DB32T3762.2-2020新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第2部分：病毒分離與鑒定

ICS11.020

C62

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T3762.2—2020

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范

第2部分：病毒分離與鑒定

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part2:Virusisolationandidentification

2020-03-02發(fā)布2020-03-03實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.2—2020

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第2部分：病毒分離與鑒定

1范圍

本部分規(guī)定了新型冠狀病毒感染臨床樣本病毒分離培養(yǎng)環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、操

作步驟和清場與消毒。

本部分適用于新型冠狀病毒感染患者各類臨床樣本中新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的分離培養(yǎng)，

其它呼吸道病毒的分離培養(yǎng)程序可參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

新型冠狀病毒實驗室生物安全指南中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件

3.1

細胞病變效應cytopathiceffect，CPE

病毒在宿主細胞內(nèi)大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。大多數(shù)病毒感染敏感細胞培養(yǎng)都能引

起其顯微表現(xiàn)改變，如細胞聚集成團腫大圓縮脫落及細胞融合成為多核細胞，細胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，乃至

細胞裂解等即細胞病變效應。

4環(huán)境與設(shè)施

4.1實驗室資質(zhì)及級別要求：應符合《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》的要求，實驗室開展新型

冠狀病毒感染臨床樣本病毒分離培養(yǎng)相關(guān)活動前，應報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應活動的資

質(zhì)，并需在生物安全三級（BSL-3）實驗室進行。

4.2操作人員資質(zhì)及防護要求：實驗操作人員應經(jīng)過生物安全培訓并取得BSL-3實驗活動上崗證，在

身體健康狀態(tài)良好的情況下準入。操作人員按BSL-3級實驗室個人防護的要求進行防護，需配備N95

及以上級別防護口罩、護目鏡或防護面屏、連體防護服、一次性手術(shù)衣、一次性PE手套、乳膠手套、

鞋套、靴套等防護裝備。

5設(shè)備與耗材

5.1設(shè)備

生物安全柜、離心機、倒置顯微鏡、渦旋器、CO2培養(yǎng)箱等。

1

DB32/T3762.2—2020

5.2耗材

一次性平皿、剪刀、鑷子、聚四氟乙烯研磨器（塑料）、離心管、細胞培養(yǎng)瓶/細胞管、移液器、

移液管、帶濾芯Tip頭等。

6試劑與材料

6.1臨床樣本

6.1.1呼吸道樣本：咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等。

6.1.2尸體解剖組織樣本。

6.1.3血液樣本：病人急性期血清。

6.2試劑

6.2.1Hanks溶液（每毫升含青、鏈霉素各2000單位）。

6.2.2DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。

6.2.3DMEM維持液（含2%胎牛血清）。

6.2.4消化液（0.25%胰酶和0.025%EDTA-Na2混合液）。

6.3細胞

非洲綠猴腎傳代細胞（VERO-E6）、人肝癌細胞（Huh7）等。

7操作步驟

7.1實驗前準備

7.1.1將實驗所需細胞置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層。

7.1.2配備消毒液：75%酒精、0.55%次氯酸鈉消毒液。

7.1.3檢查BSL-3級實驗室壓力是否正常。

7.1.4將細胞、樣本、試劑和耗材一次性帶入BSL-3級實驗室核心區(qū)。

7.2樣本處理

7.2.1呼吸道樣本及肛拭子

a)在生物安全柜內(nèi)渦旋震蕩裝有呼吸道樣本（咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等）及肛拭子的采樣

管，瞬時離心后取上清液至新的離心管，按終濃度10%～20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理

樣本4-6小時或過夜。

b)將上述處理過的樣本4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。

7.2.2肺組織樣本

a)在生物安全柜內(nèi)將肺組織放在平皿內(nèi)，取3mL～5mL的Hanks溶液漂洗3次，以去除組織外

部的血垢。漂洗時動作要輕柔，防止氣溶膠的產(chǎn)生和液體的濺出。漂洗的廢液收集在含0.55%

的次氯酸鈉消毒液的帶蓋塑料瓶內(nèi)。

b)將漂洗后的肺組織，用無菌的剪刀和鑷子去除肺組織上的結(jié)締組織和血管，再用Hanks溶液

漂洗1次，將肺組織剪成1mm3的小塊放在研磨器內(nèi)進行研磨，研磨的動作要輕柔，注意避免

2

DB32/T3762.2—2020

液體的濺出。研磨后制成20%懸液，按終濃度10%～20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理樣本

4-6小時或過夜。

c)將上述處理過的樣本管4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。

7.2.3血液樣本

a)感染急性期血清，按終濃度10%～20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理樣本4～6小時或過夜。

b)將上述處理過的樣本管4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。

7.3接種病毒

7.3.1棄去VERO-E6細胞培養(yǎng)液，用Hanks液洗滌細胞3次，棄上清。

7.3.2吸取50μL～200μL樣本液接種至培養(yǎng)孔內(nèi)，輕輕混勻，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱，吸附1h～2h，

期間每15min搖晃一次。

7.3.3吸附后棄上清，補足適量DMEM維持液，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，設(shè)VEROE6細胞對照

7.4細胞病變（CPE）觀察與培養(yǎng)物收集鑒定

7.4.1細胞病變（CPE）觀察

按上述方法樣本接種細胞后，每24h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化（CPE）：以0%～25%細胞

CPE變化為“+”，26%～50%細胞CPE變化為“++”，51%～75%細胞CPE變化為“+++”，76%～100%細胞

CPE變化為“++++”，正常細胞形態(tài)為“-”。

7.4.2培養(yǎng)物收集

每代次收集的培養(yǎng)物需反復凍融三次，4℃，4000rpm，離心15min，收集上清。

7.4.3培養(yǎng)結(jié)果鑒定

滿足以下兩點判定病毒分離成功。若不滿足以下條件說明病毒分離不成功，需盲傳三代或重新接種

臨床樣本再做鑒定。

a)樣本接種孔細胞出現(xiàn)明顯CPE(+及以上)；

b)分離培養(yǎng)物進行新型冠狀病毒核酸檢測呈陽性。

8清場與消毒

8.1操作結(jié)束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用75％酒精擦拭外表面后，移出生物安全柜。

8.2將實驗過程產(chǎn)生的所有污染材料經(jīng)121℃，30min高壓消毒滅菌處理。

8.3用新鮮配制的含0.55％次氯酸鈉溶液擦拭工作臺面、生物安全柜內(nèi)壁及臺面，不要擦拭頂棚，作

用30min后，用清水擦拭以除去殘余消毒液。

8.4填寫實驗記錄并用傳真機傳出，退出核心區(qū)填寫B(tài)SL-3級實驗室相關(guān)實驗記錄。

_________________________________

3

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前言

DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范》目前分為以下部分：

——第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；

——第2部分：病毒分離與鑒定；

——第3部分：核酸熒光PCR檢測程序；

——第4部分：重組酶介導等溫擴增程序；

——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測程序；

——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；

——第7部分：空氣樣本檢測與評估；

——第8部分：物體表面檢測與評估；

——第9部分：醫(yī)務人員職業(yè)暴露檢測與評估。

本部分為DB32/T3762的第2部分。

本部分按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本部分由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出。

本部分由江蘇省衛(wèi)生標準化技術(shù)委員會歸口。

本部分起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、南京醫(yī)科大學、蘇州第五人民醫(yī)院、蘇州大學附二院、

昆山市疾病預防控制中心。

本部分主要起草人：遲瑩、朱寶立、葛以躍、郭喜玲、崔侖標、程軍平、徐佳南、錢志遠、羅曉明、

沈歡喜。

I

DB32/T3762.2—2020

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第2部分：病毒分離與鑒定

1范圍

本部分規(guī)定了新型冠狀病毒感染臨床樣本病毒分離培養(yǎng)環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、操

作步驟和清場與消毒。

本部分適用于新型冠狀病毒感染患者各類臨床樣本中新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的分離培養(yǎng)，

其它呼吸道病毒的分離培養(yǎng)程序可參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

新型冠狀病毒實驗室生物安全指南中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件

3.1

細胞病變效應cytopathiceffect，CPE

病毒在宿主細胞內(nèi)大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。大多數(shù)病毒感染敏感細胞培養(yǎng)都能引

起其顯微表現(xiàn)改變，如細胞聚集成團腫大圓縮脫落及細胞融合成為多核細胞，細胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，乃至

細胞裂解等即細胞病變效應。

4環(huán)境與設(shè)施

4.1實驗室資質(zhì)及級別要求：應符合《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》的要求，實驗室開展新型

冠狀病毒感染臨床樣本病毒分離培養(yǎng)相關(guān)活動前，應報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應活動的資

質(zhì)，并需在生物安全三級（BSL-3）實驗室進行。

4.2操作人員資質(zhì)及防護要求：實驗操作人員應經(jīng)過生物安全培訓并取得BSL-3實驗活動上崗證，在

身體健康狀態(tài)良好的情況下準入。操作人員按BSL-3級實驗室個人防護的要求進行防護，需配備N95

及以上級別防護口罩、護目鏡或防護面屏、連體防護服、一次性手術(shù)衣、一次性PE手套、乳膠手套、

鞋套、靴套等防護裝備。

5設(shè)備與耗材

5.1設(shè)備

生物安全柜、離心機、倒置顯微鏡、渦旋器、CO2培養(yǎng)箱等。

1

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5.2耗材

一次性平皿、剪刀、鑷子、聚四氟乙烯研磨器（塑料）、離心管、細胞培養(yǎng)瓶/細胞管、移液器、

移液管、帶濾芯Tip頭等。

6試劑與材料

6.1臨床樣本

6.1.1呼吸道樣本：咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等。

6.1.2尸體解剖組織樣本。

6.1.3血液樣本：病人急性期血清。

6.2試劑

6.2.1Hanks溶液（每毫升含青、鏈霉素各2000單位）。

6.2.2DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。

6.2.3DMEM維持液（含2%胎牛血清）。

6.2.4消化液（0.25%胰酶和0.025%EDTA-Na2混合液）。

6.3細胞

非洲綠猴腎傳代細胞（VERO-E6）、人肝癌細胞（Huh7）等。

7操作步驟

7.1實驗前準備

7.1.1將實驗所需細胞置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層。

7.1.2配備消毒液：75%酒精、0.55%次氯酸鈉消毒液。

7.1.3檢查BSL-3級實驗室壓力是否正常。

7.1.4將細胞、樣本、試劑和耗材一次性帶入BSL-3級實驗室核心區(qū)。

7.2樣本處理

7.2.1呼吸道樣本及肛拭子

a)在生物安全柜內(nèi)渦旋震蕩裝有呼吸道樣本（咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等）及肛拭子的采樣

管，瞬時離心后取上清液至新的離心管，按終濃度10%～20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理

樣本4-6小時或過夜。

b)將上述處理過的樣本4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。

7.2.2肺組織樣本

a)在生物安全柜內(nèi)將肺組織放在平皿內(nèi)，取3mL～5mL的Hanks溶液漂洗3次，以去除組織外

部的血垢。漂洗時動作要輕柔，防止氣溶膠的產(chǎn)生和液體的濺出。漂洗的廢液收集在含0.55%

的次氯酸鈉消毒液的帶蓋塑料瓶內(nèi)。

b)將漂洗后的肺組織，用無菌的剪刀和鑷子去除肺組織上的結(jié)締組織和血管，再用Hanks溶液

漂洗1次，將肺組織剪成1mm3的小塊放在研磨器內(nèi)進行研磨，研磨的動作要輕柔，注意避免

2

DB32/T3762.2—2020

液體的濺出。研磨后制成20%懸液，按終濃度10%～20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理樣本

4-6小時或過夜。

c)將上述處理過的樣本管4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。

7.2.3血液樣本

a)感染急性期血清，按終濃度10%～20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理樣本4～6小時或過夜。

b)將上述處理過的樣本管4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。

7.3接種病毒

7.3.1棄去VERO-E6細胞培養(yǎng)液，用Hanks液洗滌細胞3次，棄上清。

7.3.2吸取50μL～200μL樣本液接種至培養(yǎng)孔內(nèi)，輕輕混勻，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱，吸附