高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用一、高通量測序簡介二、高通量測序平臺的介紹三、高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1.1什么是高通量測序技術(shù)高通量序技術(shù)（next-generationsequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的高通量的測序技術(shù)，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。

一.高通量測序技術(shù)第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1.2為什么要發(fā)展高通量測序技術(shù)快速和準確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對于每個生物體來說，基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實地反映基因組DNA上的遺傳信息，進而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標志著第一代測序技術(shù)的誕生。盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進入21世紀后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標志的第二代測序技術(shù)誕生了。第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1.3高通量測序技術(shù)的特點速度快準確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天二

高通量測序技術(shù)的原理高通量測序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。下面對三種高通量測序技術(shù)的原理和特點分別進行具體介紹。第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸測序：A磁珠制備設(shè)備B454測序儀C454測序原理第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天454測序流程與BaseCalling每次加入一種堿基然后再對熒光強度進行讀取。堿基聚合反應(yīng)產(chǎn)生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在熒光酶催化下激發(fā)熒光，熒光強度和焦磷酸的量成正比。第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天454技術(shù)的主要缺點是無法準確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當(dāng)待測序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測序反應(yīng)中會一次加上多個T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號的強度來推測，有可能造成結(jié)果不準確。也正是因為這個原因，454技術(shù)主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天IlluminaSolexa簡介橋式PCR邊合成邊測序可逆終止物HiSeq2000第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天Solexa的特點與主要應(yīng)用讀長較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天ABISOLiD簡介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團進行檢測SOLiD5500xl第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天ABISOLiD測序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉(zhuǎn)到測序玻片第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天ABISOLiD測序原理測序流程依次加入五種引物進行五次測序。加入測序引物及加入oligo連接酶連接，激發(fā)熒光檢測，循環(huán)一個流程，換一種引物再循環(huán)一個流程，五個流程結(jié)果疊加分析出序列。第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天SOLiD的特點與主要應(yīng)用讀長較短，50-75bp精度高，可達Q40通量高，20-30G每天，1Run可達120G主要應(yīng)用：基因組重測序、SNP檢測等第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天三種平臺的技術(shù)差異平臺454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQ第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天三、高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用目前，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動植物全基因組測序、基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小RNAs測序和表觀基因組測序等方面。下面對高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體應(yīng)作以介紹。第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3.1全基因組重測序全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進行差異性分析。全基因組重測序的個體，通過序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)、插入缺失位點(InDel，Insertion/Deletion)、結(jié)構(gòu)變異位點(SV，StructureVariation)，通過生物信息學(xué)手段，分析不同個體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時完成注釋。

第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3.1.1利用重測序進行進化分析及SNP篩選

Lai等(2010)對6個玉米(Zeamays)骨干自交系進行了全基因組重測序，共發(fā)現(xiàn)

1273124個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)，得到30178個1～6bp的插入缺失位點(InDels)，新發(fā)現(xiàn)的這些SNPs和InDels提供了1個高密度的全基因組標記信息，同時也鑒定出數(shù)百個基因獲得與丟失變異(Presence/AbsenceVariations，PAVs)。第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3.1.2利用重測序技術(shù)鑒定突變體突變基因Ashelford等(2011)對一個擬南芥突變體ebi－1的回交系進行基因組重測序，隨后又通過對突變體的表達數(shù)據(jù)進行調(diào)查使得候選SNPs數(shù)目得以有效縮小，最終成功鑒定出1個在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突變表型的SNPs位點該研究證實利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音，對其進行測序分析可有效減少候選SNPs數(shù)目。第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3.2全基因組denovo測序

全基因組denovo測序也稱為從頭測序，是直接對某個物種進行基因組全測序，然后利用生物信息學(xué)方法對序列進行拼接和組裝，得到完整的物種基因組序列、基因組測序?qū)ρ芯课锓N的基因組和功能基因信息、闡明物種的進化及其生長發(fā)育具有重要的意義。

Huang等(2009)完成的黃瓜(CucumissativusL.)全基因組測序是世界上第一個完成全基因組測序的蔬菜作物，該工作的完成對黃瓜及其他近緣物種的遺傳、改良基礎(chǔ)生物學(xué)研究等具有重要的意義。第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3.3轉(zhuǎn)錄組測序研究

轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非

編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測序是指通過新一代高通量測序技術(shù)對cDNA測序，利用統(tǒng)計相關(guān)reads數(shù)計算出不同mRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SNP新的mRNA等，該技術(shù)可以從表達水平、等位基因特異性表達RNA編輯、含有重要信息的融合基因轉(zhuǎn)錄子差異剪接等方面展開相關(guān)研究。第27頁,共29頁，2024年2月25日，星期天Zhang等(2010)用8種不同水稻(OryzasativaL.)樣品的不同組織于不同時期混合建庫，通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了栽培稻的第1張轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果在水稻8種組織樣品中檢測到大約27000個基因的表達和38000個轉(zhuǎn)錄單元，證實了約9000個基因發(fā)生可變剪接，同時鑒定