文庫蛋白與目的基因相互作用,可通過對報告基因的表達將文庫蛋白的基因篩選出來.

第28頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共47頁，2024年2月25日，星期天1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達文庫（expressionlibrary）

4、DNA結合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術（Map-basedcloning）第31頁,共47頁，2024年2月25日，星期天

酵母雙雜交體系

酵母雙雜交體系(yeast-twohybridsystem,Y2H)是上一世紀九十年代初期在轉錄因子結構基礎上發(fā)展起來的一種敏感的檢測蛋白質-蛋白質相互作用的方法，亦即是體內鑒定基因的方法。它不僅可有效地用來分離能與一種已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一種蛋白質及其編碼基因，而且可以用來確定蛋白質相互作用的特異性結構域及其氨基酸序列。第32頁,共47頁，2024年2月25日，星期天方法構建兩種E.coli-Yeast穿梭質粒載體:已知基因與BD序列融合表達融合的蛋白質叫做誘餌蛋白質(Baitprotein)第一種質粒載體又叫做誘餌質粒載體或DNA-BD質粒載體(具Trp基因)。第33頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第二種質粒載體又叫做文庫質粒載體或AD質粒載體，它具有亮氨酸基因(leu)，是用來構建cDNA表達文庫的專用載體。cDNA編碼蛋白質與GAL4-AD多肽融合這種與AD融合的蛋白質叫做基因文庫編碼蛋白質，其中可與誘餌蛋白質發(fā)生相互作用的特稱為捕獲蛋白質(preyprotein)第34頁,共47頁，2024年2月25日，星期天AD:GAL4ActivationDomain;DNA-BP:DNABindingProtein;USA：Upstreamactivatingsequence.GAL1UAS啟動子LacZ(orHIS3)報告基因GAL1UAS啟動子LacZ(orHIS3)報告基因GAL1UAS啟動子LacZ(orHIS3)報告基因轉錄DNABDADDNABD(a)(b)(c)XYADXY第35頁,共47頁，2024年2月25日，星期天1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達文庫（expressionlibrary）

4、DNA結合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術（Map-basedcloning）第36頁,共47頁，2024年2月25日，星期天圖位克隆技術圖位克隆(Map-basedcloning)又稱定位克隆(positionalcloning),1986年首先由劍橋大學的Alancoulson提出，用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行的，無需預先知道基因的DNA順序，也無需預先知道其表達產(chǎn)物的有關信息，但應有以下兩方面的基本情況:一是有一個根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體。二是開展以下幾項工作:1)首先找到與目標基因緊密連鎖的分子標記；2)用遺傳作圖和物理作圖將目標基因定位在染色體的特定位置；3)構建含有大插入片段的基因組文庫(BAC庫或YAC)；4)以與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫；5)用獲得陽性克隆構建目的基因區(qū)域的跨疊群；6)通過染色體步行、登陸或跳躍獲得含有目標基因的大片段克?。?)通過亞克隆獲得含有目的基因的小片段克??；8)通過遺傳轉化和功能互補驗證最終確定目標基因的堿基序列。

第37頁,共47頁，2024年2月25日，星期天DNAmarkersforgeneticmaps●第38頁,共47頁，2024年2月25日，星期天eg.ThebreastcancergeneBRCA1MappingofBRCA1Toisolatethegene,thefirststepistodeterminewhichchromosomecontainsitandthepositionofthegeneonthischromosome.第39頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共47頁，2024年2月25日，星期天圖位克隆存在的問題圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術來定位基因。

在分析自然發(fā)生的變異的時候，我們最有可能遇到的復雜情況是一個給定的性狀是由不止一個的基因位點控制的。無論何時，當影響這些性狀的自然或者誘導的突變被定位的時候，第二位點修飾成分會干擾這些分析。

表觀（上位）遺傳突變這個術語是描述一個基因在表達和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變，這是圖位克隆工程中又一個可能的復雜情況。

關于染色體上位點的物理和遺傳距離的比值是變化的。1%重組的遺傳距離相當于100-400Kb的物理距離，平均是250Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個顯著的例外，在這里1%重組的遺傳距離相當于1000-