微生物學(xué)新技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用

關(guān)于微生物學(xué)新技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用

固定化微生物，用制備固定化酶的方法將微生物固定在載體上，即成固定化微生物。固定化細(xì)胞比游離細(xì)胞穩(wěn)定性高，催化效率比離體酶高，且比固定化酶操作簡便，能完成多步酶反應(yīng)。第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

二、酶的分離提純利用微生物生產(chǎn)酶制品可以分為菌種選育、發(fā)酵培養(yǎng)、分離提取和酶制品保存四個步驟。

1純化：●鹽析法，絕大多數(shù)情況采用（NH4）2SO4?！裼袡C(jī)溶劑沉淀法，乙醇或丙酮

●層析法，吸附層析法、離子交換層析法、分子篩過濾層析法、等電點(diǎn)沉淀法第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

三、固定化方法

固定化方法有載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法和逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)。第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1、載體結(jié)合法將酶固定在非水溶性載體上。載體有葡聚糖、活性碳、膠原、瓊脂糖、多孔玻璃珠、高嶺土、硅膠、氧化鋁、羧甲基纖維素等。

2、交聯(lián)法

利用雙功能試劑或多功能試劑使酶與酶發(fā)生交聯(lián)而進(jìn)行固定。交聯(lián)劑有：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺和六甲撐二異氰酸酯。第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

3、包埋法

將酶包埋在凝膠格子（格子型）中，或由半透性的聚合物膜組成的膠囊內(nèi)（微膠囊型）的方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺（PACAM）凝膠、聚乙烯醇（PVA）、瓊脂、硅膠等。微膠囊型的包埋材料：尼龍、乙基纖維素和硝酸纖維素

第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

4、逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)

表面活性劑的兩性分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成聚集體，其親水一端連接成逆膠束的極性核，水分子插于核中，其疏水性的一端進(jìn)入主體有機(jī)溶劑中，酶分子溶于逆膠束中，組成逆膠束酶系統(tǒng)。對微生物細(xì)胞的固定化最適合用凝膠包埋法。第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天四、固定化酶和固定化微生物在環(huán)境工程中的應(yīng)用

英國采用固定化細(xì)胞反應(yīng)設(shè)備處理含氰廢水。中國應(yīng)用固定化細(xì)胞技術(shù)降解含直鏈烷基苯磺酸鈉（LAS）廢水，去除率和酶活性保存率均在90%以上。德國將9種降解對硫磷農(nóng)藥的酶共價固定在多孔玻璃珠、硅膠珠上，制成酶柱處理對硫磷廢水，獲得95%以上的去除效果。第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)微生物絮凝劑

傳統(tǒng)的絮凝劑有無機(jī)和有機(jī)高分子兩類，第三類為微生物絮凝劑。加量為200mg/L

一、微生物絮凝劑的特點(diǎn)

1、來源廣泛，生產(chǎn)周期短且效率高。

2、具很高的絮凝效果，與聚鐵、聚丙烯酰胺等絮凝劑比，絮凝速度大，沉淀易過濾。

3、對人體和動物無危害。

4、具可生化性，可防止絮凝后對環(huán)境造成的二次污染。

5、能廣泛應(yīng)用于各種污水的處理。第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

二、微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)組成、化學(xué)本質(zhì)

1、微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)組成具有絮凝性的微生物涉及各類微生物，有細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌，原生動物等（表11-1）。微生物絮凝劑的組成和結(jié)構(gòu)見表11-2。

第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

2、微生物絮凝劑的化學(xué)本質(zhì)微生物所產(chǎn)生的絮凝劑主要是微生物代謝過程中所產(chǎn)生的多聚糖類，有些是蛋白質(zhì)（或多肽），或者是含有蛋白質(zhì)（或多肽）。第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天三、微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理

“橋聯(lián)作用”機(jī)理：絮凝劑大分子借助離子鍵、氫鍵和范德華力，同時吸附多個膠體顆粒，在顆粒之間產(chǎn)生“架橋”，從而形成一種網(wǎng)狀的三維結(jié)構(gòu)而沉淀下來。絮凝劑的分子結(jié)構(gòu)、形狀、相對分子質(zhì)量和所帶基團(tuán)會影響其絮凝效果。第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

四、微生物絮凝劑的合成和應(yīng)用

1、微生物絮凝劑的合成一般認(rèn)為，微生物多在其生長的中后期釋放絮凝劑形成絮體，但到了靜止期后期，細(xì)胞不再產(chǎn)生新的絮凝物質(zhì)，甚至?xí)捎诔霈F(xiàn)解絮凝酶而導(dǎo)致絮凝活性下降。培養(yǎng)基的組成、初始pH、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等會影響絮凝劑的合成。提取方法：凝膠色譜，有機(jī)溶劑提取和堿提取。第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2、微生物絮凝劑的應(yīng)用(1)高濃度有機(jī)水廢水的處理

NOC-1生物絮凝劑加Ca2+處理畜業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水；C-62菌株產(chǎn)生的絮凝劑處理？革廢水。（2）染料廢水的脫色用于造紙黑液、糖蜜廢水、墨水廢水的脫色。第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天(3)乳化液油水分離用廣泛產(chǎn)堿菌（Alcaligenenslatus

）培養(yǎng)物易將棕櫚酸從其乳化液中分離出來。（4）活性污泥的處理從紅平紅球菌（Rhodococcuserythropolis

）分離得到的絮凝劑可促進(jìn)污泥的沉降。第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)分子生物技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用

一、核酸探針和PCR技術(shù)

1、核酸探針在適當(dāng)條件下，單鏈DNA片段能與另一段與之互補(bǔ)的單鏈片段結(jié)合，這個過程稱為核酸雜交。利用這一特性，將最初的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，即可做成核酸探針。

利用核酸探針技術(shù)可以檢測環(huán)境中是否存在某些特定種類的微生物，如致病菌和病毒。第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2、PCR技術(shù)

PCR(Polymerasechainreaction)稱為DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是對特異性DNA片段在體外進(jìn)行擴(kuò)增的一種非?？焖俣啽愕姆椒?。（1）PCR的原理：第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

（2）PCR技術(shù)的操作方法：①加熱變性將待擴(kuò)增的DNA置于94~95℃的高溫中加熱5min，使雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，分開的兩條單鏈DNA作為擴(kuò)增的模板。②退火將加熱變性的單鏈DNA溶液的溫度緩慢下降至55℃后，在這過程中引物的DNA的堿基將與單鏈模板DNA一端堿基配對。

第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

③延伸退火之后，當(dāng)溫度上升至72℃時，在耐熱性TaqDNA多聚酶、適當(dāng)?shù)腜H和一定的離子強(qiáng)度下，寡核苷酸引物（引物DNA）堿基延伸和模板DNA結(jié)合構(gòu)成雙鏈DNA。經(jīng)過25～30次循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106，可將2kb的DNA由原來的1pg擴(kuò)增到0.5～1μg。第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（3）PCR技術(shù)的應(yīng)用①應(yīng)用PCR技術(shù)研究特定環(huán)境中微生物區(qū)系的組成、結(jié)構(gòu)，分析種群動態(tài)。②應(yīng)用PCR技術(shù)監(jiān)測環(huán)境中特定的微生物。③量化環(huán)境系統(tǒng)中微生物群體的各組成成員。

第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

二、16SrDNA序列及其同源性的分析

通過對16SrRNA基因的DNA序列分析，可以分析細(xì)菌的種類信息，并且已經(jīng)逐漸成為微生物分類和鑒定中非常重要而且有用的指標(biāo)和手段。第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

16srRNA基因技術(shù)在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

①鑒定生物降解菌；②研究某一特定環(huán)境中微生物的區(qū)系組成，進(jìn)而了解其種群動態(tài)，研究微生物的多樣性。

PCR-DGGE或PCR-TGGE分析微生物的多樣性第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天變性梯度凝膠電泳DGGE1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于檢測DNA片段中的點(diǎn)突變的一種電泳技術(shù)。

Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。后來又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天原理雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。一個特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。一個幾百個堿基對的DNA片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天顯示的是一個234bp長的DNA片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DNA片段的序列，依次從第一個堿基到第234個堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA片段共有3個解鏈區(qū)域。MD1是解鏈溫度最低的一個解鏈區(qū)域，MD3是溫度最高的一個解鏈區(qū)域。第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天不同的雙鏈DNA片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。一旦DNA片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，不同的DNA片段會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天然而，當(dāng)變性劑濃度達(dá)到DNA片段最高的解鏈區(qū)域溫度時，DNA片段會完全解鏈，此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個堿基對）可以解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段解鏈溫度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC夾子后，DNA片段中每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)用DGGE/TGGE技術(shù)來研究微生物群落結(jié)構(gòu)時，要結(jié)合PCR（polymerasechainreaction）擴(kuò)增技術(shù)，用PCR擴(kuò)增的16SrDNA產(chǎn)物來反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。通常根據(jù)16SrRNA基因中比較保守的堿基序列設(shè)計(jì)通用引物，其中一個引物的5’-端含有一段GC夾子，用來擴(kuò)增微生物群落基因組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500bp以下的DNA片斷，所以一般選擇擴(kuò)增16SrRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天16SrDNA的高可變區(qū)E.coli16SrRNA二級結(jié)構(gòu)及各可變區(qū)

V3區(qū)約170bpV6-V8區(qū)約350bp

片段大小不同，攜帶的信息量不同，選擇不同的區(qū)域得到DGGE圖譜不同，群落信息也有差異不同的片段大小對應(yīng)的膠濃度也不同根據(jù)需要選擇最合適的提取基因組后，擴(kuò)增16SrDNA高可變區(qū)片段第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天確定合適的變性劑范圍對DNA片段進(jìn)行有效分離根據(jù)變性劑梯度方向與電泳方向相同或不同,DGGE分為：垂直DGGE平行DGGE第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)的DGGE電泳技術(shù)對于長度超過500bp的DNA片段的序列變化情況,只能有50%的檢出率。

應(yīng)用“GC夾板”技術(shù)可使檢出率提高到100%。

當(dāng)?shù)乳L的雙鏈DNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時,因其解鏈的速度和程度與其序列密切相關(guān);部分解鏈的DNA分子的遷移速度隨解鏈程度增大而減小。GC-Clamp16SrDNA低濃度高濃度第37頁,共44頁，2024年2月25日，星期天DGGE的參數(shù)：

膠濃度

取決于片段大小，通常不宜超過500bp6%膠濃度：400～1000bp8%膠濃度：200～400bp10%膠濃度