《DB32T 3762.12-2021新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范 第12部分藥物體外抗病毒效果測定》

ICS11.020

C62

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T3762.12—2021

新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范

第12部分：藥物體外抗病毒效果測定

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part12:Invitrodeterminationofantiviraleffectofdrugs

2021-11-04發(fā)布2021-12-04實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.12-2021

新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第12部分：藥物體外抗病毒效果測定

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒藥物體外抗病毒效果測定環(huán)境與設施、設備與耗材、試劑與材料、技術

要求、操作步驟和清場與消毒。

本文件適用于新型冠狀病毒藥物體外抗病毒效果測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本

文件。

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序

新型冠狀病毒實驗室生物安全指南中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

醫(yī)療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

細胞病變效應cytopathiceffect，CPE

病毒在宿主細胞內(nèi)大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。大多數(shù)病毒感染敏感細胞培養(yǎng)都能引

起其顯微鏡下表現(xiàn)的改變，如細胞聚集成團腫大圓縮脫落及細胞融合成為多核細胞，細胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，

乃至細胞裂解等。

3.2

感染復數(shù)multiplicityofinfection，MOI

感染時病毒和細胞數(shù)量的比值。

3.3

半最大效應濃度half-maximaleffectiveconcentration，EC50

能引起50%最大效應的藥物濃度。

3.4

半數(shù)細胞毒性濃度Half-cytotoxicconcentration，CC50

對半數(shù)細胞產(chǎn)生毒性作用的藥物濃度。

3.5

1

DB32/T3762.12-2021

最大無毒濃度maximalatoxicconcentration，TC0

不引起細胞毒性的最大藥物濃度

3.6

選擇指數(shù)selectivityindex，SI

為判斷藥物效果的安全范圍，SI=CC50/EC50，選擇指數(shù)越大，藥物的安全范圍越大。

4環(huán)境與設施

4.1實驗室資質(zhì)及級別要求

應符合《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》的要求，病毒培養(yǎng)包括病毒的分離、培養(yǎng)、滴定等

實驗操作應當在生物安全三級實驗室（BSL-3）的生物安全柜內(nèi)進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解

劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比

照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關活動前，應當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，

取得開展相應活動的資質(zhì)。病毒核酸熒光PCR檢測程序可參照DB32/T3762.3進行。

4.2操作人員資質(zhì)及防護要求

實驗操作人員應經(jīng)過生物安全培訓，操作活病毒人員應取得BSL-3實驗室進入資質(zhì)和相關實驗活動

上崗證。操作人員在健康狀態(tài)良好的情況下經(jīng)實驗室主任批準后方可開展活動，應根據(jù)《新型冠狀病

毒實驗室生物安全指南》要求，按照BSL-3個人防護的要求進行防護。

5設備與耗材

5.1設備

生物安全柜、倒置顯微鏡、渦旋振蕩器、水浴或金屬浴、冰箱、CO2培養(yǎng)箱、離心機、核酸提取儀、

熒光定量PCR儀、微量移液器等。

5.2耗材

N95及以上防護口罩、醫(yī)用無紡布帽、護目鏡、醫(yī)用防護服、一次性PE手套、一次性手術衣、乳膠

手套、防水靴套、帶濾芯Tip頭、一次性平皿、EP管、96孔細胞培養(yǎng)板、96孔PCR反應板等。

6試劑與材料

6.1試劑

6.1.1Hanks溶液（每毫升含青霉素、鏈霉素各2000單位）

6.1.2DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。

6.1.3DMEM維持液（含2%胎牛血清）。

6.1.4消化液（0.25%胰酶和0.025%EDTA-Na2混合液）。

6.1.5核酸提取試劑盒。

6.1.6新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑盒。

2

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6.2材料

6.2.1新型冠狀病毒培養(yǎng)物。

6.2.2待檢藥物和陽性對照藥物（瑞德西韋）。

6.2.3非洲綠猴腎傳代細胞（VERO-E6）。

7技術要求

7.1病毒滴度質(zhì)控：確定實驗室質(zhì)量控制標準的新型冠狀病毒毒株滴度，應至少有三次獨立的

滴度水平測定結果。

7.2效果指標選擇：藥物體外抗病毒效果可通過觀察病毒致CPE、細胞活性染色、病毒噬斑減

少試驗、病毒抗原測定、病毒核酸測定等方法來判斷，本文件通過病毒核酸測定來評價藥物體

外抗病毒效果。

7.3毒性測定方法：藥物對細胞的毒性測定可根據(jù)藥物特點選用細胞病變觀察或細胞活性染色

（中性紅、MTT或CCK-8等染色后測OD值）的方法進行。

7.4預處理要求：如果待測藥物是中藥煎劑，必須進行無菌過濾以去處藥液沉渣，以免影響結

果觀察。

8操作步驟

8.1藥物對細胞的毒性測定

8.1.1將實驗所需細胞于96孔培養(yǎng)板中置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層，覆蓋度80%左右，棄掉

細胞培養(yǎng)液。

8.1.2待檢藥物稀釋：將待檢藥物用細胞培養(yǎng)液做倍比稀釋，使其稀釋度分別為原液（選定濃度）、

1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，1:256，1:512，每完成一個一稀釋度必須更換吸頭，每個稀釋

度溶液需要反復吹打混勻。

8.1.3分別取200μl不同稀釋倍數(shù)的待檢藥物及相同條件稀釋的藥物溶劑（如DMSO）滴加于細胞培

養(yǎng)孔中，每一稀釋度接種4孔，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

8.1.4結果觀察：顯微鏡下逐日觀察并記錄CPE結果，直至藥物對細胞的毒性不再繼續(xù)進展時判定結

果，計算待檢藥物的最大無毒濃度（TC0）和半數(shù)細胞毒性濃度（CC50）。

8.2藥物抗病毒效果測定

8.2.1將實驗所需細胞于96孔培養(yǎng)板中置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層，棄掉細胞培養(yǎng)液。

8.2.2待檢藥物稀釋：將待檢藥物選用最大無毒濃度，用DMEM維持液做倍比稀釋，使其稀釋度分

別為原液（最大無毒濃度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，每完成一個一稀釋度必須更換

吸頭，每個稀釋度溶液需要反復吹打混勻。

8.2.3陽性對照藥物稀釋：將陽性對照藥物（瑞德西韋）從10μM原始濃度開始，按照和待檢藥物相

同的稀釋方法進行倍比稀釋。

8.2.4分別取50μl不同稀釋倍數(shù)的待檢藥物或陽性對照藥物滴加于細胞培養(yǎng)孔中，每一稀釋度接種3

孔，同時設立病毒對照（不加藥物）和細胞對照（不加藥物、不加病毒），置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培

養(yǎng)1h。

8.2.5將藥物預處理后的細胞、病毒、藥物、試劑和耗材一次性帶入BSL-3核心區(qū)。

3

DB32/T3762.12-2021

8.2.6在待檢藥物組、陽性對照藥物組和病毒對照組的細胞孔中加入新型冠狀病毒（2μl/孔，0.02

MOI），置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)吸附1h。

8.2.7棄培養(yǎng)上清，以Hanks液洗滌細胞2次后加入含有對應不同濃度藥物的DMEM維持液，病毒

對照組和細胞對照組加不含藥物的DMEM維持液，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

8.2.8病毒滅活與核酸提?。号囵B(yǎng)結束后，在倒置顯微鏡下觀察CPE，并記錄結果；將培養(yǎng)上清加入

核酸提取試劑的裂解液中，混勻后按照核酸提取試劑盒和核酸提取儀操作說明進行核酸提取。

8.2.9核酸檢測：參照DB32/T3762.3進行。

8.2.10結果計算：根據(jù)核酸檢測獲得的CT值，計算不同藥物濃度下病毒被藥物抑制的百分比（%），

計算公式為（1-2-△CT）×100％（其中△CT=待檢藥物組CT值-病毒對照組CT值）。以病毒被抑制的

百分比為縱坐標，藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標，進行Logistic曲線擬合（四參數(shù)），計算待檢藥物和陽

性對照藥物的EC50值，進一步計算待檢藥物的選擇指數(shù)SI（CC50/EC50）。

8.2.11質(zhì)控要求及結果分析：正常細胞對照孔應該有完整的細胞單層，病毒對照孔應出現(xiàn)CPE變化，

原始濃度的陽性對照藥物能夠阻止CPE的產(chǎn)生。通過比較待檢藥物和陽性對照藥物的EC50值，結合待

檢藥物的SI值，評估其體外抗病毒效果。

9清場與消毒

9.1操作結束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用75％乙醇擦拭外表面后，移出生物安全

柜。

9.2將實驗過程產(chǎn)生的所有污染材料經(jīng)121℃，30min高壓消毒滅菌處理。

9.3用新鮮配制的有效氯5500mg/L的含氯消毒液擦拭工作臺面、生物安全柜內(nèi)壁及臺面