酶生物合成的基本理論

酶生物合成的基本理論第一篇酶的生產(chǎn)第二章酶生物合成的基本理論1第三章酶的生物合成法生產(chǎn)2第四章酶的提取與分離純化3第2頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第二章酶生物合成的基本理論引言1RNA的生物合成2蛋白質(zhì)的生物合成3酶生物合成的調(diào)節(jié)4第3頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酶的生物合成（enzymebiosynthesis）是通過細胞的生命活動合成各種酶的過程。細胞內(nèi)酶的生物合成要經(jīng)過一系列的步驟，需要諸多因素的參與，在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工和組裝過程中，這些因素都對酶的生物合成起到調(diào)節(jié)控制作用。第4頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄中心法則Reversetranscription以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。第5頁,共61頁，2024年2月25日，星期天中心法則Replication復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。Translation翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的氨基酸順序的過程。Reversetranslation逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過程。第6頁,共61頁，2024年2月25日，星期天不同的RNA具有不同的生物學(xué)功能（1）雙鏈RNA：在某些RNA病毒中，作為遺傳信息的載體。（2）tRNA:

在蛋白質(zhì)的生物合成過程中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；（3）催化活性RNA：屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關(guān)的生化反應(yīng)。（4）sRNA：各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)節(jié)等方面有重要作用。（5）mRNA：攜帶遺傳信息，在蛋白質(zhì)合成時充當(dāng)模板的RNA。（6）rRNA：是細胞中含量最多的RNA，約占RNA總量的82%。rRNA單獨存在時不執(zhí)行其功能，它與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”。

第7頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄過程的特點轉(zhuǎn)錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。（反義鏈，有義鏈）反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負(fù)鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。第8頁,共61頁，2024年2月25日，星期天TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPTTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’第9頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄過程的特點轉(zhuǎn)錄所需酶：依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉(zhuǎn)錄酶，是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。

原核生物：核心酶，全酶（核心酶+σ因子）。

真核生物：RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4～10個，亞基種類有4～6種。第10頁,共61頁，2024年2月25日，星期天聚合酶種類RNA聚合酶ⅠRNA聚合酶ⅡRNA聚合酶Ⅲ別名rRNA聚合酶不均一rRNA聚合酶小分子rRNA聚合酶存在位置核仁核仁核質(zhì)相對分子量550600600催化反應(yīng)的產(chǎn)物rRNAmRNAtRNA，5SrRNA真核生物的RNA聚合酶第11頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄過程起始位點的識別recognition轉(zhuǎn)錄起始initiation鏈的延伸elongation轉(zhuǎn)錄終止termination轉(zhuǎn)錄后加工modification第12頁,共61頁，2024年2月25日，星期天RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達基因終點延長階段5

3

RNA

終止子(terminator)

啟動子（promotor)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

離開第13頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的主要過程（以大腸桿菌為例）一、轉(zhuǎn)錄的起始1、全酶的形成：核心酶與?因子結(jié)合成為全酶。2、酶與模板結(jié)合：全酶與模板DNA結(jié)合生成不穩(wěn)定的復(fù)合物，全酶可沿著模板DNA移動，尋找識別位點。3、酶與啟動子結(jié)合：全酶與模板DNA的啟動子結(jié)合生成酶與啟動子的復(fù)合物。4、模板DNA局部變性：DNA的雙螺旋部分解鏈。5、轉(zhuǎn)錄開始：全酶移至轉(zhuǎn)錄起始位點，生成穩(wěn)定的酶-DNA復(fù)合物，按照堿基互補原則結(jié)合進一個核苷三磷酸，轉(zhuǎn)錄正式開始，?因子釋放出來。第14頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的主要過程（以大腸桿菌為例）二、RNA鏈的延伸1、從起始階段到延伸階段，RNA聚合酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化。2、RNA鏈的延伸沿著5’至3’的方向進行。延伸的速率大約為50nt/s.3、RNA聚合酶不具有外切核酸酶的活性，無校對功能，RNA生物合成的差錯率為10-4-10-5，比DNA復(fù)制的差錯率10-9-10-10大的多。第15頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的主要過程（以大腸桿菌為例）三、RNA鏈合成的終止1、模板DNA分子上每一個基因或每一個操縱子都含有一個終止信號-終止子。2、有些RNA鏈合成的終止還需要終止因子（terminationfactor）-ρ因子的幫助。第16頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的主要過程（以大腸桿菌為例）四、RNA前體的加工經(jīng)過轉(zhuǎn)錄獲得的產(chǎn)物并非成熟的RNA分子，而是RNA前體。（一）剪切反應(yīng)：是指從RNA前體的末端切去一定大小的RNA片段，而得到成熟的RNA分子的加工過程。（二）剪接反應(yīng)：是指將RNA前體的間插序列除去，并把兩端的外顯子連接起來，形成成熟RNA分子的加工過程。第17頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的主要過程（以大腸桿菌為例）（三）末端連接反應(yīng)：末端連接反應(yīng)是指在RNA分子的3’末端或5’末端連接上特定的寡核苷酸，而形成成熟的RNA。1、在tRNA的3’末端加上CCA-OH2、在mRNA的5’末端形成‘帽子’結(jié)構(gòu)。3、在mRNA的3’-末端連接polyA尾巴。4、在tRNA的5’末端加上甲基鳥苷酸。第18頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的主要過程（以大腸桿菌為例）（四）核苷修飾反應(yīng)成熟的tRNA分子中含有許多修飾核苷。這些修飾核苷是在tRNA加工過程中，通過各種酶的作用而生成的。第19頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯定義以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖核蛋白體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。mRNA蛋白質(zhì)翻譯各種信息各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列順序）（氨基酸排列順序）第20頁,共61頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)合成的幾個要素1、mRNA——模板mRNA是帶有DNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。以mRNA為模板，合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程(翻譯)，就是將mRNA分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。第21頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2、遺傳密碼mRNA分子中,每三個相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱為密碼子或三聯(lián)密碼。四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個即64個密碼子。其中：一個起始密碼:AUG三個終止密碼:UAAUGAUAG多數(shù)氨基酸擁有:2-4個密碼第22頁,共61頁，2024年2月25日，星期天3、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)

tRNA是氨基酸的轉(zhuǎn)運工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。tRNA有特異性，至少有20種以上。每種tRNA的反密碼環(huán)頂端均由三個核苷酸組成的反密碼，能與mRNA上相應(yīng)的密碼互補結(jié)合。第23頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼(codon)與反密碼(anticodon)的堿基配對第24頁,共61頁，2024年2月25日，星期天4、核糖體核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質(zhì)和rRNA組成。是存在于細胞質(zhì)內(nèi)的微小顆粒。第25頁,共61頁，2024年2月25日，星期天Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell第26頁,共61頁，2024年2月25日，星期天5、其他因子和酶其他輔助因子工具酶第27頁,共61頁，2024年2月25日，星期天一、遺傳密碼（一）遺傳密碼的概念（二）遺傳密碼的特點1、遺傳密碼的簡并性：一種氨基酸具有一個以上的密碼子的現(xiàn)象稱為簡并性。2、遺傳密碼的通用性：不管在體內(nèi)還是體外，不管是何種生物，遺傳密碼子都是通用的。3、密碼子和反密碼子的相互作用第28頁,共61頁，2024年2月25日，星期天三聯(lián)體密碼第29頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共61頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)的生物合成氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止與釋放大腸桿菌在核糖體上合成多肽第31頁,共61頁，2024年2月25日，星期天（一）氨基酸活化生成氨酰-tRNAAA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi對于真核生物，肽鏈合成時的第一個氨基酸是甲硫氨酸（Met），起始tRNA是Met-tRNAMet。而對于E.coli而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet)，起始tRNA是fMet-tRNAF。第32頁,共61頁，2024年2月25日，星期天（二）肽鏈合成的起始1、30s亞基與起始因子IF3結(jié)合；2、30s亞基與mRNA結(jié)合，形成30S-IF3-mRNA復(fù)合物；3、fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GPT結(jié)合，生成fMet-tRNAF-IF2-GPT；

4、在起始因子IF1的參與下，30S-IF3-mRNA與fMet-tRNA-IF2-GTP結(jié)合生成30s起始復(fù)合物。在此復(fù)合物中，fMet-tRNAF上的密碼子正好與mRNA的起始密碼子（AUG）結(jié)合。5、50S亞基與30S起始復(fù)合物結(jié)合，形成70S核糖體。fMet-tRNAF位于70S核糖體的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。第33頁,共61頁，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亞基mRNAfMet-tRNAFGTP大亞基GDP+PiA位P位fMetfMet肽鏈合成的起始階段第34頁,共61頁，2024年2月25日，星期天（三）肽鏈的延伸1、延伸因子EF-T與氨酰-tRNA以及GTP結(jié)合生成復(fù)合物。2、進位:氨酰-tRNA進入核糖體上的A位（受位）;3、轉(zhuǎn)肽:形成肽鍵，在轉(zhuǎn)肽酶作用下,給位與受位結(jié)合;4、移位:核蛋白體向3’端移動一個密碼子的位置，空出受位，不斷地進位、轉(zhuǎn)肽、移位，使肽鏈延長。第35頁,共61頁，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’UACfMet蘇UGUAUGACA5’UACfMet蘇UGUGUUAUGACA5’UACfMet蘇UGUGUUAUGACA5’fMet蘇UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體進位轉(zhuǎn)肽移位Mg+K+肽鏈合成的延伸階段第36頁,共61頁，2024年2月25日，星期天進位移位轉(zhuǎn)肽第37頁,共61頁，2024年2月25日，星期天（四）肽鏈合成的終止階段出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合;肽鍵水解，多肽釋放;tRNA，mRNA，大小亞基解離。第38頁,共61頁，2024年2月25日，星期天AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’終終AUGUAA5’UAC3’終5’3’UAC終肽鏈第39頁,共61頁，2024年2月25日，星期天（五）蛋白質(zhì)前體的加工1、N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸的切除2、二硫鍵的形成與重排3、肽鏈的剪切4、氨基酸側(cè)鏈的修飾5、肽鏈的折疊（分子伴侶、折疊酶）6、亞基的聚合第40頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)酶生物合成的調(diào)節(jié)第41頁,共61頁，2024年2月25日，星期天ABEX底物水平的調(diào)節(jié)酶水平的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)輔助因子調(diào)節(jié)生長發(fā)育的不同時期外界環(huán)境變化酶合成與分解速度的變化（基因表達調(diào)控）產(chǎn)物調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酶的調(diào)控模式第42頁,共61頁，2024年2月25日，星期天酶在細胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞根據(jù)自身活動需要，嚴(yán)格控制細胞內(nèi)各種酶的合理含量，從而對各種生物化學(xué)過程進行調(diào)控。酶濃度調(diào)節(jié)的化學(xué)本質(zhì)是基因表達的調(diào)節(jié)。在細胞內(nèi)，所合成的酶的種類及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而合成酶蛋白。在細胞內(nèi)進行的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程都有特定的調(diào)節(jié)控制機制，其中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控占主導(dǎo)地位。因此，基因表達的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進行。第43頁,共61頁，2024年2月25日，星期天組成酶：在細胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對這些酶的合成速率影響不大。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途徑的各種酶等。

適應(yīng)酶（調(diào)節(jié)酶）：在細胞中的含量變化很大，其合成速率明顯受到環(huán)境因素的影響。如：大腸桿菌β-半乳糖苷酶。第44頁,共61頁，2024年2月25日，星期天一、原核生物中酶生物合成的調(diào)節(jié)控制與酶生物合成有關(guān)的基因調(diào)節(jié)基因啟動基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因第45頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)

（阻遏），通過與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。第46頁,共61頁，2024年2月25日，星期天啟動基因（promotorgene）：

RNA聚合酶的結(jié)合位點

cAMP-CAP的結(jié)合位點CAP：分解代謝產(chǎn)物活化蛋白，又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白。只有cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點上，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。兩個位點第47頁,共61頁，2024年2月25日，星期天操縱基因（Operatergene）:

位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時機與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。第48頁,共61頁，2024年2月25日，星期天操縱子：由結(jié)構(gòu)基因、操縱基因和啟動基因一起組成。誘導(dǎo)型操縱子：無誘導(dǎo)物的情況下，其基因的表達水平很低或不表達，只有在誘導(dǎo)物存在的情況下，才能轉(zhuǎn)錄生成mRNA，進而合成酶。例：乳糖操縱子阻遏型操縱子：在無阻遏物的情況下，基因正常表達，當(dāng)有阻遏物存在時，轉(zhuǎn)錄受到阻遏。例：色氨酸操縱子第49頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1、分解代謝物阻遏作用某些物質(zhì)經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶生物合成的現(xiàn)象。葡萄糖等物質(zhì)分解代謝釋放能量ATP↑AMP↓細胞內(nèi)的cAMP通過磷酸二酯酶水解生成AMP腺苷酸環(huán)化酶活化受到抑制cAMP的生成受阻胞內(nèi)cAMP↓cAMP-CAP復(fù)合物↓啟動基因位點上沒有足夠的cAMP-CAP復(fù)合物RNA聚合酶無法結(jié)合在啟動基因位點上轉(zhuǎn)錄無法進行，酶合成受阻第50頁,共61頁，2024年2月25日，星期天分解代謝物阻遏作用細胞生長、新陳代謝進行ATP↓ADP↑、AMP↑、cAMP↑cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合到啟動基因的特定位點RNA聚合酶結(jié)合到相應(yīng)位點酶生物合成開始為了減少或解除分解代謝物阻遏作用，可以在培養(yǎng)環(huán)境中控制好某些容易降解物質(zhì)的量或添加一定量的cAMP。第51頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2、酶生物合成的誘導(dǎo)作用

加入某些物質(zhì)，使酶的生物合成開始或加速進行的現(xiàn)象。誘導(dǎo)物：能引起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)，一般是酶催化作用的底物或底物類似物。已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透過酶；

-半乳糖乙?；浮嶒灒?/p>

1.大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)無上述三種酶合成；

2.大腸桿菌生長在乳糖唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內(nèi)有上述三種酶合成；當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基時，三種酶基本消失；

3.表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。第52頁,共61頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)第53頁,共61頁，2024年2月25日，星期天3、酶生物合成的反饋阻遏作用酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。共阻遏物：引起反饋作用的物質(zhì)實驗：

（1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟原則:不需要就不合成。第54頁,共61頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達色氨酸操縱子（酶的阻遏）第55頁,共61頁，2024年2月25日，星期天二、真核生物酶生物合成的調(diào)節(jié)