桑蠶微粒子病診斷防控技術(shù)規(guī)程征求意見稿

ICSICS65.020.30CCSB47代替DB51/T844—2008DB51/T1185—2011XXXX-XX-XX發(fā)布IDB51/T844—XXXX 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4診斷技術(shù) 5防控技術(shù) 附錄A（資料性）熒光定量PCR產(chǎn)物相關(guān)信息 附錄B（資料性）陽性質(zhì)粒的制備 DB51/T844—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替DB51/T844—2008《桑蠶微粒子病防治技術(shù)規(guī)程》。與DB51/T844—2008相比，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：——增加了桑葉全程消毒技術(shù)。本文件代替DB51/T1185—2011《桑蠶微粒子病診斷技術(shù)規(guī)程》。本文件與DB51/T1185—2011相比，除編輯性修改外主要技術(shù)變化如下：——增加了分子生物學診斷方法。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口并解釋。本文件起草單位：四川省蠶業(yè)管理總站、西南大學、四川省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所。本文件主要起草人：吳鋼、馬露蕓、潘敏慧、青學剛、董戰(zhàn)旗、王琳璐、楊炯、魏卓婭、王晶晶、何建梅、雷秋容、曹寧寧。本文件的歷次版本發(fā)布情況為：——首次發(fā)布為DB51/T844—2008；——首次發(fā)布為DB51/T1185—2011；——本次為第一次修訂。1DB51/T844—XXXX桑蠶微粒子病診斷防控技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了四川省桑蠶微粒子病診斷和防控技術(shù)要求。本文件適用于四川省桑蠶微粒子病的診斷和防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20395桑蠶微粒子病病原鑒定方法NY/T1027桑園用藥技術(shù)規(guī)程NY/T3677家蠶微孢子蟲熒光定量PCR檢測方法DB51/T848養(yǎng)蠶消毒技術(shù)規(guī)程DB51/T1187桑蠶原蠶基地建設(shè)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1桑蠶微粒子病pebrineforsilkworm(Bombyxmori)由桑蠶微孢子蟲（NosemabombycisNaegeli）感染引起的蠶病。3.2補正檢查correctiveinspectionforpebrine從母蛾檢疫合格的原蠶種中，逐卵圈抽取少量蠶卵高溫催青，對孵化蟻蠶及卵殼、死卵，或原蠶種正常收蟻后的催青死卵、尾蟻、卵殼等，進行微粒子病檢查。3.3預知檢查predictiveinspectionforpebrine從飼養(yǎng)到制種全過程，對幼蟲、蛹、成蟲及其排泄物（如：蠶糞、熟蠶尿、蛾尿等）、脫出物（如：蛻皮殼、蛹殼、鱗毛等）等抽樣，進行微粒子病檢查。3.4Ct值cyclethreshood每個樣品反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。2DB51/T844—XXXX3.5引物primer在核苷酸聚合作用起始時，刺激合成的，一種具有特定核苷酸序列的大分子，與反應物以氫鍵形式連接。3.6探針probe一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。4診斷技術(shù)4.1常規(guī)診斷4.1.1試劑與材料4.1.1.1氫氧化鉀溶液[w(KOH)=2％]、濃鹽酸[w(HCl)=30％]、過氧化氫溶液[w(H2O2)=10％]、乙醇溶液[w(CH3CH2OH)=75％]、無菌水。分析用水按GB/T6682規(guī)定執(zhí)行。4.1.1.2解剖剪、鑷子、橡皮吸管；研缽、研磨棒；樣品袋、離心管（1.8mL、5mL）；容量瓶、量筒、燒杯；載玻片、蓋玻片；無紡布濾紙。4.1.2主要儀器設(shè)備濕度范圍50%~95%）；冰箱（溫度為0℃~4℃和-20℃);電子天平（精度0.01g）；離心機（0r/min~3000r/min）。~4.1.3外觀觀察通過肉眼觀察，蠶的不同發(fā)育階段是否具有下列癥狀：a)小蠶期：收蟻后不疏毛、體色深暗、體軀瘦小、發(fā)育緩慢、重癥死亡；群體發(fā)育不齊。b)大蠶期：表皮縮皺、體呈銹色；體壁出現(xiàn)微細不規(guī)則黑褐色病斑，以尾角末端、氣門周圍和胸腹足外側(cè)部位較多；蛻皮困難、死亡；群體發(fā)育不齊。c)蛹蛾期：蛹表皮無光澤、反應遲鈍、腹部松弛，體壁出現(xiàn)微細不規(guī)則黑褐色病斑，感病嚴重的不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鱗毛脫落、腹部膨大、節(jié)間松弛，交配能力差，產(chǎn)卵少。d)卵期：卵形不正，排列不齊、多重疊卵，卵產(chǎn)附差、易脫落，不受精卵和死卵多；催青期發(fā)育不整齊。4.1.4解剖觀察將外觀觀察的具有上述大蠶期典型癥狀的病蠶，用解剖剪從背中線剪開，肉眼觀察絲腺是否有乳白色膿皰狀斑塊。4.1.5顯微鏡檢查4.1.5.1樣品采集采集4.1.3描述的典型癥狀的小蠶、大蠶、蛹、蛾、卵，樣品置于樣品袋或離心管中，做好記載。3DB51/T844—XXXX4.1.5.2樣品處置樣品每份先混合均勻，再分成2份，其中1份作為檢樣，另1份作為備樣保存于0℃~4℃冰箱中，保存期30d～60d。不同發(fā)育階段的樣品，按照下列方法處置：a)卵期樣品解除滯育后，在生化培養(yǎng)箱溫度（29±0.5）℃、相對濕度≥85％的條件下催青；孵化后待其自然死亡。b)小蠶期蟻蠶樣品置生化培養(yǎng)箱于溫度（29±0.5）℃、相對濕度≥85%條件下，放置2d～3d。c)小蠶期其他階段、大蠶期、蛹期、蛾期樣品不需處置。4.1.5.3樣本制備將上述處置后的樣本分別置于研缽中，每個研缽各放1個研磨棒，磨碎；滴入4滴～10滴氫氧化鉀溶液[w(KOH)=2％]，再次研細。4.1.5.4顯微鏡觀察4.1.5.4.1直接觀察法按照序號，將磨碎液用研磨棒點樣至載玻片，蓋上蓋玻片，制成鏡檢樣本。4.1.5.4.2離心沉淀法將4.1.5.3制備的磨碎液，加入適量無菌水，用無紡布濾紙過濾后，將濾液移入離心管中，經(jīng)3000r/min離心3min，傾去上清液，沉淀物振蕩制成鏡檢樣本。4.1.5.4.3酸溶解法將檢出有微粒子孢子的磨碎液吸取2滴，分別滴于載玻片兩端，自然干燥后在其中1點加1滴濃鹽酸[w(HCl)=30％]，另1點作對照，在30℃生化培養(yǎng)箱中放置10min～20min后，蓋上蓋玻片鏡檢。如果樣本已干，可加無菌水1滴。經(jīng)過酸處理的樣本，微粒子孢子溶解消失，真菌孢子保持原狀。4.1.5.4.4過氧化氫法將檢出有微粒子孢子的磨碎液吸取1滴，滴于載玻片上，再加1滴～2滴過氧化氫溶液[w(H2O2)=10％]，蓋上蓋玻片，經(jīng)過10min～30min，相襯（相差）顯微鏡鏡檢，活微粒子孢子釋放出極絲。4.1.6判定通過外觀觀察，蠶的不同發(fā)育階段出現(xiàn)6.1.1表述癥狀之一的，可疑似為微粒子病；通過解剖觀察，大蠶期病蠶絲腺出現(xiàn)可見的乳白色膿皰狀斑塊時，可確診為微粒子病。通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)孢子呈卵圓形或長卵圓形，淡綠色，折光性強，中間隱約可見1根黑色線狀物，表面光滑，孢子活潑，多左右擺動，有時可見翻滾現(xiàn)象時，孢子則為蠶微粒子孢子（參見GB/T20395附錄A微粒子孢子圖），原樣品確診為微粒子病。加鹽酸作用后，被溶解的孢子為微粒子孢子，原樣品確診為微粒子病。加過氧化氫作用后，活微粒子孢子釋放出極絲，原樣品確診為微粒子病。4.2分子生物學診斷采用熒光定量PCR檢測法。4DB51/T844—XXXX4.2.1試劑與材料4.2.1.1氫氧化鉀溶液[w(KOH)=2％]、乙醇溶液[w(CH3CH2OH)=75％]、蛋白酶K[20mg/mL]、氯仿、KCl2.67mmol/L；Na2HPO48.lmmol/L；KH2PO41.76mmol/L；pH=7.2~7.4)]、TEbuffer[10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH8.0]、濃度為1.0×103拷貝/μL的陽性質(zhì)粒、超純水(Rnase/Dnasefree,Sterile)。分析用水按GB/T6682規(guī)定執(zhí)行。4.2.1.2滅菌的槍頭和離心管；研缽、研磨棒。4.2.2主要儀器設(shè)備水浴鍋、二級生物安全柜、冰箱（溫度為0℃~4℃、-20℃、-80℃);熒光定量PCR儀（溫度范圍4.0℃~99.9℃)、臺式低溫高速離心機（0r/min~16000r/min）；微量可調(diào)移液器（最大量程分別為2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）；超微量核酸蛋白測定儀；紫外分光光度計。4.2.3樣品處置4.2.3.1樣本制備不同發(fā)育時期的樣品，按照下列方法制樣：a)卵期：取200粒蠶卵。b)小蠶期：取50頭蟻蠶、20頭~30頭小蠶。c)大蠶期：取3頭~5頭大蠶。d)蛹期：取3個~5個蠶蛹。e)蛾期：取1只~3只母蛾。以上樣品均使用研缽充分研磨破碎，保存于4℃冰箱備用。4.2.3.2DNA提取4.2.3.2.1普通提取法4.2.3.2.1.1取4.2.3.1制備好的樣品2.0g，加入500mLPBS緩沖液和5μL蛋白酶K溶液，55℃水浴2h。4.2.3.2.1.2加入等體積的Tris飽和酚，顛倒充分混勻5min，4℃,12000r/min離心10min，取上清液；加等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，顛倒充分混勻5min，4℃,12000r/min離心10min，取上清液；加入0.8倍體積的冷凍異丙醇，-80℃沉淀15min。4℃,12000r/min離心10min，小心傾倒上清；加入600μL冰乙醇[w(CH3CH2OH)=75％]，輕輕轉(zhuǎn)動，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置5min，12000轉(zhuǎn)離心3min，小心傾倒上清，并用移液槍吸掉殘余液體；再加入75%冰乙醇，將DNA再洗一次，12000r/min離心2min，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后直立離心管，自然風干；加入100μLTEbuffer（pH8.0）溶解DNA，在37℃金屬浴中保溫30min；使用超微量核酸蛋白測定儀測定提取的核酸濃度，并根據(jù)測量的數(shù)值將DNA濃度稀釋至100ng/μL以內(nèi)作為DNA模板。4.2.3.2.2試劑盒提取法取4.2.3.1制備好的樣品，使用經(jīng)過質(zhì)量驗證的或等效的市售商品化微生物DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書步驟提取DNA。4.2.3.3DNA保存提取好的DNA模板保存于-20℃冰箱備用，保存期限宜在6個月內(nèi)；長期保存應置于-80℃冰箱。5DB51/T844—XXXX4.2.4實時熒光定量PCR檢測4.2.4.1引物序列正向引物:5'-ACGGAAGAATACCACAAGGAGT-3’；反向引物:5'-CACTACATCTGTCTAAATGAGGGTC-3’；探針：5'-FAM-CGTTGAGTCAAATTAAGCCGCACA-TAM-3’。熒光定量PCR產(chǎn)物相關(guān)信息參見附錄A。4.2.4.2對照設(shè)置陽性對照：含有經(jīng)6.3.2.1引物擴增的GNL8基因片段的重組質(zhì)粒DNA，拷貝數(shù)為1.0×103個/μL，陽性質(zhì)粒制備方法見附錄B。陰性對照：超純水(Rnase/Dnasefree,Sterile)。4.2.4.3PCR反應體系反應體系20μL：2X探針法qPCRMix10μL，10umol/L正、反DNA模板2μL，超純水(Rnase/Dnasefree,Sterile)6.8μL。反應程序：95℃預變性2min，95℃5s，60℃30s（熒光信號在每個循環(huán)的此階段進行），共40個循環(huán)。每個樣品重復3次。可按照其它市售商品化試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應。4.2.4.4PCR反應質(zhì)量控制對照組的檢測結(jié)果應符合以下情況，此次檢測方為有效：陰性對照無Ct值，且無擴增曲線。陽性對照的Ct值應在21～23之間，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。4.2.5判定根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。判定規(guī)則如下：a)待測樣本檢測Ct值小于或等于35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，判定原樣品檢出微粒子；b)待測樣本檢測Ct值大于35，且未出現(xiàn)典型的擴增曲線，判定原樣品未檢出微粒子；c)若陰性對照Ct值小于35，或陽性對照Ct值大于35或沒有Ct值，則重新檢測。5防控技術(shù)5.1蠶前防控5.1.1抽樣5.1.1.1時間及范圍養(yǎng)蠶前，對蠶室、蠶具、養(yǎng)蠶環(huán)境和桑園等，進行抽樣。5.1.1.2方法用消毒棉簽在冷開水中浸濕后蘸擦取樣，或用乙醇溶液消毒小刀后刮取抽樣。抽取的每個樣品分別放入樣品袋，并記錄抽樣時間、地點、樣品名稱、抽樣人等信息。5.1.2制樣檢查6DB51/T844—XXXX將抽取的樣品分別置于研缽中，固體樣本加入適量氫氧化鉀溶液，研磨后按照序號點板制鏡檢標本，在顯微鏡下觀察，每個樣本觀察不少于10個視野，記錄鏡檢結(jié)果。5.1.3消毒按照DB51/T848中6.1的規(guī)定執(zhí)行。消毒后再抽樣鏡檢，直至鏡檢無微粒子孢子。5.2蠶中防控5.2.1補正檢查包括催青檢查、尾蟻檢查、死卵及卵殼檢查。5.2.1.1抽樣及樣品處置補正檢查抽樣及樣品處置見表1。表1抽樣及樣品處置項目抽樣樣品處置催青檢查逐批逐張逐蛾圈抽取晚產(chǎn)卵、不受精卵和死卵，每蛾抽取20粒~參照4.1.5.2a)規(guī)定執(zhí)行。原種按張平均分為4個樣、原原種按張平均分為2個樣、母種每蛾1個樣本。尾蟻檢查收蟻完畢的蠶連紙上孵化的尾待尾蟻自然死亡，1張為1個樣本。死卵及卵殼檢查將尾蟻掃下后蠶連紙上的所有死卵、不受精卵及卵殼等。不需處置，1張為1個樣本。5.2.1.2樣本制備按照4.1.5.3或4.2.3.1的規(guī)定進行樣本制備。5.2.1.3結(jié)果處置按照4.1.6或4.2.5的規(guī)定進行診斷，診斷出有微粒子的，對號淘汰整張蠶種。5.2.2卵面消毒平附蠶種催青至點青時，用干凈排筆蘸取含有效氯0.33％的漂白粉液，刷于卵面及連紙正面和背面，用量以連紙濕潤不滴液為度。原原種、母種連紙可直接浸入前述消毒液中消毒10s，取出。蠶種消毒后，平攤于蠶箔中陰干后及時轉(zhuǎn)入黑暗抑制保護。5.2.3蠶期消毒包括蠶體蠶座消毒、蠶室地面及周圍環(huán)境消毒、用具消毒。消毒方法和程序按照DB51/T848中6.2的規(guī)定執(zhí)行。5.2.4其他衛(wèi)生消毒包括洗手消毒、蠶沙處理、病蠶處理、進出蠶室消毒。消毒方法和程序按照DB51/T848中6.2.4的規(guī)定執(zhí)行。5.2.5桑葉全程消毒7DB51/T844—XXXX5.2.5.1消毒液有效氯含量消毒液為漂白粉澄清液，有效氯含量見表2。表2消毒液有效氯含量齡期攀西地區(qū)其他地區(qū)小蠶期0.30%~0.33%0.33%~0.35%大蠶期0.35%~0.38%0.36%~0.38%5.2.5.2消毒方法桑葉抖散后放入消毒池，使葉面充分浸漬消毒液。浸漬時間見表3。浸漬期間檢測有效氯濃度1次~2次，排氣泡1次~2次。桑葉浸漬完畢保持濕潤。從桑葉浸漬開始計時，30min后甩干。消毒后的~桑葉攤?cè)胭A桑室消毒桑葉專用區(qū)域，抖散，保持疏松，晾干待用。消毒液現(xiàn)用現(xiàn)配。每浸消3次桑葉更換消毒液1次。表3浸漬時間齡期攀西地區(qū)其他地區(qū)小蠶期5min~10min10min~15min大蠶期5min~10min5min~10min5.2.6預知檢查包括蠶期檢查、蔟中檢查、蛹期檢查、苗蛾檢查。根據(jù)預知檢查情況，可進行發(fā)蛾促進檢查。5.2.6.1抽樣及樣品處置預知檢查抽樣及樣品處置見表4。表4抽樣及樣品處置項目抽樣樣品處置蠶期檢查每齡每飼育區(qū)（原蠶每張或每飼育戶）抽取弱小蠶、病死蠶、遲眠蠶、遲起蠶等約50頭。不需處置。小蠶每10頭～20頭蠶、大蠶每3頭～5頭蠶為1個樣本。蔟中檢查采繭時，每飼育區(qū)（原蠶每飼育戶）抽取不結(jié)繭蠶、薄皮繭蠶、死蠶。不需處置。每2頭蠶為1個樣本。蛹期檢查削繭時，每飼育區(qū)（原蠶每飼育戶）的每箔抽取除明顯感染細菌、病毒、真菌等外的病死蛹的50%。不需處置。每1粒~2粒蛹為1個樣本。發(fā)蛾促進檢查原蠶上蔟3d時，每飼育戶隨機抽取700粒種繭。置于溫度30℃、相對濕度≥80％條件下保護，上蔟第9d削繭，蛹攤放于小蠶網(wǎng)袋中，待8DB51/T844—XXXX80％發(fā)蛾時制樣。每2蛾～5蛾為1個樣本。苗蛾檢查每飼育區(qū)（戶）抽取最早羽化的苗蛾10蛾～20蛾。不需處置。每2蛾～5蛾為1個樣本。5.2.6.2樣本制備按照4.1.5.3或4.2.3.1的規(guī)定進行樣本制備。5.2.6.3結(jié)果處置按照4.1.6或4.2.5的規(guī)定進行診斷，診斷出有微粒子的，對號整區(qū)（戶）淘汰蠶（繭、蛹、蛾）。5.2.7選蠶、選繭、選蛹、選蛾——蠶期：選出淘汰弱小蠶、遲眠蠶?！O期：選出淘汰薄皮繭、血繭、小繭及不結(jié)繭蠶?！计冢哼x出淘汰病死蛹、肥胖蛹、黑斑蛹、腹部環(huán)節(jié)松弛并手觸反應遲鈍的蛹?！昶冢哼x出淘汰苗蛾、尾蛾，以及卷翅、黑環(huán)節(jié)、大肚、鱗毛脫落、黑斑等癥狀的蠶蛾。淘汰的繭、蛹、蛾經(jīng)消毒后集中處理。5.2.8種繭、蛹期攤放與合批——原原種種繭、蛹期分飼育區(qū)攤放于飼育盒中，選留蛾區(qū)確定后，苗蛾預知檢查無微粒子的，小系內(nèi)可合并制種?！N種繭、蛹期分飼育區(qū)攤放于蠶箔中。蔟中、蛹期及苗蛾預知檢查無微粒子的，可合并制種?！Q種繭、蛹期分飼育區(qū)（戶）攤放于蠶箔中。蔟中、蛹期、發(fā)蛾促進及苗蛾預知檢查無微粒子的，可合并制種。5.3蠶后防控養(yǎng)蠶制種結(jié)束后，養(yǎng)蠶相關(guān)環(huán)境用具應及時全面清洗、消毒。消毒方法按照DB51/T848中6.3的規(guī)定執(zhí)行。5.4桑園防控包括桑樹病蟲害及野外昆蟲防治、桑葉采運要求。5.4.1桑樹病蟲害及野外昆蟲防治桑園不間、套作十字花科作物。桑樹病蟲害及野外昆蟲的防治按照NY/T1027中7的規(guī)定執(zhí)行。5.4.2桑葉采運貯運桑葉的用具，每天使用后立即用含有效氯1％的漂白粉澄清液消毒后待用。桑葉采摘時應除去蟲口葉、病蟲污染葉。桑葉運輸進入蠶房，應與除沙道路分離。5.5環(huán)境防控包括附屬室及配套設(shè)施防控、原蠶區(qū)防控。9DB51/T844—XXXX5.5.1附屬室及配套設(shè)施防控5.5.1.1清潔消毒5.5.1.1.1使用前、后，催青室、保種室、蠶種整理室、浸酸浴消場、冷庫、檢驗室等附屬室，應清掃遺漏的蠶卵、灰塵及廢棄蠶連紙、散卵盒等，集中銷毀；地面用含有效氯1％的漂白粉澄清液消毒1次。蠶種架、蠶種筐、蠶箔等相關(guān)用具消毒按照DB51/T848資料性附錄A的規(guī)定執(zhí)行。5.5.1.1.2使用結(jié)束，催青室、保種室、蠶種整理室清掃后，應密閉消毒1次，方法按照DB51/T848資料性附錄A.5、A.7的規(guī)定執(zhí)行。冷庫停庫后，及時清掃庫房及其環(huán)境，庫房地面及環(huán)境用含有效氯1％的漂白粉澄清液消毒1次。5.5.1.2日常衛(wèi)生換鞋入室；非工作人員不應隨意進入。5.5.2原蠶區(qū)防控包括原蠶區(qū)的選擇、原蠶戶的選擇和原蠶飼育。按照DB51/T1187中4、5、6的規(guī)定執(zhí)行。DB51/T844—XXXX（資料性）熒光定量PCR產(chǎn)物相關(guān)信息A.1檢測基因家蠶微孢子蟲GNL8rRNA基因，GenBank登錄號：MT510146.1（745~928）。A.2擴增產(chǎn)物大小及序列擴增產(chǎn)物183bp。ACGGAAGAATACCACAAGGAGTGGATTGTGCGGCTTAATTTGACTCAACGCGGG