酶的高度純化之正負電荷法

酶的高度純化之正負電荷法酶的高度純化之正負電荷法知識點1、利用正負電荷純化的原理

2、按電荷正負差異法分離的方法

3、各個技術的原理及操作（重點）第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法

原理

利用酶分子與雜蛋白所帶正負電荷多少的不同，在一定條件下，如通電加電極、加有極性的薄膜等，又有同性相斥，異性相吸的原理，于是，酶分子與雜蛋白在介質中就會向不同的方向移動，從而達到分離的目的。第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電場膜分離電滲析離子交換膜電滲析電泳分離紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳層析分離：層析聚焦（按介質）第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電場膜分離原理

在電場作用下，小分子的帶電物質或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動，透過半透膜，從而達到分離的目的。在半透膜兩側分別裝上正、負極。第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電滲析離子交換膜電滲析電場膜分離。第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電解（Electrolysis）

是將電流通過電解質溶液或熔融態(tài)物質，（又稱電解液），在陰極和陽極上引起氧化還原反應的過程，電化學電池在外加電壓時可發(fā)生電解過程。第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法陽膜：只允許陽離子通過陰膜：只允許陰離子通過結果：陰極室溶液呈？性，陽極室溶液呈？性電滲析（electrodialysis【ED】）第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法升級版第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法

電滲析與電解不同之處在于：電滲析的電壓雖高，電流并不大，維持不了連續(xù)的氧化還原反應所需；電解卻正好相反。思考：電滲析與電解的區(qū)別？第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電滲析主要用于酶液或其他帶電荷小分子的分離，也可以將凝膠電泳后的含蛋白質或核酸等的凝膠切開，置于中心室，經(jīng)過電滲析，使帶電荷的大分子從凝膠中分離出來第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電滲析技術在生活中有著重要應用，如化工脫鹽，海水淡化，食品醫(yī)藥，廢水處理，在某些地區(qū)成為飲用水的重要生產(chǎn)方法。

優(yōu)點：具有能量消耗少，經(jīng)濟效益顯著，裝置和系統(tǒng)應用靈活方便，操作簡便，不污染環(huán)境，裝置使用時間長，原水回收率高等優(yōu)點。第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電泳分離定義：帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳（electrophoresis）。利用帶電粒子在電場中泳動的方向和泳動速率的不同，而使組分分離的技術過程就是電泳分離。第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法電泳分離紙層電泳薄膜電泳薄層電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳區(qū)帶電泳移界電泳穩(wěn)態(tài)電泳按介質按原理等速電泳等電聚焦電泳第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法區(qū)帶電泳：

是在一定的支持物上，于均一的載體電解質中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、粉末電泳、凝膠電泳與絲線電泳。第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法移動界面電泳：

是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負極），在電泳開始前，樣品與載體電解質有清晰的界面。電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動，泳動速度最快的離子走在最前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有第一個區(qū)帶的界面是清晰的，達到完全分離，其中含有電泳速度最快的離子，其他大部分區(qū)帶重疊。第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法等速電泳：

是在樣品中加有領先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的?。瑯悠芳釉陬I先離子和終末離子之間，在外電場作用下，各離子進行移動，經(jīng)過一段時間電泳后，達到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當?shù)闹С蛛娊赓|來載帶電流，所得到的區(qū)帶是相互連接的（圖d），且因“自身校正”效應，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法等電聚焦電泳：等電點？在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白質解離成陽離子和陰離子的趨勢或程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時溶液的pH成為該氨基酸或蛋白質的等電點。第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法等電聚焦電泳：

是將兩性電解質加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當待分離的酶或其他蛋白溶液泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點的物質最后聚焦在各自等電點位置，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法區(qū)帶電泳移界電泳等速電泳等電聚焦思考：PAGE屬于上述哪個？第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法層析聚焦聚焦層析是將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現(xiàn)組分分離的技術。第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法層析聚焦聚焦層析是利用層析過程中固定相偶聯(lián)具有兩性解離功能的有機分子為配基，與流動相中某些具有兩性粒子發(fā)生等電聚焦反應而進行分離的一種方法。第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法步驟：。（1）加有兩性電解質載體的多緩沖溶液流經(jīng)多緩沖離子交換劑形成穩(wěn)定pH梯度。第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法步驟：第27頁,共29頁，2024年2月25日，星期天酶的高度純化之正負電荷法制作pH6—9的梯度：

（1）使用時，將多元緩沖劑pH值調(diào)到9（初始pH）（2）將多元緩沖液(pH6-9)調(diào)到7(極限pH)(3)用（