（高清版）WST 411-2024 抗絲狀真菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 肉湯稀釋法

WSWS/T411—2024Standardsforantifungalsusceptibilitytestingoffilamentousfun—BrothdilutionmethodWS/T411—2024I 2 6 6 8 WS/T411—2024——結(jié)果解釋內(nèi)容，按CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardInstitute）折點(diǎn)和流行病學(xué)CommitteeonAntimicrobialSuscep——質(zhì)量控制部分刪除了質(zhì)控頻率和檢測(cè)頻率內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)負(fù)責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢,由國(guó)家衛(wèi)生健康委醫(yī)療管理服務(wù)指導(dǎo)中心負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查,由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)政司負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)管理、法本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京醫(yī)院/國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、首都WS/T411—20241抗絲狀真菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微量和宏量肉湯稀釋法檢測(cè)抗絲狀真菌藥物最低抑菌濃度（MinimalInhibitory本標(biāo)準(zhǔn)適用于引起深部真菌感染的產(chǎn)孢絲狀真菌的藥物敏感性試驗(yàn)，包括曲霉屬某些種（Aspergillusspp.）及種復(fù)合群、鐮刀菌屬某些種（Fusariumspp.）及種復(fù)合群、根霉屬某些種（Rhizopusspp.）和毛霉目Mucorales（接合菌綱Zygomycetes）、多育節(jié)莢孢霉（Lomentospora本標(biāo)準(zhǔn)不適用于檢測(cè)雙相真菌如皮炎芽生菌（Blastomycesdermatitidis）、莢膜組織胞漿菌（Histoplasmacapsulatu3.13.2最低有效濃度minimaleffectiveconc3.33.43.5WS/T411—202423.6菌株的MIC通?？蛇_(dá)到常規(guī)用藥時(shí)血液和組織中的藥物濃度水平，但反應(yīng)率可能低于敏感株，不能沖區(qū)，以防止微小的、不可控的技術(shù)因素導(dǎo)致較嚴(yán)重的錯(cuò)誤結(jié)果，特別是那些毒性范圍窄的藥物。3.73.8流行病學(xué)界值epidemiologicalcutoffvalue；ECV/epidemiologicalcut非野生型）。ECV定義了菌株野生型生物群藥物敏感性的上限3.93.10通過ECV值定義的解釋分類，ECV將分離菌株歸類為對(duì)某種檢測(cè)的抗真菌藥物具有推測(cè)的/已知獲得3.113.123.134抗真菌藥物的配制WS/T411—20243m——藥物的重量，單位為毫克（mg4.3藥物儲(chǔ)存液（母液）4.3.1藥物稱量藥物稱量按照配制儲(chǔ)存液的濃度計(jì)算，配制儲(chǔ)存液濃度至少按檢測(cè)范圍最高濃度的100倍配制儲(chǔ)存液。但有些溶解度低的藥物應(yīng)配制較低濃度的儲(chǔ)存液。稱量4.3.2溶劑4.3.3過濾儲(chǔ)存液通常是無菌的，當(dāng)有特殊要求時(shí)應(yīng)進(jìn)4.3.4存儲(chǔ)儲(chǔ)存液應(yīng)在無菌塑料管中分裝，密封保存于-70℃（或-20℃~-70℃)。從冰箱中取出的當(dāng)天使用，現(xiàn)用現(xiàn)取，未用完的應(yīng)丟棄。大多數(shù)藥物儲(chǔ)存液在-70℃可保4,4藥物稀釋液4.4.1藥物稀釋液濃度范圍表1抗真菌藥物儲(chǔ)存液使用的溶劑、稀釋液種類及藥物WS/T411—20244c培養(yǎng)基指RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基，如使用商品化RPMI-1640肉湯干粉配制,步驟見表A4.4.2水溶性藥物稀釋液表2水溶性抗絲狀真菌藥物敏感試驗(yàn)稀釋步驟（小樣本b2345864728519WS/T411—20245表2水溶性抗絲狀真菌藥物敏感試驗(yàn)稀釋步驟（小樣本量皮膚真菌續(xù)）4.4.3非水溶性藥物稀釋液對(duì)于非水溶性藥物需要先用合適的溶劑配制成終濃度100倍的儲(chǔ)存液，然后再用肉湯1:50稀釋，針對(duì)非皮膚來源真菌標(biāo)本的藥物稀釋步驟見表3，針對(duì)皮膚來源真菌標(biāo)本的藥物稀釋步驟見表3非水溶性抗絲狀真菌藥物敏感試驗(yàn)稀釋步驟（1––238452617891––bWS/T411—2024634586472819推薦使用RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基（配制方法見表A.1），若無商品化RPMI-164微量肉湯稀釋法推薦使用葡萄糖含量為2％的RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基，配方WS/T411—20247再轉(zhuǎn)入25℃~28℃培養(yǎng)至7d，一些在PDA上不能產(chǎn)孢或產(chǎn)孢不良的絲狀真菌，可以更換更好的適宜產(chǎn)在1mL0.85％無菌鹽水含終濃度為0.1v/v）的吐溫20中加入絲狀真菌菌落混勻，若有沉淀物應(yīng)靜置3min～5min。將上清轉(zhuǎn)移至無菌試管中，密封后混勻15采用比濁法測(cè)定菌懸液濃度，在530nm然后用肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行1:50稀釋，如果檢測(cè)菌株為申克孢子絲菌，則1:2倍稀釋。將接種物稀釋至0.8×104CFU/mL（菌落形成單位/mL10×104CFU/mL（終濃度的2倍）。最后將0.1mL大多數(shù)皮膚真菌在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。但紅色毛癬菌需使用燕麥瓊脂（落形成單位（CFU/mL）。28℃~30℃培養(yǎng)并每日觀察計(jì)數(shù)。培養(yǎng)時(shí)間從少于24h（根霉屬）到5d（多將0.01mL菌懸液接種在沙保羅培養(yǎng)基（SDA）上，計(jì)數(shù)菌落形成單位（CFU/mL）。28℃~30℃培檢測(cè)當(dāng)日，將0.1mL2倍終濃度的菌懸液加入微對(duì)照管中加入0.1mL2倍終濃度的菌懸液和0.1mL肉湯培養(yǎng)根霉屬和毛霉目培養(yǎng)時(shí)間為21h～26h，曲霉屬及種復(fù)合群、鐮刀菌屬及種復(fù)合群、申克孢子絲菌復(fù)合群、斑替枝孢瓶霉、皮炎外瓶霉、淡紫紫單孢菌、宛氏擬青霉培養(yǎng)時(shí)間為46h～50WS/T411—202486.2宏量肉湯稀釋法操作步驟按照本標(biāo)準(zhǔn)第4.2條和第4.3條配制藥物儲(chǔ)存液。然后用RPMI-1640肉湯將儲(chǔ)存液1:10稀釋，得到10將0.1mL10倍終濃度的藥物稀釋液分裝在無菌試管中，然后加入0.9mL菌懸液，35℃培養(yǎng)。宏量和微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株的結(jié)果范圍參考見表B氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑生長(zhǎng)終點(diǎn)定義不如兩性霉素B嚴(yán)格，與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比，非皮膚真菌生長(zhǎng)抑制50％以上、皮膚真菌生長(zhǎng)抑制80％以上判斷7.1.4伊曲康唑、泊沙康唑、艾莎康對(duì)于非皮膚真菌，伊曲康唑、泊沙康唑、艾莎康唑和伏立康唑終點(diǎn)定義為100％抑制生長(zhǎng)。曲霉屬當(dāng)檢測(cè)皮膚真菌對(duì)伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑的MIC時(shí)，終點(diǎn)定義為抑制80％以上雖然對(duì)棘白菌素類藥物如阿尼芬凈、卡泊芬凈和米卡芬凈生長(zhǎng)終點(diǎn)定義不如兩性霉素應(yīng)用MEC生長(zhǎng)終點(diǎn)的概念，提高了試驗(yàn)的可重復(fù)性。通過與生長(zhǎng)對(duì)照孔的渾濁生長(zhǎng)比較，微孔液面的菌7.2結(jié)果解釋W(xué)S/T411—20249絲狀真菌的臨床折點(diǎn)尚未建立，但已定義一些曲霉屬及種復(fù)合群對(duì)兩性霉素B、卡唑、艾沙康唑、泊沙康唑、伏立康唑的ECV值，這些ECV可能有助于識(shí)別非野生型（NWT）無折點(diǎn)的絲狀真菌ECVs見表D.1，有折點(diǎn)的絲狀真菌EC），7.2.6伊曲康唑、泊沙康唑、艾莎康霉和淡紫紫孢霉及一些暗色霉菌（如離蠕孢屬和鏈格孢屬）對(duì)泊沙康唑和伏立康唑的的MICs通常低于4），WS/T411—2024EUCAST微量肉湯稀釋法（附錄E）與本標(biāo)準(zhǔn)（參考CLSI）肉湯稀釋法步驟基本一致，接種量等條件方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。EUCAST折點(diǎn)/ECOFF普遍稍低于CLSI的EUCAST微量肉湯稀釋法24h質(zhì)控菌株MIC范圍見表E.1；絲狀真菌體外微量肉湯稀7.3結(jié)果報(bào)告（1）有MIC判斷折點(diǎn)，如：伏立康唑?qū)熐菇Y(jié)果報(bào)告MIC值（2）無MIC判斷折點(diǎn)但有ECV值，見表D.1，報(bào)告MIC值；如果MIC值低于ECV值報(bào)告為野生型，推測(cè)的/已知獲得性耐藥機(jī)制或敏感性降低；并明確ECV不是折點(diǎn)，不能預(yù)測(cè)臨床（2）無MIC判斷折點(diǎn)但有ECOFF值，見表E.3如毛癬菌，報(bào)告MIC值；如果MIC值低于ECOFF8.2培養(yǎng)基和材料的質(zhì)控當(dāng)使用新批次的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿或RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基以及微量稀釋96孔板用表B中列出標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)MIC是否在控。應(yīng)至少培養(yǎng)1支未接種菌懸液稀釋管，檢測(cè)是8.3純度質(zhì)控8.4終點(diǎn)判讀質(zhì)控試驗(yàn)人員應(yīng)在相同條件下獨(dú)立判讀結(jié)果，并與操作熟練人員的結(jié)果WS/T411—20248.5標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存使用也可在沙保羅培養(yǎng)基培養(yǎng)后2℃~8℃保存，但不應(yīng)保存超過3代。挑選4個(gè)～5個(gè)菌落進(jìn)行藥敏檢測(cè)，并在胰酶大豆消化瓊脂斜面上傳代，培養(yǎng)后放置在2℃~8℃儲(chǔ)存。瓊脂斜面保存的日常質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)每隔兩周從長(zhǎng)期保存的菌株復(fù)蘇、更換一次。WS/T411—2024RPMI-1640干粉肉湯培養(yǎng)基（1L）配制過程見表A.1，RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基配方見表A.萄糖改良RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基配方見表A.3，12345aMOPS表示3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(3-N-morpholinopropanesulfonicaMOPS123121℃高壓滅菌20min。分裝，儲(chǔ)存在4℃~6℃?zhèn)溆?質(zhì)控：陽性：紅色毛癬菌形成分生孢子；陰性：不要求，培養(yǎng)基嚴(yán)格用于真菌培養(yǎng)a.JessupCJ,WarnerJ,IshamN,WS/T411—2024絲狀真菌肉湯稀釋法質(zhì)控菌株和參考菌株MIC或MEC范圍見表BMIC范圍范圍%（Hamigerainsecticola）ATCCMYA-3630N/AManogepixATCCMYA-3626N/AATCCMYA-3627>16ATCCMYA-3631ATCCMYA-3633N/AMIC范圍范圍%ATCCMYA-3629>16>16>8N/A>8N/AMYA-3635MYA-3634ATCCMYA-4439ATCCMYA-4438注2：MIC范圍是在規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)讀取的，宏量肉湯稀釋法有時(shí)為48h，微量肉湯稀釋法b黃曲霉ATCC204304的MIC范圍并非來自本標(biāo)準(zhǔn)推薦的試驗(yàn)方法，但這是目前僅有的此株絲狀真菌對(duì)里氟康唑c生長(zhǎng)對(duì)照孔應(yīng)培養(yǎng)96h或直至生長(zhǎng)良好（孔底部呈WS/T411—2024煙曲霉體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)見表C表C.1煙曲霉體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)(μg/mL）MIC折點(diǎn)和判讀SIR1表D.1無折點(diǎn)絲狀真菌的ECV值(μg/mL）422421141114221222表D.1無折點(diǎn)絲狀真菌的ECV值(μg/mL續(xù)）b測(cè)定曲霉屬的ECV，三唑類和兩性霉素B培養(yǎng)48h，卡泊芬凈培養(yǎng)24h[1]。ECV之前必須針對(duì)肉湯微量稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證，正如在使用肉湯微量稀釋法建立折點(diǎn)之前必須表D.2有折點(diǎn)絲狀真菌的ECV值(μg/mL）ECVa.b.c1b培養(yǎng)48小時(shí)后測(cè)定曲霉菌的ECV，以ECV之前必須針對(duì)肉湯微量稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證，正如在使用肉湯微量稀釋法建立折點(diǎn)之前必須WS/T411—2024MIC值范圍(μg/mL）11注：Version5.0,2020,http://wwWS/T411—2024MIC折點(diǎn)和判讀SIRATU–>1––>1–#>22#>22–>0.25––>1––>12–>12–>12–>12#>0.25–>0.25–>12–>12注1：Version2.0,2020,；注2：S-標(biāo)準(zhǔn)給藥劑量敏感：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)注4：#表示沒有“I”類別，在S和R之間的MIC僅代表ATU，該MIC既對(duì)應(yīng)野生型菌株，也對(duì)應(yīng)非野生型菌株(MIC為1個(gè)WS/T411—2024注1：Version2.0,2020,；WS/T411—2024SusceptibilityTestingofFilamentousFungi.3rdEdition,TestingofFilamentousFungi.2ndEdSusceptibilityTesting.3rdEdition,M5