使用具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法

使用具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法專利名稱：使用具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法使用具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法本發(fā)明涉及利用具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物來(lái)生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法。所述精細(xì)化學(xué)藥品可以是氨基酸、用于聚合物合成的單體、糖、脂類、油類、脂肪酸或維生素，且優(yōu)選是天冬氨酸家族的氨基酸，特別是甲硫氨酸或賴氨酸，或所述氨基酸的衍生物，特別是尸胺。另外，本發(fā)明涉及重組微生物，所述重組微生物與原始微生物相比具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性，以及涉及這些微生物在例如天冬氨酸家族氨基酸及其衍生物等精細(xì)化學(xué)藥品生產(chǎn)中的用途。背景技術(shù)：精細(xì)化學(xué)藥品，例如包括如乳酸等有機(jī)酸，如二氨基戊烷(尸胺)等有機(jī)胺，標(biāo)準(zhǔn)(proteogenic)或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，碳水化合物，芳香化合物，如吡啶二羧酸(dipicolinate)的芳香雜環(huán)化合物、維生素和輔因子，飽和與不飽和脂肪酸，通常在制藥、農(nóng)業(yè)、化妝品以及食品和飼料工業(yè)中需要并使用，但也作為單體用于聚合物合成。它們通常通過(guò)化學(xué)過(guò)程進(jìn)行生產(chǎn)，但也有越來(lái)越多的精細(xì)化學(xué)藥品通過(guò)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行生產(chǎn)。關(guān)于例如氨基酸甲硫氨酸，目前世界年產(chǎn)量達(dá)約500，000噸。標(biāo)準(zhǔn)的工業(yè)生產(chǎn)方法不是發(fā)酵，而是多步驟的化學(xué)過(guò)程。甲硫氨酸是禽畜飼料中的第一限制性氨基酸，并因此主要用作飼料添加劑?，F(xiàn)有技術(shù)中已發(fā)表了多種嘗試，通過(guò)發(fā)酵(例如使用大腸桿菌等微生物)來(lái)生產(chǎn)甲硫氨酸。如谷氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等其他氨基酸，是通過(guò)例如發(fā)酵方法來(lái)生產(chǎn)的。對(duì)于這些目的，已經(jīng)證明如谷氨酸棒桿菌(C.glutamic·)等特定微生物特別合適。通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)有特殊的優(yōu)勢(shì)，即只生產(chǎn)L-氨基酸，并且避免使用如溶劑等通常用于化學(xué)合成的造成環(huán)境問(wèn)題的化學(xué)品。關(guān)于如吡啶二羧酸、尸胺或賴氨酸等精細(xì)化學(xué)藥品，所述化合物應(yīng)用于多種領(lǐng)域，并且通常通過(guò)非發(fā)酵的方法生產(chǎn)。二吡啶羧酸(CAS號(hào)499-83-2)，也稱為吡啶-2，6-二羧酸或DPA，應(yīng)用于不同的技術(shù)領(lǐng)域，例如用作聚酯或聚酰胺型共聚物合成中的單體，吡啶合成的前體，過(guò)氧化物和過(guò)酸(例如叔丁基過(guò)氧化物、二甲基-環(huán)己酮過(guò)氧化物、過(guò)氧乙酸和過(guò)氧單硫酸(peroxy-monosulphuricacid))的穩(wěn)定劑，金屬表面拋光液的成分，由于存在痕量金屬離子容易變質(zhì)(螯合效應(yīng)sequestratingeffect)的有機(jī)材料的穩(wěn)定劑，環(huán)氧樹(shù)脂穩(wěn)定劑，以及攝影用溶液或乳劑的穩(wěn)定劑(防止鈣鹽沉淀)。眾所周知，DPA是在細(xì)菌的內(nèi)生孢子中生物合成的。催化從二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)生物合成DPA的酶是吡啶二羧酸合成酶。所述酶已從枯草芽孢桿菌中分離出來(lái)并進(jìn)一步表征。它由spoVP操縱子(BG10781，BG10782)編碼。在1950年代，在鏈霉菌屬產(chǎn)生的幾種強(qiáng)堿性肽抗生素中鑒定出L-β-賴氨酸。水解時(shí)產(chǎn)生L-β-賴氨酸的抗生素包括紫霉素、黃鏈霉菌素Α、鏈絲菌素、玫瑰絲菌素和土霉素(Stadtman，Adv.Enzymol.Relat.AreasMolec.Biol.38:413(1973))。β-賴氨酸也是諾卡爾菌屬真菌產(chǎn)生的抗生素(如菌霉素)的組分，并且賴氨酸可用于制備其他生物學(xué)上有活性的化合物。然而，賴氨酸的化學(xué)合成既費(fèi)時(shí)，需要昂貴的起始材料，又通常得到外消旋混合物。1，5-二氨基戊烷是目前通過(guò)L-賴氨酸的化學(xué)過(guò)程(脫羧)生產(chǎn)的相對(duì)昂貴的特制化學(xué)品。通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)的二氨基戊烷在市場(chǎng)上還未能得到。當(dāng)今精細(xì)化學(xué)藥品的發(fā)酵生產(chǎn)通常在如谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)>；^J木干胃、酉良胃##(Saccharomycescerevisiae)>^M##(Schizosaccharomycespombe)、畢赤式酵母(Pichiapastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢桿菌、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)或氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)等微生物中進(jìn)行。特別地，已知谷氨酸棒桿菌具有產(chǎn)生大量氨基酸(如L-谷氨酸和L-賴氨酸)的能力(Kinoshita，S.(1985)Glutamicacidbacteria；頁(yè)115-142,于A.L.DemainandN.A.Solomon(編),Biologyofindustrialmicroorganisms,Bejamin/CummingsPublishingCo.,London)?，F(xiàn)有技術(shù)的一些嘗試，在如大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌等微生物中生產(chǎn)如氨基酸、脂類、維生素或碳水化合物等精細(xì)化學(xué)藥品，是設(shè)法通過(guò)例如增強(qiáng)各精細(xì)化學(xué)藥品生物合成途徑有關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)達(dá)到該目的的。如果，例如已知氨基酸(如甲硫氨酸或賴氨酸)的生物合成途徑中某個(gè)步驟是限制速率的，各自酶的過(guò)度表達(dá)可能容許得到產(chǎn)生更多催化反應(yīng)產(chǎn)物的微生物，并且因此將最終導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的產(chǎn)量提高。相似地，例如在想得到的氨基酸生物合成途徑中，如果已知由于向不期望的中間產(chǎn)物合成傳遞大量代謝能，而不期望發(fā)生某個(gè)酶促步驟，可以考慮下調(diào)相關(guān)酶活性的表達(dá)，以便只利于最終導(dǎo)致所需氨基酸合成的那些代謝反應(yīng)。例如在WO02/10209、WO2006/008097和WO2005/059093中，描述了通過(guò)甲硫氨酸或賴氨酸的生物合成中相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)和/或下調(diào)，來(lái)增加例如甲硫氨酸或賴氨酸的產(chǎn)量的嘗試。例如在WO2007/113127、WO2007/101867和EP08151031.5中，描述了通過(guò)如尸胺、吡啶二羧酸或賴氨酸等精細(xì)化學(xué)藥品生物前體的生物合成中相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)和/或下調(diào)，來(lái)增加所述化合物的產(chǎn)量的嘗試。異檸檬酸脫氫酶(ICD，有時(shí)也稱IDH,EC1.1.1.42，SEQIDNO3)是參與如谷氨酸棒桿菌的檸檬酸循環(huán)(TCA)的酶。它催化循環(huán)中的第三步異檸檬酸的氧化脫羧，產(chǎn)生α酮戊二酸和CO2。Eikmanns等人鑒定、克隆并表征了谷氨酸棒桿菌中編碼I⑶的基因(Eikmarms，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177:774-782)。通過(guò)在谷氨酸棒桿菌中敲除來(lái)使編碼I⑶的染色體icd基因失活，會(huì)導(dǎo)致谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷(Eikmarms，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177:774-782)。谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌中的I⑶過(guò)度表達(dá)并不提高谷氨酸產(chǎn)量(Eikmarms，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177:774-782)。然而，在DE10210967中已有報(bào)道，大腸桿菌中ICD的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致蘇氨酸產(chǎn)量增加。在谷氨酸棒桿菌中的icd和編碼谷氨酸脫氫酶的基因進(jìn)行共表達(dá)，則報(bào)道了與之矛盾的結(jié)果=Eikmarms沒(méi)有記錄任何效果，JP63214189和JP2520895報(bào)道了谷氨酸產(chǎn)量提高。盡管考慮到已報(bào)道的增加精細(xì)化學(xué)藥品(如天冬氨酸家族氨基酸、其生化前體及其衍生物)產(chǎn)量的嘗試，仍然需要備選生產(chǎn)方法。發(fā)明目標(biāo)及概要本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供使用具有至今未知特性的如谷氨酸棒桿菌等工業(yè)上重要的微生物，來(lái)生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的備選的發(fā)酵方法，以及所述方法中使用的微生物。如從本發(fā)明后續(xù)描述中逐漸明顯所示，本發(fā)明如獨(dú)立的權(quán)利要求所述解決這些和其他目標(biāo)。從屬的權(quán)利要求涉及優(yōu)選的實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用具有降低的異檸檬酸脫氫酶活性的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法。目前未知所述酶的下調(diào)會(huì)否導(dǎo)致特定生化產(chǎn)物的產(chǎn)量提高，特別是天冬氨酸下游產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的精細(xì)化學(xué)藥品優(yōu)選通過(guò)從天冬氨酸到甲硫氨酸和/或賴氨酸的生物合成途徑的中間體來(lái)進(jìn)行合成。精細(xì)化學(xué)藥品優(yōu)選天然存在的氨基酸，例如賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或甲硫氨酸，或其含氮衍生物，例如β-賴氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷。生產(chǎn)方法中使用的細(xì)胞可以是原核生物的、低等真核生物的、分離的植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、分離的昆蟲(chóng)細(xì)胞或分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞。在本發(fā)明背景下，術(shù)語(yǔ)“微生物”用于所述種類的細(xì)胞。在本發(fā)明中表現(xiàn)出降低的ICD活性的優(yōu)選的微生物種類是ICD表達(dá)降低的棒桿菌，并特別優(yōu)選ICD表達(dá)降低的谷氨酸棒桿菌。具有降低的I⑶活性，并優(yōu)選包含導(dǎo)致在宿主細(xì)胞中I⑶所述表達(dá)降低的經(jīng)修飾的核苷酸序列的重組微生物，也是本發(fā)明的一部分。這樣的微生物可以是谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明也涉及前述重組微生物用于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的用途，特別是通過(guò)從天冬氨酸到甲硫氨酸和/或賴氨酸的生物合成途徑的中間體進(jìn)行生產(chǎn)的用途。特別地，它可用于如賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或甲硫氨酸等天然存在氨基酸的生產(chǎn)。它也可以特別用于如β-賴氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷等含氮精細(xì)化學(xué)藥品的生產(chǎn)。特別地，提供了本發(fā)明的以下實(shí)施方案生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法，其利用與相應(yīng)原始微生物相比，具有部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶(ICD)活性的微生物；與相應(yīng)原始微生物相比，具有部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶(ICD)活性的重組微生物，條件是ICD表達(dá)的降低并不是由于經(jīng)修飾的編碼ICD的核苷酸序列(icd序列)代替微生物的天然icd序列進(jìn)行表達(dá)，該表達(dá)中所述經(jīng)修飾的icd編碼序列源自未修飾的icd序列，以致未修飾核苷酸序列的至少一個(gè)密碼子在經(jīng)修飾的icd序列中被比較不頻繁使用的密碼子(依據(jù)宿主細(xì)胞密碼子使用)所替換；根據(jù)實(shí)施方案(2)用于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的微生物的用途；和從根據(jù)實(shí)施方案(1)的方法得到的精細(xì)化學(xué)藥品制備如聚合物等化學(xué)藥品和化學(xué)終產(chǎn)物的方法，其包括根據(jù)實(shí)施方案(1)的方法生產(chǎn)所述精細(xì)化學(xué)藥品，作為一個(gè)步驟。圖1從賴氨酸生物合成中分支的酶促反應(yīng)中，發(fā)酵制備β-賴氨酸、吡啶二羧酸和1，5_二氨基戊烷。所示的酶與發(fā)酵中使用的微生物通常是異源的。序列表，自由文本SEQIDNO:描述1編碼SEDIDNO:3中ICD的野生型谷氛酸棒桿菌DNA2包括/o/基因上游和下游500個(gè)核苷酸天然DNA序列的谷氨酸棒桿菌icd權(quán)利要求1.生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)藥品的方法，使用與相應(yīng)的初始微生物相比，具有部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物。2.權(quán)利要求1的方法，其中具有部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶活性的微生物是重組微生物。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中異檸檬酸脫氫酶活性降低是由于異檸檬酸脫氫酶表達(dá)的部分或完全降低。4.權(quán)利要求3的方法，其中異檸檬酸脫氫酶活性的部分或完全降低是由于作為異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的起始密碼子的ATG被取代，優(yōu)選的用GTG取代ATG。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的方法，其中微生物是谷氨酸棒桿菌，優(yōu)選的谷氨酸棒桿菌ATCClSOSZjTCClSOSZlysC"或ATCC13^6，或任一上述菌株的衍生物，優(yōu)選LUl1424。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中微生物是LU11424，它的部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶活性是由于作為異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的起始密碼子的ATG被取代，優(yōu)選的用GTG取代ATG。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其中作為中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物生產(chǎn)的是選自天冬氨酸家族的氨基酸及其生物化學(xué)前體的化合物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述化合物是中間產(chǎn)物，然后酶促或非酶促轉(zhuǎn)化為有機(jī)胺、有機(jī)酸或氨基酸。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述中間產(chǎn)物是賴氨酸、或其在天冬氨酸下游的生物化學(xué)前體之一，其中終產(chǎn)物優(yōu)選的是所述中間產(chǎn)物的非天然衍生物。10.權(quán)利要求7-9的任一項(xiàng)的方法，其中微生物包括至少一種異源的酶，所述酶催化在中間產(chǎn)物向終產(chǎn)物的后續(xù)轉(zhuǎn)化中的反應(yīng)步驟。11.權(quán)利要求10的方法，其中異源的酶選自催化精細(xì)化學(xué)藥品生物合成中一步或多步的酶，優(yōu)選的是從賴氨酸或其天冬氨酸下游的生物化學(xué)前體合成的精細(xì)化學(xué)藥品。12.權(quán)利要求11的方法，其中異源的酶選自賴氨酸脫羧酶、賴氨酸-2，3-氨基變位酶和吡啶二羧酸合成酶。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)的方法，其中所述精細(xì)化學(xué)藥品選自(i)天冬氨酸家族的氨基酸；()其在天冬氨酸下游的生物化學(xué)通路中的生物化學(xué)前體；(iii)所述氨基酸(i)和前體(ii)的衍生物。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述精細(xì)化學(xué)藥品選自賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、二氨基戊烷、β-賴氨酸和吡啶二羧酸。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14的任一項(xiàng)的方法，附加條件是當(dāng)精細(xì)化學(xué)藥品選自賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸時(shí)，異檸檬酸脫氫酶表達(dá)的降低不是由于修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的表達(dá)取代了微生物的天然的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列，其中，所述修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列源自未修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列，使得根據(jù)微生物的密碼子使用，在修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列中，未修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的至少一個(gè)密碼子被較不頻繁使用的密碼子取代。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中精細(xì)化學(xué)藥品是選自1，5-二氨基戊烷、β-賴氨酸和吡啶二羧酸的化合物。17.權(quán)利要求16的方法，其中生產(chǎn)1，5_二氨基戊烷。18.權(quán)利要求17的方法，其中重組微生物包括異源的賴氨酸脫羧酶。19.權(quán)利要求17或18的方法，其中重組微生物中的二氨基乙酰轉(zhuǎn)移酶下調(diào)或者失活。20.權(quán)利要求16的方法，其中生產(chǎn)β-賴氨酸。21.權(quán)利要求20的方法，其中重組微生物包括異源的賴氨酸_2，3-氨基變位酶。22.權(quán)利要求16的方法，其中生產(chǎn)吡啶二羧酸。23.權(quán)利要求22的方法，其中重組微生物包括異源的吡啶二羧酸合成酶。24.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其中海藻糖作為中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物生產(chǎn)。25.與相應(yīng)的初始微生物相比，具有部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶活性的重組微生物，附有條件是異檸檬酸脫氫酶表達(dá)的降低不是由于修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的表達(dá)取代了微生物的天然的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列，其中，所述修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列源自未修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列，使得根據(jù)宿主細(xì)胞的密碼子使用，在修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列中，未修飾的異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的至少一個(gè)密碼子被較不頻繁使用的密碼子取代。26.權(quán)利要求25的重組微生物，其中微生物是谷氨酸棒桿菌，優(yōu)選的谷氨酸棒桿菌ATCC13032、ATCC130321ysCfto或ATCC13^6，或任一上述菌株的衍生物，優(yōu)選LUl1424。27.權(quán)利要求沈的重組微生物，其中LU11424的部分或完全降低的異檸檬酸脫氫酶活性是由于作為異檸檬酸脫氫酶編碼核苷酸序列的起始密碼子的ATG被取代，優(yōu)選的用GTG取代ATG。28.根據(jù)權(quán)利要求25-27的任一項(xiàng)的重組微生物，其還包括異源的酶，所述酶能夠?qū)⑻於彼峒易宓陌被峄蚱渖锘瘜W(xué)前體之一轉(zhuǎn)化為其它精細(xì)化學(xué)藥品，優(yōu)選的能夠?qū)①嚢彼峄蚱湓谔於彼嵯掠蔚纳锘瘜W(xué)前體轉(zhuǎn)化為其它精細(xì)化學(xué)藥品。29.根據(jù)權(quán)利要求25-28的任一項(xiàng)的重組微生物，其中異源的酶選自賴氨酸脫羧酶、賴氨酸_2，3-氨基變位酶和吡啶二羧酸合成酶。30.權(quán)利要求四的重組微生物，其中異源的酶是亮氨酸脫羧酶，其中重組微生物中的二氨基乙酰轉(zhuǎn)移酶是下調(diào)的或失活的，且能夠?qū)①嚢彼徂D(zhuǎn)化為1，5-二氨基戊烷。31.根據(jù)權(quán)利要求25-30的任一項(xiàng)的重組微生物，其適合