菌種選育理論與技術(shù)

關(guān)于菌種選育理論與技術(shù)菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)理論基礎(chǔ)：微生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等。目的第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天簡化生產(chǎn)工藝條件，縮短生產(chǎn)周期菌種選育的目的研究抗生素生物合成調(diào)控的機(jī)制科研生產(chǎn)分析抗生素生物合成途徑獲得帶遺傳標(biāo)記的菌株了解菌種遺傳背景改變產(chǎn)品組分、改進(jìn)質(zhì)量條件抵抗不良培養(yǎng)條件適應(yīng)新的原材料提高產(chǎn)量提供分子遺傳學(xué)研究材料產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天青霉素生產(chǎn)菌種的選育目前工業(yè)發(fā)酵水平經(jīng)誘變85000U／mlWisQ176，900U／ml產(chǎn)黃青霉，20U／ml點青霉，2U／ml1943年，發(fā)霉的甜瓜1928年，F(xiàn)leming第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天菌種選育的基本方法根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育。用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)要求進(jìn)行篩選來獲得新的變種或雜種。

包括誘變育種，雜交育種，原生質(zhì)體育種，基因工程育種等。第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

自然選育自然選育（naturalscreening）是指利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離、篩選排除衰退型菌株，從中選出維持或高于原有生產(chǎn)菌株的過程，以達(dá)到穩(wěn)定或提高生產(chǎn)的目的。自然選育的目的淘汰衰退菌種，保存優(yōu)良菌株，純化菌種，防止菌種衰退，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高發(fā)酵產(chǎn)量。第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天一、菌種衰退的原因菌種遺傳特性的改變經(jīng)誘變劑處理后的退化變異

菌種生理狀況的改變

（培養(yǎng)條件）導(dǎo)致衰退可能的原因：沙土管長期保藏、連續(xù)傳代、新陳代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)、多因素低劑量誘變效應(yīng)、互變異構(gòu)現(xiàn)象等。第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天二、自然選育的一般過程第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1、單孢子懸浮液的制備

定量稀釋后制成50～200個單細(xì)胞／ml的菌懸液。2、分離及單菌落培養(yǎng)

根據(jù)計數(shù)結(jié)果，按絲狀真菌、放線菌菌落大小不同，分離量以5～20個菌落／平皿為宜。3、篩選

將分離培養(yǎng)后的各型單菌落，接斜面培養(yǎng)，成熟后接入發(fā)酵瓶，測定發(fā)酵單位的過程稱為篩選。它分初篩、復(fù)篩兩個過程。

第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點

簡單易行缺點

效率低，進(jìn)展慢，難以獲得高產(chǎn)突變株

以微生物的自然變異為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種幾率并不是很高，一個基因的自然突變頻率僅10－6～10－10目的

純化、復(fù)壯菌種第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

誘變育種誘變育種（mutationbreeding）是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群體，促進(jìn)其突變率大幅提高，然后采用簡便、高效的篩選方法，從中選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的突變菌株。優(yōu)點：速度快，收效大，方法簡便。缺點：誘發(fā)突變?nèi)狈Χㄏ蛐裕ぷ髁看?。誘變育種工作主要包括出發(fā)菌株的選擇、誘變處理和篩選突變株三個部分。第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天出發(fā)菌株（沙土管或冷凍管）誘變育種的一般步驟第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天一、誘變劑的種類物理誘變劑：主要包括物理輻射中的各種射線

化學(xué)誘變劑：與DNA發(fā)生作用、改變其結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。生物誘變劑：一些能引起DNA結(jié)構(gòu)改變，從而造成突變效應(yīng)的生物體或生物分子。

第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天超凈工作臺小型X射線衍射儀Co60射線機(jī)第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天二、誘變育種的過程前突變：誘變劑所造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變。

突變：由于染色體或基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。表型延遲：表型改變落后于基因型改變的現(xiàn)象。

第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（一）誘變劑接觸DNA分子前1、細(xì)胞對誘變劑的透性將影響誘變效果。2、細(xì)胞質(zhì)的某些組分和某些酶可和誘變劑相互作用而影響誘變效果。3、與基因所處的狀態(tài)有關(guān)，而基因的狀態(tài)又和培養(yǎng)條件有關(guān)。

第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（二）DNA損傷修復(fù)光修復(fù)作用（光復(fù)活作用）切補(bǔ)修復(fù)

四種酶的作用：核酸內(nèi)切酶

、核酸外

切酶

、DNA多聚酶

、DNA連接酶重組修復(fù)SOS修復(fù)系統(tǒng)DNA聚合酶的矯正作用第17頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（三）前突變到突變的過程校正差錯：光復(fù)活作用、切補(bǔ)修復(fù)和DNA多聚酶校正作用

引起差錯：重組修復(fù)和SOS修復(fù)系統(tǒng)

一切影響這些修復(fù)系統(tǒng)中的酶活性的因素都能影響由前突變向突變轉(zhuǎn)變這一過程

。誘變前后的處理可影響誘變的效果

：1、通過影響與DNA修復(fù)作用有關(guān)的酶的活性而影響誘變的效果；2、通過使誘變的目的基因處于活化狀態(tài)(復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài))，使之更容易被誘變劑所作用，從而影響目的基因的突變率。

第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(四)從突變到突變型1、分離性遲延

是經(jīng)誘變處理后，細(xì)胞中的基因處于不純的狀態(tài)(野生型基因和突變型基因并存于同一細(xì)胞中)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時得不到表達(dá)，需經(jīng)過復(fù)制、分離，在細(xì)胞中處于純的狀態(tài)(一細(xì)胞中只有突變型基因，沒有野生型基因)時，其性狀才得以表達(dá)。2、生理性遲延

突變基因由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時，還不一定出現(xiàn)突變表型，新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來。

第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天三、誘變育種的步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)突變株的分離和篩選第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天四、突變株的篩選(一)隨機(jī)篩選(二)理性化篩選（定向篩選）

運用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進(jìn)行設(shè)計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1、初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選普遍存在著反饋抑制和反饋阻遏，要打破反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可從兩個方面著手：

(1)

篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株例如，谷氨酸發(fā)酵選育的高產(chǎn)菌株為谷氨酸棒桿菌的生物素營養(yǎng)缺陷型。第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（2）篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

營養(yǎng)缺陷型:誘變產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)的能力，須在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。

野生型:與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。

滲漏缺陷型:是遺傳性障礙不完全的營養(yǎng)缺陷型，突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，能少量地合成某一代謝產(chǎn)物。第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天(2)篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2、次級代謝產(chǎn)物(主要是抗生素)高產(chǎn)菌株的篩選利用營養(yǎng)缺陷型篩選

篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株

篩選二價金屬離子抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1、抗性篩選抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10–6頻率的突變體存在，就容易篩選出來抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段（三）理性化篩選的方法第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（1）一次性篩選法一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株抗噬菌體菌株篩選耐高溫菌株篩選耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環(huán)境下一次性篩選獲得第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（2）階梯性篩選法無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的藥物藥物的抗性變異也是逐步發(fā)展的，時間上是漸進(jìn)的梯度平板法紙片擴(kuò)散法第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天吡哆醇與代謝拮抗物異煙肼的分子結(jié)構(gòu)梯度平板法也常用于抗代謝拮抗物突變株的篩選，以提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。如：吡哆醇高產(chǎn)菌株篩選第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

梯度平板法(Gradientplate)第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

紙片擴(kuò)散法與梯度平板法的原理類似，用打孔器將較厚的濾紙打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌。紙片擴(kuò)散法第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天階梯性篩選法的缺點

階梯性篩選法只有在抑制區(qū)域才能挑選抗性菌，而低濃度區(qū)域面積較大，優(yōu)良的抗性突變株若被分散在低濃度區(qū)域或遠(yuǎn)離紙片的區(qū)域，則可能沒有被檢出，因此，漏檢的幾率較大。

第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2、營養(yǎng)缺陷型突變株篩選與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）：能滿足某一菌種的野生型或原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基②補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）：在基本培養(yǎng)基中有針對性地補(bǔ)加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要（其他營養(yǎng)缺陷型仍不能生長）的培養(yǎng)基③完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）：可滿足該菌各種營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法1)淘汰野生型抗生素法：將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型處于活化階段，而缺陷型處于休眠狀態(tài)且在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而保留在處理液中第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2)檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長具體方法：影印法、點種法、夾層法第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天也稱任意法用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況此法結(jié)果明確，但工作量大點種法第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易夾層法第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3)營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定方法二以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子在5～6個平皿上可測20株菌以上。第42頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

雜交育種雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合(或接合)使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。雜交育種的目的在于：（1）通過雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，從而改變原有菌株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株(重組體)；（2）可以通過雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通過雜交，可以擴(kuò)大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；（4）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進(jìn)遺