酶工程在生物技術上的應用省公開課金獎全國賽課一等獎微課獲獎

酶在生物技術上應用北京師范大學珠海分校12生物技術2班1/74目錄2酶在去除細胞壁上應用酶在蛋白質測序上應用酶在大分子測序上應用氫化酶在生物制氫上應用2/74Chapter.1酶在除去細胞壁應用過渡頁

TRANSITIONPAGE3/74Chp1植物細胞壁Chp2細菌細胞壁Chp3酵母細胞壁Chp4霉菌細胞壁主要內容

CONTENTSPAGE4/74微生物細胞和植物細胞表層。細胞壁對微生物和植物維持其細胞形態(tài)和結構起著主要作用，可保護細胞免遭外界原因破壞。但在生物工程方面，很多時候都要去除細胞壁。介紹

TRANSITIONPAGE5/74一細胞內物質提?。何⑸锖图毎麅仍S多物質，如胰島素，干擾素等基因工程菌產(chǎn)物天然抗氧劑等植物細胞代謝物等都存在細胞內。為了將這些物質提取出來，很多時候都需要把細胞壁破壞或者除去。介紹

TRANSITIONPAGE二原生質體制備：除去細胞壁后由細胞膜和胞內物質組成微球體成為原生質體。在制備原生質體或者提取一些穩(wěn)定性較差活性物質時候，既要除去細胞壁，又不能損傷其它成份。這么就不能采取激烈破碎方法，而只能利用各種含有專一性酶。6/74去除植物細胞壁細胞壁組分是紡織、造紙、木材、膠片、增稠劑及其它工業(yè)產(chǎn)品主要原料。植物細胞壁生物合成過程是植物生長發(fā)育中最主要合成代謝之一，也是植物光合作用產(chǎn)物主要貯積方式。破除植物細胞壁主要采取纖維素酶，半纖維素酶和果膠酶組成混合酶。這幾個酶大多數(shù)由霉菌發(fā)酵產(chǎn)生。7/74細菌細胞壁由一些化學成份不一樣物質組成，如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖、磷脂、外膜蛋白等，在這些組成成份中對細胞壁生理功效起主要作用是肽聚糖，除少數(shù)細菌如產(chǎn)甲烷細菌這類古細菌細胞壁是由其它化學物質組成外，幾乎全部細菌細胞壁都含有肽聚糖，在G+細菌中肽聚糖含量高達30%～95%，G－細菌也有5%～20%含量。細菌細胞壁

TRANSITIONPAGE8/74細菌細胞壁

TRANSITIONPAGE除去細菌細胞壁是采取從蛋清中分離溶菌酶。9/74細菌細胞壁

TRANSITIONPAGE合成溶菌酶工藝流程圖10/74溶菌酶能專一地作用于細菌細胞壁肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間a-1，4-鍵。而對于革蘭氏陰性菌需要由溶霉菌和EDTA共同作用才能到達很好除去細胞壁效果。這是因為EDTA可作用于脂多糖。細菌細胞壁

TRANSITIONPAGE11/74酵母細胞壁厚度為0.1~0.3μm，重量占細胞干重18%~30%，主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖兩類多糖組成，含有少許蛋白質、脂肪、礦物質。酵母細胞壁去除12/74葡聚糖酶：β-葡聚糖酶（β-1,3-1,4葡聚糖酶）。它是采取BacillusLichenifomis菌株經(jīng)過液態(tài)深層發(fā)酵制得，該酶是一個內切酶，專一作用于β-葡聚糖1,3及1,4糖苷鍵，產(chǎn)生3-5個葡萄糖單位低聚糖及葡萄糖。葡聚糖酶13/74霉菌細胞壁霉菌細胞壁結構比較復雜。不一樣種屬霉菌，其細胞壁組分和結構有較大差異。所以，若要除去霉菌細胞壁，需要搞清屬于什么霉菌，再選取適宜幾個酶共同作用，才能到達很好破壁效果。14/74藻菌綱霉菌半知菌綱霉菌毛酶，根霉等細胞壁主要由幾丁質和殼多糖等各種物質組成。破壁主要采取放線菌或細菌產(chǎn)生克多糖酶和幾丁質以及蛋白酶等各種酶混合物。這些混合多酶試劑普通稱為細胞壁溶解酶。米曲霉，黑曲霉等細胞壁主要由幾丁質，葡聚糖組成。破壁時主要采取幾丁質酶和葡聚糖酶混合物。15/74Chapter.2酶在蛋白質測序上應用——羧肽酶A過渡頁

TRANSITIONPAGE16/74羧肽酶

Carboxypeptidase，CP1、羧肽酶介紹羧肽酶是一個專一性地從肽鏈Ｃ端逐一降解、釋放游離氨基酸一類肽鏈外切酶。依據(jù)反應底物不一樣，可分為A、B、C和Y四類。17/74羧肽酶A18/742、羧肽酶A1、外形緊密，是一個5.0nm×4.2nm×3.8nm橢圓形球體，大約含有38%α螺旋，17%β折疊片；2、分子量約為35kD；3、由307個氨基酸殘基組成；4、等電點為6.0；5、存在于哺乳動物胰臟；6、是一類水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸殘基消化酶。

19/743、羧肽酶A活性中心

精氨酸殘基金屬Zn2+酪氨酸殘基20/743、羧肽酶A活性中心

精氨酸殘基金屬Zn2+酪氨酸殘基21/743、羧肽酶A活性中心

22/744、催化機理羧肽酶催化機制1、促進水解離機制2、Glu-270親和機制23/7424/7425/745、鋅離子作用1、被裂解肽鍵羰基指向鋅離子，鋅離子起吸電子作用，使C=O鍵比正常更為極化，使羰基C原子更易接收親核進攻；2、鋅離子處于非極性環(huán)境促進了誘導偶極子產(chǎn)生，增加了它有效電荷；3、Glu270負電荷迫近也對羰基上產(chǎn)生一個大偶極子做出了貢獻。

26/7427/74Chapter.3過渡頁

TRANSITIONPAGE酶在大分子切割和拼接方面應用——以自我剪切酶和自我剪接酶為例28/74Chp1知識概述1.3酶在大分子切割和拼接方面應用——以自我剪切酶和自我剪接酶為例核酶自我剪切酶自我剪接酶應用Part1Part2Part3Part429/74Chapter.1核酶過渡頁

TRANSITIONPAGE30/7420世紀30年代酶定義：酶是一類含有生物催化作用蛋白質。31/741982年Cech等發(fā)覺四膜蟲細胞大核期間26SrRNA前體含有自我剪接功效，并于1986年證實其內含子L-19IVS含有各種催化功效。1984年Altman等發(fā)覺RNaseP核酸組分M1RNA含有該酶活性，而該酶蛋白質部分C5蛋白并無酶活性。Cech和Altman因發(fā)覺Ribozyme而取得1989年度諾貝爾化學獎。切赫ThomasRobertCech32/74為何RNA有這種功效？凡是含有催化功效分子，大多與其構象相關它會折疊成一定構型，并可辨識其所要切開序列，其反應也需要金屬離子幫助，都很像是酶行為。DNA是雙股核酸，而且其分子量非常巨大，所以無法自由卷繞成特定構象，都只是形成長長雙螺旋結構。33/74至于RNA分子結構，就其化學組成上看，也是由四種核苷酸組成多聚體。它與DNA不一樣，首先在于以U代替了T，其次是用核糖代替了脫氧核糖，另外，還有一個主要不一樣點，就是絕大部分RNA以單鏈形式存在，但能夠折疊起來形成若干雙鏈區(qū)域。在這些區(qū)域內，凡互補堿基對間能夠形成氫鍵(圖)。但有一些以RNA為遺傳物質動物病毒含有雙鏈RNA。34/74RNA分子因為是單股核酸，且其分子通常不會很長，所以能夠卷繞成一定分子構象，可能因而含有催化能力；此種含有催化力RNA，統(tǒng)稱之為核酶。核酶是唯一非蛋白酶。它是一類特殊RNA，能夠催化RNA分子中磷酸酯水解及其逆反應。35/74

核酶剪切型核酶剪接型核酶依據(jù)催化反應錘頭核酶I內含子II內含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP36/74Chapter.2自我剪切酶過渡頁

TRANSITIONPAGE37/74T.R.Cech

1981年，ThomasCech和他同事在研究原生動物嗜熱四膜蟲26srRNA基因中有一段內含子，該基因轉錄產(chǎn)物——前體rRNA中對應于這段內含子核苷酸次序是一個有413個核苷酸居間序列(IVS)。在前體rRNA加工過程中去除基因內含子時這個IVS可自我催化除去,并最終使5’→外顯子與3’→外顯子連接成成熟rRNA分子38/74由此取得一個驚奇發(fā)覺∶內含子切除反應發(fā)生在僅含有核苷酸和純化26SrRNA前體而不含有任何蛋白質催化劑溶液中，可能解釋只能是:內含子切除是由26SrRNA前體本身催化，而不是蛋白質。

結論：IVS含有類似蛋白酶功效，能夠打斷及重建磷酸二脂鍵。39/74

為了證實剪接過程中，確實沒有蛋白質參加，切赫用重組DNA技術得到四膜蟲rRNA基因中413bP連同兩側DNA克隆片段，將其離體DNA克隆到細菌中而且在無細胞系統(tǒng)中轉錄成26SrRNA前體分子，再進行SDS-酚抽提，以確保轉錄產(chǎn)物前體rRNA不與酶蛋白結合，在電泳圖譜上可看到環(huán)狀IVS，線狀IVS和缺失15個核苷酸線狀物3條譜帶，結合其它一些試驗結果，能夠充分必定前體rRNA可在非酶蛋白質存在條件下進行自我剪接。

思索：為何有這么試驗結果？40/74

前體RNA生物剛開始轉錄出來RNA是不成熟,能夠稱為前體RNA。對于原核生物，當前體RNA經(jīng)過加工,

mRNA由RNA聚合酶合成后，將里面內含子轉錄部分切掉。這么才能形成有功效mRNA，然后從細胞核中出來。Clickme41/74剪切型核酶特點：這類核酶作用是只剪不接，催化本身RNA或不一樣RNA分子，切下特異核苷酸序列。類型：自體催化剪切型：RNA前體異體催化剪切型書本28342/74剪切機制轉酯化過程：由靠近位點3‘端2’OH或氧原子對切割位點磷原子實施親核攻擊，產(chǎn)生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯。43/74

一、錘頭型核酶a中N,N’代表任意核苷酸；X能夠是A、U或者C,但不能是G；I、II和III是錘頭結構中雙螺旋區(qū)；箭頭指向切割位點。b是錘頭型核酶立體結構模型，白色鏈是核酶，灰色鏈是底物RNA分子，在磷酸骨架上結合有鎂離子PS:書本15144/74二、發(fā)夾型核酶50個堿基核酶和14個堿基底物形成了發(fā)夾狀二級結構，包含4個螺旋和5個突環(huán)。螺旋3和4在核酶內部形成，螺旋1(6堿基對)和2(4堿基對)由核酶與底物共同形成，實現(xiàn)了酶與底物結合。核酶識別次序是NGUC，其中N代表任何一個核苷酸，這個次序位于螺旋1和2之間底物RNA鏈上，切割反應發(fā)生在N和G之間。45/74剪接型核酶自我剪接酶是在一定條件下催化本身RNA分子同時進行剪切和連接反應R酶。類型：I類內含子（IVS）自我剪接Ⅱ類內含子自我剪接PS：書本28546/74

一、I類內含子I型IVS是與四膜蟲26srRNA前體IVS結構相同間隔序列，含有環(huán)狀結構。經(jīng)過轉磷酸酯反應，生成成熟26srRNA及G-IVS.G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過程需要鳥苷酸或鳥苷以及鎂離子參加。剪接機制47/7448/7449/74ClickmePS：書本14750/7451/74

二、Ⅱ類內含子Ⅱ型IVS是與細胞核mRNA前體IVS結構相同間隔序列。經(jīng)過轉磷酸酯反應，生成成熟RNA及套環(huán)狀IVS。催化剪接反應不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。

剪接機制52/7453/7454/74

類型Ⅰ自我拼接內含子分布很廣，存在于真核生物細胞器基因，低等真核生物核rRNA基因，細菌和噬菌體個別基因中。類型Ⅱ內含子只見于一些真菌線粒體和植物葉綠體基因。55/74利用核酶進行基因工作治療策略包含5個步驟即:1)選擇適當核酶及其載體;2)核酶與載體連接并轉導細胞;3)核酶轉錄,在細胞內不停產(chǎn)生大量核酶分子;4)核酶經(jīng)過共有序列識別與異常基因轉錄產(chǎn)物結合;5)異常產(chǎn)物被核酶剪切并被RNase降解,核酶循環(huán)利用。1醫(yī)學應用核酶作為基因工程藥品含有兩個顯著優(yōu)點:1)核酶本質是RNA,其引發(fā)免疫應答可能性比外源蛋白小得多;2)普通核酶分子比較小,易于操作。56/74基因突變有時會在內含子中生成新剪接點，當然也是異常剪接點。它們與左鄰右舍原來不起作用隱匿剪接點搭配起來，就會形成錯誤剪接。因為原有正常剪接點并未喪失功效，只是作用被異常剪接抑制，所以用反義核酸經(jīng)過堿基互補，封閉異常剪接點或其它剪接元件，就可堵住異常剪接路徑，迫使剪接系統(tǒng)選擇正確路徑，形成正常RNA。這就間接地對RNA缺點作了“修復”?；謴驼＜艚勇窂?7/74防治動、植物病毒侵害：構建錘頭型核酶對煙草花葉病毒(TMV)RNA片段進行體外剪切,馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒負鏈多價核酶構建，馬鈴薯卷葉病毒復制酶基因負鏈突變核酶克隆等。2植物病毒防治應用58/74Chapter.4氫化酶在生物制氫中應用過渡頁

TRANSITIONPAGE59/744.1氫化酶是什么？1931年科學家將微生物體內能夠分解甲酸產(chǎn)生氫氣物質稱為氫化酶，廣泛存在于原核生物及低等真核生物體內。氫化酶（英語；Hydrogenase）也稱氫酶，是一個能夠可逆地催化氫氣氧化還原酶，以下方程式：

（1）H2

+Aox

→2H+

+Ared（2）2H++Dred

→H2

+Dox60/744.1

氫化酶分類氫化酶分類。鎳鐵類雙鐵類單鐵類雙鐵類氫化酶產(chǎn)氫活性最高，是其它二者10~100倍，{NIFE）類氫化酶在自然界中含量最豐富，人們對其研究最廣泛最深入。61/74氫化酶產(chǎn)生菌氫化酶產(chǎn)生菌綠藻渾球紅細菌巴氏桿菌脫硫弧菌62/74氫化酶應用1自從1939年Gaffron發(fā)覺綠藻含有產(chǎn)氫功效以來，生物制氫技術逐步受到植物界、微生物界、能源界以及相關專業(yè)研究人員廣泛關注，人們在發(fā)酵原料、發(fā)酵條件、發(fā)酵動力學、產(chǎn)氫機制等方面做了大量研究。生物制氫以其原料起源豐富、價格低廉、低能耗、反應條件溫和等特點，是當前研究最快，并有望進行規(guī)?；a(chǎn)一個制氫方法。生物制氫63/74氫化酶應用2生物制氫依據(jù)所選取微生物、產(chǎn)氫底物及其產(chǎn)氫機理，生物制氫能夠分為藍細菌和綠藻制氫、光合細菌制氫和厭氧發(fā)酵制氫等3種類型。其中厭氧發(fā)酵制氫采取是產(chǎn)氫菌厭氧發(fā)酵，它優(yōu)點是產(chǎn)氫速度快，反應器設計簡單，且能夠利用可再生資源和廢棄有機物進行生產(chǎn)，相對于其它兩種方法更輕易在短期內實現(xiàn)。64/74綠藻制氫厭氧發(fā)酵制氫And厭氧細菌在黑暗、厭氧條件下分解有機物產(chǎn)生氫氣，通常稱為厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫或黑暗（暗）發(fā)酵產(chǎn)氫。當前，綠藻產(chǎn)氫代謝路徑主要能夠分為直接生物光解路徑和間接生物光解路徑。氫化酶應用65/744.3生物制氫厭氧發(fā)酵制氫厭氧發(fā)酵底物利用范圍很廣泛(包含垃圾、廢品),能更有效地制氫。另外,發(fā)酵制氫通常有較高收益率且不依賴光源碳水化合物主要是葡萄糖，是發(fā)酵過程首選碳源,主要產(chǎn)生乙酸、丁酸與氫氣,詳細反應如式(1)、式(2)。C6H12O6+2H2O—2CH3COOH+2CO2+4H2

（1）C6H12O6+2H2O—CH3CH2COOH

+

2CO2

+

2H2

（2）66/74產(chǎn)氫細菌直接產(chǎn)氫過程均發(fā)生于丙酮酸脫羧作用中，其中兩方式。一為梭狀芽孢桿菌型。二是腸道桿菌型該過程中丙酮酸脫羧后形成甲酸，然后甲酸全部或部分裂解轉化為

H2

和

CO2。厭氧發(fā)酵制氫67/74依據(jù)氫酶催化特征，氫酶能夠分為吸氫酶、放氫酶和雙向氫酶三

類。放氫酶主要表現(xiàn)為催化產(chǎn)氫反應吸氫酶主要表現(xiàn)催化吸氫反應雙向氫酶表現(xiàn)出催化性質則依氫酶所處環(huán)境而定，既能催化吸氫反應又能催化放氫反應。當前已經(jīng)有許多學者經(jīng)過基因改造氫酶來提升生物制氫產(chǎn)量。68/74在直接生物光解路徑中，綠藻經(jīng)過捕捉太陽光，利用光能經(jīng)由光合反應將水分子光解，取得低電位還原力，并最終還原Fe氫化酶釋放出氫氣（圖1）綠藻制氫69/74間接生物光解路徑能夠分為兩個階段，在第一個階段中，綠藻細胞在有氧條件下經(jīng)過光合作用固定二氧化碳，合成細胞物質。而在第二個階段中，在無氧條件下，這些細胞物質會經(jīng)過酵解產(chǎn)生還原力，用于Fe氫化酶還原和氫氣釋放（圖2）綠藻制氫70/74世界首例生物制氫生產(chǎn)線在我國開啟71/74[1]黃國榮,朱俊東,糜漫天,郎海濱.啤酒酵母多糖提取工藝研究[J].第三軍醫(yī)大學學報.(06).[2]張玉香,尹卓容.甘露糖蛋白提純及分子量測定[J].釀酒科技.(04)[3]劉景圣,蔡丹,孫濤.嗜酸乳桿菌細胞壁肽聚糖分離提取[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報.(04).[4]溫曉慶,托婭,段智變,張和平.Lb.casei.Zhang肽聚糖體內外抗腫瘤作用[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版).(03).[5]李剛,徐芳杰,蔣思絲,章永松,林咸永.鋁對小麥根尖細胞壁過氧化物酶活性和過氧化氫含量影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學報.(04).[6]吳靜,閔柔,鄔敏辰等.羧肽酶研究進展[J].食品與生物技術報.,31(8):793-799[7]孫楊,陳穎潔.肥大細胞羧肽酶A研究進展[J].科技信息.:500-501.[8]高彥飛,王飛霞.蛋白質及多肽C端測序研究進展[J].分析化學.,35(12):1820-1826.參考文件72/74[9]王鏡巖，朱圣庚等.生物化學第三版下冊[J]