酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)

酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)酶合成方式：

1958Crick中心法則DNAmRNA酶轉(zhuǎn)錄翻譯RNA聚合酶第一節(jié)酶生物合成調(diào)控機制第2頁,共66頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA的過程。翻譯：以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA，酶和輔助因子的作用，合成多肽的過程。第3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、誘導(dǎo)作用（Induction）

1、概念：某些酶在通常情況下生物體不能合成或合成很少，但加入“誘導(dǎo)物”后，就能大量合成，這種現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)。第4頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

LaczLacyLaca

20世紀60年代初法國巴斯德研究所F.JacobandJ.Monod“乳糖操縱子假說”乳糖酶第5頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）決定酶合成有兩個不同的基因群。2、乳糖操縱子假說第6頁,共66頁，2024年2月25日，星期天決定酶合成的兩個基因群操縱子（operon）調(diào)節(jié)基因R(Regulatorygene)啟動基因P

操縱基因O結(jié)構(gòu)基因SP:PromotorO:OperatorS:Structure第7頁,共66頁，2024年2月25日，星期天SPLaczLacyLacaOR調(diào)節(jié)基因操縱基因啟動基因結(jié)構(gòu)基因Operon操縱子DNA第8頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

①調(diào)節(jié)基因（Regulatorygene）：

可產(chǎn)生阻遏蛋白，阻遏蛋白能與操縱基因結(jié)合。R阻遏蛋白SPLaczLacyLacaORDNA第9頁,共66頁，2024年2月25日，星期天②啟動基因（Promotor）：是RNA聚合酶的結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄起點。RNA聚合酶SPLaczLacyLacaORDNA第10頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

③結(jié)構(gòu)基因（Structure）：

是DNA模板，在RNA聚合酶作用下，根據(jù)其堿基序列轉(zhuǎn)錄出mRNA。SPLaczLacyLacaORDNAmRNAzmRNAymRNAa轉(zhuǎn)錄翻譯酶RNA聚合酶第11頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

④操縱基因（Operator）：位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基序列，是阻遏蛋白的結(jié)合位點。在操縱子中起“開關(guān)”作用。SPLaczLacyLacaORDNA第12頁,共66頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)基因操縱基因SPLaczLacyLaca

阻遏蛋白（有活性）轉(zhuǎn)錄啟動基因ORA、無誘導(dǎo)物（乳糖）存在

結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶翻譯酶mRNA（2）乳糖酶合成調(diào)控方式第13頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNAZmRNAYmRNAA

阻遏蛋白(無活性)乳糖

阻遏蛋白(有活性)調(diào)節(jié)基因操縱基因SPLaczLacyLaca啟動基因R結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶B、有誘導(dǎo)物（乳糖）存在O轉(zhuǎn)錄翻譯酶第14頁,共66頁，2024年2月25日，星期天Question：

以上理論對指導(dǎo)酶制劑生產(chǎn)有何實際意義？第15頁,共66頁，2024年2月25日，星期天3、乳糖操縱子假說對指導(dǎo)

酶制劑生產(chǎn)的意義在酶合成時添加誘導(dǎo)物底物關(guān)鍵：選擇合適的誘導(dǎo)物和其濃度底物的結(jié)構(gòu)類似物實驗確定第16頁,共66頁，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)實例：酵母生產(chǎn)β-半乳糖苷酶以葡萄糖作唯一碳源培養(yǎng)酵母菌以乳糖作為唯一碳源培養(yǎng)酵母菌幾分鐘后β-半乳糖苷酶乳糖最佳誘導(dǎo)濃度：120g/L第17頁,共66頁，2024年2月25日，星期天意義2：利用現(xiàn)代誘變育種技術(shù)使基因發(fā)生突變①

使調(diào)節(jié)基因R發(fā)生突變②使操縱基因O發(fā)生突變第18頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNAzmRNAymRNAa轉(zhuǎn)錄翻譯酶RNA聚合酶R①

調(diào)節(jié)基因R突變

利用現(xiàn)代育種技術(shù)，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，致使其不能產(chǎn)生阻遏蛋白，使誘導(dǎo)酶變成組成酶。

阻遏蛋白PLaczLacyLacaOS第19頁,共66頁，2024年2月25日，星期天mRNAZmRNAYmRNAa轉(zhuǎn)錄翻譯酶RNA聚合酶②

操縱基因O突變

利用現(xiàn)代育種技術(shù)，使操縱基因發(fā)生突變，使其不與阻遏蛋白作用，使誘導(dǎo)酶變成組成酶。

阻遏蛋白(有活性)PLaczLacyLacaRSO第20頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、酶合成的反饋阻遏Repression反饋阻遏是指酶作用的終產(chǎn)物對酶合成產(chǎn)生阻遏作用第21頁,共66頁，2024年2月25日，星期天阻遏蛋白操縱基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，所以結(jié)構(gòu)基因表達。酶代謝產(chǎn)物一旦大量積累阻遏蛋白被產(chǎn)物激活，結(jié)構(gòu)基因不表達。第22頁,共66頁，2024年2月25日，星期天這一理論在實踐意義：(1)設(shè)法從培養(yǎng)基中除去其終產(chǎn)物，以消除反饋阻遏。第23頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、酶合成的分解代謝阻遏作用又稱葡萄糖效應(yīng)是指微生物在其培養(yǎng)基中由于葡萄糖的存在雖然能迅速生長，但明顯地抑制某些分解代謝誘導(dǎo)酶的形成。第24頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

將E.coli培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上，出現(xiàn)“二峰生長現(xiàn)象”即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗盡之后誘導(dǎo)形成

-半乳糖苷酶葡萄糖分解產(chǎn)物對-半乳糖苷酶形成阻遏第25頁,共66頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖過量存在——放出的能量部分儲存在ATP中ADP+AMP——ATPcAMP+H2OAMPcAMP-CRP復(fù)合物的濃度降低啟動基因(P)上沒有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合RNA聚合酶無法結(jié)合到啟動基因酶的生物合成無法進行。磷酸二酯酶第26頁,共66頁，2024年2月25日，星期天酶微生物引起阻遏作用物質(zhì)α-淀粉酶嗜熱脂肪芽孢桿菌果糖纖維素酶綠色木霉葡萄糖、甘油、纖維二糖蛋白酶巨大芽孢桿菌葡萄糖淀粉葡萄糖苷酶二孢內(nèi)孢酶麥芽糖、葡萄糖、甘油分解代謝阻遏實例第27頁,共66頁，2024年2月25日，星期天用甘油代替果糖培養(yǎng)嗜熱脂肪芽孢桿菌，α-淀粉酶產(chǎn)量可提高25倍。采用甘露糖作為熒光假單胞桿菌培養(yǎng)基時，纖維素酶的產(chǎn)量比用半乳糖作為培養(yǎng)基時要高1500倍以上。如果微生物需要某些代謝阻遏物作為碳源，在工業(yè)生產(chǎn)中則可采用限量流加碳源的辦法，便可減少或避免這種阻遏作用。第28頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)產(chǎn)酶微生物的篩選

動物酶植物微生物微生物易于大量培養(yǎng)，倍增時間短；DNA技術(shù)使微生物生產(chǎn)特殊作用的酶，并大大提高產(chǎn)量；因此，微生物可以說是酶商業(yè)化生產(chǎn)的最佳來源。第29頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1、產(chǎn)酶菌的分布規(guī)律為獲得能夠降解某種物質(zhì)的產(chǎn)酶菌株，一般可以從該物質(zhì)比較豐富的地方尋找。

Exp.豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌；油田和煉油廠周圍土層中常見分解石油的微生物；處理降解合成物質(zhì)的產(chǎn)酶菌則往往能在污水處理處獲得；第30頁,共66頁，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)性能鑒定主要通過初篩和復(fù)篩確定。初篩是從已分離出來的菌種中挑出能產(chǎn)生目標酶的菌株，要求檢出方法快捷、簡便初篩多選用平板培養(yǎng)透明圈法2、菌種生產(chǎn)性能鑒定第31頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細胞外的水解酶1、溶解度——不溶性底物如淀粉、纖維素、酪素、細胞壁等培養(yǎng)基中生長——透明圈大小2、酸堿度——酸堿指示劑——變色圈大小和顏色3、顏色——合成特定底物與酶反應(yīng)變色——變色深淺第33頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共66頁，2024年2月25日，星期天復(fù)篩是在初篩的基礎(chǔ)上篩選產(chǎn)酶量高，性能更符合要求的菌株，要求測定方法準確可靠。復(fù)篩多采用搖瓶培養(yǎng)的方法。將初篩出來的菌種移入三角瓶振蕩培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行分析檢定，找出產(chǎn)酶量最高，性能符合要求的菌株。第35頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)酶的液體深層發(fā)酵法液體深層發(fā)酵是現(xiàn)代普遍采用的方法，主要設(shè)備發(fā)酵罐是一個具有攪拌漿和通氣系統(tǒng)的密閉容器。國內(nèi)多采用10-50t，國外多用100t以上。第36頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共66頁，2024年2月25日，星期天液體發(fā)酵流程圖實驗室種子制備階段（一級種子培養(yǎng)）生產(chǎn)車間種子制備階段（二級種子培養(yǎng)、三級種子培養(yǎng)）二級發(fā)酵三級發(fā)酵沙土孢子冷凍干燥孢子斜面孢子搖瓶液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)一級種子罐二級種子罐發(fā)酵罐第47頁,共66頁，2024年2月25日，星期天空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)滅菌

酶分離純化成品（液體或顆粒）控制t、pH、DO、泡沫、補料等第48頁,共66頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵罐發(fā)酵全過程動畫.exe第49頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）溫度的調(diào)節(jié)控制

Exp.不同的細胞有各自不同的最適生長溫度。如：枯草桿菌最適生長溫度34～37℃，黑曲霉28～32℃，植物細胞25℃左右。第50頁,共66頁，2024年2月25日，星期天溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設(shè)計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。第51頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）pH的變化與控制培養(yǎng)基的pH值與細胞的生長繁殖以及發(fā)酵產(chǎn)酶都有密切關(guān)系。細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值通常接近于該酶反應(yīng)的最適pH值。例如：發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶的最適pH值為堿性(pH8.5～9.0)；而酸性(pH4.0～6.0)條件有利于酸性蛋白酶的產(chǎn)生。

第52頁,共66頁，2024年2月25日，星期天有些細胞可以同時產(chǎn)生多種酶，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。

Exp.黑曲霉可既生產(chǎn)α-淀粉酶，又可生產(chǎn)糖化酶。

pH值中性——α-淀粉酶增加糖化酶減少；

pH值酸性——糖化酶增加α-淀粉酶減少。第53頁,共66頁，2024年2月25日，星期天pH的調(diào)節(jié)可以通過改變培養(yǎng)基的組分或比例來實現(xiàn)，必要時可以使用緩沖溶液，或流加適宜的酸、堿溶液，以調(diào)控培養(yǎng)基的pH變化。第54頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（3）溶解氧的調(diào)節(jié)控制大多數(shù)的產(chǎn)酶菌是好氣菌，調(diào)節(jié)通氣量對產(chǎn)酶意義重大。一般細胞只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧氣——溶解氧。液體發(fā)酵較小的通氣量有助于霉菌的生長，較大的通氣量有助于產(chǎn)酶。第55頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（4）泡沫形成與控制泡沫是如何形成的？通氣,攪拌；發(fā)酵液中含有蛋白質(zhì)、糖和脂肪等.第56頁,共66頁，2024年2月25日，星期天泡沫的危害有哪些大量逃液增加污菌機會使部分菌體黏附在罐蓋或罐壁上失去作用泡沫嚴重時還會影響通氣攪拌的正常進行，防礙菌的呼吸，導(dǎo)致產(chǎn)量下降

第57頁,共66頁，2024年2月25日，星期天機械消泡機械消泡是一種物理作用，它是靠機械強烈振動和壓力的變化，促使氣泡破裂，或借助于機械力將排出氣體中的液體加以分離回收，從而達到消泡的作用。第58頁,共66頁，2024年2月25日，星期天罐內(nèi)消泡——耙式消泡槳第59頁,共66頁，2024年2月25日，星期天化學消泡——消泡劑天然油脂玉米油、米糠油、豆油、棉子油、菜子油和魚油、豬油等。已有逐漸被合成消沫劑取代的趨勢。高碳醇和酯類十八醇第60頁,共66頁，2024年2月25日，星期天聚醚類聚氧丙稀甘油和聚乙烯氧丙稀甘油（泡敵）硅酮類聚二甲基硅氧烷與其衍生物。第61頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（6）空氣滅菌介質(zhì)過濾除菌讓含菌空氣通過過濾介質(zhì)以阻截空氣中所含微生物，而去的無菌空氣的方法，目前工業(yè)除菌幾乎均采用該方法。常用的過